Um protocolo para a preparação e caracterização de doxorrubicina lipofílico pró-fármaco carregado 1,2-distearoyl--sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG) micelas é descrito.
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Artigo de método
Preparação e caracterização de Lipofílica Doxorrubicina micelas Pro-drogas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As micelas têm sido usadas com sucesso para a administração de medicamentos anticâncer. Os polímeros anfifílicos formam micelas estruturadas em núcleo-casca em um ambiente aquoso por meio de automontagem. O núcleo hidrofóbico das micelas funciona como um reservatório de drogas e encapsula drogas hidrofóbicas. A casca hidrofílica impede a agregação de micelas e também prolonga sua circulação sistêmica in vivo. Neste protocolo, descrevemos um método para sintetizar um pró-fármaco lipofílico de doxorrubicina, o ácido palmítico doxorrubicina (DOX-PA), que aumentará a carga do fármaco nas micelas. Um ligante de hidrazona sensível ao pH foi usado para conjugar a doxorrubicina com o lipídio, o que facilita a liberação de doxorrubicina livre dentro das células cancerígenas. O DOX-PA sintetizado foi purificado com uma coluna de sílica gel usando diclorometano/metanol como eluente. O DOX-PA purificado foi analisado com cromatografia em camada delgada (TLC) e 1espectroscopia de ressonância magnética nuclear H (1H-RMN). Um método de dispersão de filme foi usado para preparar micelas DSPE-PEG carregadas com DOX-PA. Além disso, vários métodos para caracterizar formulações de micelas são descritos, incluindo determinação da concentração de DOX-PA e eficiência de encapsulação, medição do tamanho e distribuição de partículas e avaliação de atividades anticancerígenas in vitro. Este protocolo fornece informações úteis sobre a preparação e caracterização de micelas carregadas de drogas e, portanto, facilitará a pesquisa e o desenvolvimento de novos nanomedicamentos contra o câncer à base de micelas.
Introdução
A quimioterapia é utilizada para tratar várias formas de cancro. A maioria, se não todos, os fármacos de quimioterapia têm efeitos secundários tóxicos que podem variar de pequenas condições controláveis, tais como náusea e diarreia, condições que ameaçam a vida mais. Uma vez que a maioria dos fármacos anti-cancerígenos são tóxicos, não-exposição selectiva destes fármacos ao tecido normal, inevitavelmente, provoca toxicidade. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de uma abordagem terapêutica que possa entregar drogas selectivamente em células cancerosas. Um outro desafio com a administração de fármacos anti-cancro é a sua fraca solubilidade em água. Normalmen....
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Protocolo
1. Síntese de DOX-PA
- Pesar 390 mg de doxorrubicina e 243 mg de hidrazida de ácido palmítico, e transferir para um balão de fundo redondo.
- Adicionar 150 ml de metanol anidro para o balão com uma seringa de vidro. Adicionar 39 ul de ácido trifluoroacético (TFA), com uma pipeta. Usando um agitador magnético, agita-se a mistura de reacção durante 18 horas à temperatura ambiente no escuro.
NOTA: As quantidades de materiais de reacção podem ser ampliados ou reduzidos para se obter diferentes quantidades de DOX-PA. A proporção dos reagentes deve ser mantida nas mesmas proporções. As reacções que utilizam quantidades de DOX na gam....
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Resultados
A Figura 1 mostra o esquema de síntese de DOX-PA. DOX-PA foi sintetizada por conjugação de ácido palmítico com doxorrubicina através de uma ligação de hidrazona sensível a pH. Um ligeiro excesso de hidrazida de ácido palmítico foi usada para facilitar a finalização da reacção. Este método de reacção tem uma eficiência muito elevada e apenas uma pequena quantidade de doxorubicina permaneceu após uma reacção de 18 h (Figura 2). O rendimento foi de aproxima.......
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Discussão
Neste trabalho, nós descrevemos, um método de filme rápida dispersão simples para a preparação de micelas. Este método utiliza as propriedades de auto-montagem de um polímero anfifílico (por exemplo, DSPE-PEG) para formar micelas com núcleo e camadas estruturadas num ambiente aquoso. Este método de preparação de micelas tem várias vantagens. 1. Trata-se de um processo de formulação simples, o que evita a utilização de passos de redução de tamanho (complicados, tais como extrusão ou homogeneização) vulgarmente u.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: bolsa NIH-SC3, bolsa NSF-PREM, bolsa de pesquisa do corpo docente da Universidade de Hampton. Gostaríamos de agradecer à Sra. Michele A. Cochran, do Instituto de Ciências Marinhas da Virgínia (VIMS), pelo uso do analisador de tamanho de partículas. Também gostaríamos de agradecer à Sra. Corinne R. Ramaley pela revisão do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorrubicina | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Hidrazida de Ácido Palmítico | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Metanol | ACROS Organics | 610981000 | Anidro |
| FISHER | D151-4 | 99.90% | |
| Metil sulfóxido-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | Solvente NMR |
| Ácido Trifluoroacético | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Sílica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| Baker Flex TLC Plates | FISHER | ||
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Células de Câncer de Próstata | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Médio | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiótico-Antimicótico | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | solução estoque 100x |
| Soro Fetal Bovino | LIFE TECHNOLOGIES | ||
| Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Bü chi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Evaporador rotativo |
| Banho Ultrassônico | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | ||
| espectrômetro UV-VIS Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Analisador de Tamanho de Partículas | da Malvern Instruments | |
| Rio-Rad | Benchmark Plus | ||
| Incubadora de Cultura | de Células Napco | CO2 6000 | |
| Gabinete de Segurança Biológica | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Software Analítico | |
| Placa de Cultura de Células de 96 Poços | Becton Dickinson | 353072 | |
| Tripsina 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
Referências
- Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
- Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
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Reimpressões e permissões
