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Artigo de método

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

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DOI:

10.3791/54329

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20 de agosto de 2016

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1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

Neste artigo

Resumo

A cultura primária de células endoteliais da córnea de bovino foi utilizada para investigar o mecanismo de transição endotelial-mesenquimais da córnea. Além disso, um modelo criolesão endotélio corneano de rato foi utilizado para demonstrar transição endotelial-mesenquimais da córnea in vivo.

Resumo

As células endoteliais da córnea (CECs) desempenham um papel crucial na manutenção da clareza da córnea por meio do bombeamento ativo. Uma contagem reduzida de CEC pode levar a edema da córnea e diminuição da acuidade visual. No entanto, os CECs humanos são propensos a comprometer o potencial proliferativo. Além disso, a estimulação do crescimento celular é frequentemente complicada pela transição endotelial-mesenquimal gradual (EnMT). Portanto, entender o mecanismo da EnMT é necessário para facilitar a regeneração de CECs com função competente. Neste estudo, preparamos uma cultura primária de CECs bovinas descascando as CECs com membrana de Descemet do botão corneano e demonstramos que as CECs bovinas exibiram o processo EnMT, incluindo alteração fenotípica, translocação nuclear de β-catenina e reguladores EMT caracol e lesma, na cultura in vitro. Além disso, usamos um modelo de criolesão de endotélio de córnea de rato para demonstrar o processo EnMT in vivo. Coletivamente, a cultura primária in vitro de CECs bovinos e modelos de criolesão de endotélio corneano de rato in vivo oferece plataformas úteis para investigar o mecanismo de EnMT.

Introdução

As células endoteliais da córnea (CECs) desempenham um papel vital na manutenção da clareza da córnea e, portanto, da acuidade visual, regulando o estado de hidratação do estroma da córnea por meio do bombeamento ativo1. Devido ao potencial proliferativo limitado das CECs humanas, o número de células diminui com a idade, e o reparo de feridas endoteliais da córnea após lesão geralmente é alcançado por meio de aumento e migração celular, em vez de mitose celular2. Quando a contagem de CEC diminui abaixo de um limite de aproximadamente 500 células/mm2, o estado de desidratação do estroma corneano não pode ser mantido, levando a ceratopatia bolhosa e deficiência visual3,4.

O potencial proliferativo limitado das CECs humanas tem sido atribuído a vários fatores, incluindo expressão reduzida do fator de crescimento epidérmico e seu receptor em células envelhecidas5, TGFβ2 antiproliferativo no humor aquoso6 e inibição de contato2,7. Embora alguns fatores de crescimento, como o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), possam aumentar a proliferação em um endotélio corneano humano cultivado, a eficiência da cultura permanece limitada8,9. Além disso, os CCEs podem sofrer uma alteração fenotípica durante a expansão ex vivo, assemelhando-se à transição epitelial-mesenquimal (EMT)10-13. A transição endotelial-mesenquimal (EnMT) é caracterizada por desestabilização da junção celular, perda de polaridade apical-basal, rearranjo do citoesqueleto, expressão de actina de músculo liso alfa e secreção de colágeno tipo I14. Todas essas características podem anular a função normal dos CCEs, dificultando o uso de CCEs cultivados ex vivo na engenharia de tecidos. Além disso, a EnMT tem sido associada à patogênese de várias doenças endoteliais da córnea, incluindo distrofia endotelial da córnea de Fuchs e formação de membrana retrocorneana15,16. Portanto, entender o mecanismo da EnMT pode ajudar a manipular o processo da EnMT e facilitar a regeneração dos CECs para permitir a função competente.

Neste estudo, descrevemos um método para isolar CECs bovinos do botão da córnea. Na cultura primária in vitro, foi observado o processo EnMT, incluindo uma alteração fenotípica, a translocação nuclear de β-catenina e os reguladores EMT caracol e lesma. Descrevemos ainda um método para demonstrar EnMT in vivo usando um modelo de criolesão de endotélio de córnea de rato. Usando esses 2 modelos, demonstramos que o marimastat, um inibidor da metaloproteinase da matriz de amplo espectro (MMP), pode suprimir o processo EnMT. Os protocolos descritos facilitam a análise detalhada do mecanismo EnMT e o desenvolvimento de estratégias para manipular o processo EnMT para posterior aplicação clínica.

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Protocolo

Todos os procedimentos seguidos neste estudo concedidas com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do National Taiwan University Hospital.

1. Isolamento, cultura Preparação Primária e imunocoloração de Bovinos PEC

  1. Adquirir olhos bovinos frescas de um matadouro local.
  2. Desinfectar os olhos em um 10% w / v solução de povidona-iodo durante 3 min. Lavá-las com uma solução tamponada de fosfato salino (PBS).
  3. Colheita do botão da córnea com um bisturi e tesouras sob condições estéreis. membrana de Descemet Descasque a com uma pinça sob um microscópio de dissecação (notar que, neste estudo, os olhos foram enucleados bovina por um matadouro local, portanto, o primeiro procedimento de pesquisa foi a desinfecção dos olhos preenucleated no laboratório).
  4. Incubar a membrana de Descemet, em 1 ml de tentativapsin a 37 ° C durante 30 min. Recolher os CECs bovinos por centrifugação a 112 xg por 5 min. Ressuspender as células em 1 ml de meio suplementado epitelial hormonal (SHEM) contendo volumes iguais de meio de HEPES-tamponizada de Dulbecco modificado por Eagle e meio F12 de Ham, suplementado com 5% de soro fetal bovino, 0,5% de sulfóxido de dimetilo, 2 ng / ml de epidérmico humano factor de crescimento, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / ml de selénio, 1 nmol / l de toxina de cólera, 50 mg / ml de gentamicina e 1,25 mg / ml de anfotericina B.
  5. Semear as células (cerca de 1 x 10 5 células por olho) em um disco de 6 cm. Cultura-los no Sem. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 em ar. Mudar o meio de cultura a cada 3 dias.
  6. Quando as células atingem a confluência, lavá-las em PBS e incubar em 1 ml de tripsina a 37 ° C durante 5 min. Recolhe-los por centrifugação a 112 xg durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células em 1 ml de SHEM.
    1. Contar as células num hemocitómetro. Semear as células sobre lâminas de cobertura a uma densidade de 1 x 10 4 por poço numa placa de 24 poços, e as células de cultura na SHEM. Para investigar o efeito de suprimir EnMT-marimastat, incubar as células em SHEM com 10 uM de marimastat adicionado para o meio de cultura, e mudar o meio de cultura a cada 3 dias.
  7. Fixar as células em um ponto de tempo indicado com 250 uL de paraformaldeído a 4%, pH 7,4, durante 30 min à temperatura ambiente. Permeabilizar com 250 ul de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min. Bloco com 10% de albumina de soro de bovino durante 30 min.
  8. Incubam-se as células com anticorpos primários contra activo beta-catenina (ABC), caracol, e lesma durante a noite a 4 ° C. A diluição dos anticorpos primários utilizados é de 1: 200. Os anticorpos são diluídos em diluente de anticorpo composta de PBS 10 mM, 1% w / v de albumina de soro de bovino, e 0,09% w / v de azida de sódio.
  9. Lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min, e incuba-se am, com o anticorpo conjugado com Alexa Fluor-secundário (1: 100 em diluente de anticorpo) à temperatura ambiente durante 1 h.
  10. Contracoloração o núcleo da célula, cobrindo as células com 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole, lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min, e montá-los com anti-desvanecimento solução de montagem.
  11. Obter imagens de imunofluorescência nos comprimentos de onda de excitação de 405 e 488 nm usando um microscópio confocal de varredura a laser, com ampliação de 20x objetiva.

2. Rat Corneal endotélio criolesão modelo e injeção intracamerais

  1. Anestesiar ratos machos 12 semanas de idade, Sprague-Dawley machos com injecções intramusculares de 2% de xilazina (5,6 mg / kg) e mais tiletamina zolazepam (18 mg / kg). Suavemente comprimir a pele dos animais para confirmar a anestesia adequada na ausência de espasmos pele.
  2. Instilar uma gota de cloridrato de proparacaína 0,5% no olho direito de cada rato para minimizar a dor dos olhos e do reflexo de piscar. instilarpomada de tetraciclina para o olho esquerdo para evitar o ressecamento da córnea.
  3. Arrefece-se uma sonda de aço inoxidável (diâmetro = 3 mm) em azoto líquido. Aplicar a sonda de aço inoxidável para o centro da córnea do olho direito durante 30 seg. incutir frequentes PBS para o olho direito durante o procedimento para prevenir o ressecamento da córnea.
  4. Instilar 0,1% atropina e 0,3% de sulfato de gentamicina imediatamente após criolesão e uma vez ao dia para aliviar a dor ocular resultante de espasmo ciliar e para prevenir a infecção.
    1. Após o procedimento, manter os ratos aquecer usando uma lâmpada de calor, e observar a sua recuperação a cada 15 minutos após a anestesia até que recuperar o controle motor. Além disso, aplique pomada de tetraciclina para o olho direito de prevenir o ressecamento da córnea durante o período de recuperação.
  5. Repita o criolesão córnea durante 3 dias consecutivos.
  6. Para entregar o marimastat ou de bFGF na câmara anterior dos olhos de ratos, anestesiar os ratos, tal como descrito anteriormente. Instilar uma gotade 0,5% de cloridrato proparacaína no olho direito para minimizar a dor dos olhos e do reflexo de piscar.
  7. Irrigar a superfície ocular com PBS estéril. Realizar paracentese da câmara anterior sob um microscópio de operação através da inserção de uma agulha de 30 G ligada a uma seringa de 1 ml na córnea clara paralimbal num plano acima e paralelo ao da íris.
  8. Rode a agulha de bisel para cima, e ligeiramente deprimir o ferimento da córnea para drenar um pouco de humor aquoso e reduzir a pressão intra-ocular. Injectar 0,02 ml da droga intracamerally. Gentilmente comprimir o trato agulha com uma ponta de algodão durante a retirada da agulha.
  9. Fotografar a parte externa do olho em um ponto de tempo indicado sob o microscópio cirúrgico.

3. Colheita do Rato Botão de córnea e imunocoloração

  1. A eutanásia os ratos, coloque-os em uma câmara de eutanásia e infundir 100% de CO2 a uma taxa de preenchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto. Manter CO 2 para uma infusãominuto adicional após a falta de respiração e cor dos olhos desapareceu.
  2. Penetrar no olho do rato no limbo com uma lâmina afiada. Corte as córneas com uma tesoura ao longo da córnea do limbo. Achate as córneas em um slide. Fazer incisões radiais adicionais se as córneas enrolar.
  3. Fixar as córneas com 250 uL de paraformaldeído a 4%, pH 7,4, durante 30 min à temperatura ambiente. Permeabilizar com 250 ul de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min, e bloquear com 10% de albumina de soro de bovino durante 30 min.
  4. Incubar as córneas com anticorpos primários contra ABC durante a noite a 4 ° C com uma diluição de 1: 200 em diluente de anticorpo. Lavam-se as córneas, duas vezes com PBS durante 15 min, e incubar com o anticorpo secundário (1: 100 em diluente de anticorpo) à temperatura ambiente durante 1 h. Contracoloração o núcleo da célula, cobrindo as células com 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole, e lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min.
  5. Monte as córneas em anti-fading solução de montagem. obtain as imagens de imunofluorescência em comprimentos de onda de excitação de 405 e 561 nm com um microscópio confocal de varredura a laser com ampliação de 20x objetiva.

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Resultados

Após o isolamento de PEC bovina, as células foram cultivadas in vitro. A Figura 1 apresenta as imagens de contraste de fase do PEC bovina. A forma hexagonal das células em confluência indicaram que as células não foram contaminadas pelos fibroblastos do estroma da córnea durante o isolamento de células. A Figura 2 mostra a imunocoloração que foi realizada utilizando anticorpos contra ABC, caracol, e lesma em um ponto de tempo indicado. Para além...

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Discussão

PEC são conhecidos pela sua propensão para sofrer EnMT durante a proliferação celular. Para desenvolver estratégias para suprimir o processo EnMT para fins terapêuticos, uma profunda compreensão do mecanismo EnMT é necessário. Nós descrevemos 2 modelos para investigar EnMT, ou seja, a CEC bovina em modelo de cultura in vitro e rato modelo criolesão endotélio corneano. Os nossos resultados demonstram o processo EnMT em ambos os modelos. Além disso, o efeito de supressão de EnMT marimastat foi reproduzid...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos à equipe do Segundo Laboratório Principal, Departamento de Pesquisa Médica, Hospital Universitário Nacional de Taiwan por seu apoio técnico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
tripsinaThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco' s meio Eagle modificado e meio Ham's F12ThermoFisher Scientific11330
soro fetal bovinoThermoFisher Scientific26140-079
dimetilsulfóxido SigmaD2650
crescimento epidérmico humanoThermoFisher ScientificPHG0311
insulina, transferrina, selênio ThermoFisher Scientific41400-045
toxina da cóleraSigmaC8052-1MG
gentamicinaThermoFisher Scientific15750-060
anfotericina BThermoFisher Scientific15290-026
paraformaldeídoMicroscopia EletrônicaCiências 111219
Triton X-100SigmaT8787 
albumina de soro bovinoSigmaA7906
marimastatSigmaM2699-25MG
anticorpo anti-catenina beta-ativaMillpore05-665
anticorpo anti-caracolSanta cruzsc28199
anticorpo anti-lesmaSanta cruzsc15391
cabra anti-rato IgG (H+L) secundário anticorpoThermoFisher ScientificA-11001para coloração de ABC de CECs bovinos
cabra anti-camundongo IgG (H + L) anticorpo secundárioThermoFisher ScientificA-11003para coloração de ABC de endotélio de córnea
de rato cabra anticorpo secundário IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-11008para coloração de caracol e lesma de CECs bovinos
diluente de anticorposGenemed Biotechnologies10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindoleThermoFisher ScientificD1306
meio de montagemVector LaboratoriesH-1000
microscópio confocal de varredura a laserZEISSLSM510
xilazina BayerN/A
tiletamina mais zolazepamVirbacN/Amedicamento veterinário
cloridrato de proparacaína solução oftálmicaAlconN/Amedicamento veterinário
0,1% atropinaWu-Fu Laboratories Co., LtdN/Amedicamento clínico 
Sulfato de gentamicina a 0,3%Sinphar GrupoN/Amedicamento clínico 
fator básico de crescimento de fibroblastosThermoFisher ScientificPHG0024medicamento clínico 
fator de de cabra

Referências

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