Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Resumo

Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para realizar co-cultura de longo prazo de multi-espécies microbioma intestinal humana com vilosidades intestinais microengineered em um dispositivo microphysiological gut-on-a-chip humano. Nós recapitular a interface tecido intestinal lúmen capilar num dispositivo de microfluidos, onde as deformações mecânicas e fisiológicas fluxo de cisalhamento de fluidos são constantemente aplicada para imitar o peristaltismo. No microcanal lúmen, epiteliais intestinais células Caco-2 humanos são cultivados de modo a formar um epitélio das vilosidades 'livre de germes' e regenerar pequenas vilosidades intestinais. células microbianas cultivadas são pré-inoculado para o lado do lúmen para estabelecer um ecossistema hospedeira-micróbio. Depois de células microbianas aderir à superfície apical das vilosidades, fluxo de fluido e deformações mecânicas são retomadas a produzir um micro-ambiente de estado estacionário na qual meio de cultura fresco é continuamente fornecido e bactérias não ligadas (bem como resíduos bacterianas) são continuamente removidos. Após prolongado co-cultura fdias ROM para semanas, múltiplos microcolônias são encontrados para ser localizado de forma aleatória entre as vilosidades, e tanto as células epiteliais microbiana e permanecer viável e funcional durante pelo menos uma semana de cultura. Nosso protocolo de co-cultura pode ser adaptado para proporcionar uma plataforma versátil para outros ecossistemas hospedeiras-microbiota que pode ser encontrado em vários órgãos humanos, o que pode facilitar o estudo in vitro do papel da microbiota humana na orquestração de saúde e na doença.

Introdução

O intestino humano abriga uma matriz surpreendentemente diversificado de espécies microbianas (<1.000 espécies) e um número enorme de células microbianas (10 vezes mais do que as células hospedeiras humanas) e genes (100 vezes mais do que o genoma humano) ^1. Estes microbiomas humanos desempenham um papel fundamental no metabolismo de nutrientes e xenobióticos, regulação das respostas imunitárias, e a manutenção da homeostase intestinal ^2. Não é de surpreender, tendo em conta estas diversas funções, o microbioma intestinal comensal extensivamente modula saúde e da doença ^3. Assim, a compreensão do papel das interações microbioma intest....

Protocolo

1. A microfabricação de um dispositivo Gut-on-a-chip

Nota: A a-chip intestino-em-um dispositivo de microfluidos feita por polímero de silicone transparente, permeável ao gás (polidimetilsiloxano, PDMS), contendo dois microcanais paralelas (1 mm de comprimento x largura de 150 um de altura x 1 cm), separadas por uma flexível porosa (10 um de diâmetro de poro, 25 um de poro no espaçamento de poro) PDMS membrana de ^5,9. Fabricar o gut-on-a-chip (Figura 1A, esquerda), seguindo os passos indicados.

1. Microfabricação Processo do ^5,9 Gut-on-a-chip.
   1. Prepare PDMS não curado, desgaseificada p....

Resultados

Para emular o ecossistema hospedeira-microbiota intestinal humano in vitro, que é necessário desenvolver um protocolo experimental para reconstituir a co-cultura estável a longo prazo das bactérias intestinais e as células epiteliais intestinais humanas sob condições fisiológicas, tais como peristalse mecânica semelhante e fluxo de fluido. Aqui, nós utilizamos um microdispositivo biomimético gut-on-a-chip (Figura 1A) para co-cultura de célu.......

Discussão

Compreender as interacções hospedeiro-microbioma é fundamental para o avanço da medicina; No entanto, os modelos de cultura de células tradicional realizados numa placa de plástico ou de uma placa de estática não suportam a co-cultura estável de células intestinais humanas com micróbios intestinais viver durante mais de 1-2 dias na maior parte porque as células microbianas cobrir as células de mamíferos in vitro. A população microbiana overgrowing rapidamente consome oxigénio e nutrientes, produzindo subsequent.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 25 mM de glicose e 25 mM HEPES	Gibco	10564-011	Aqueça-o a 37 ° C em banho-maria.
Caldo Difco Lactobacilli MRS	BD	288120	Execute a autoclave a 121 ° C por 15 min.
Poli(dimetilsiloxano)	Dow Corning	3097358-1004	15:1 (p/p), PDMS: agente de cura
Caco-2BBE linha de carcinoma colorretal humano	Harvard Digestive Disease Center		Adenocarcinoma colorretal humano
FBS inativado por calor	Gibco	10082-147	20% (v/v) em DMEM
Penicilina-estreptomicina-glutamina	Gibco	10378-016	diluição de 1/100 em DMEM
4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato	Sondas	moleculares D1306	Coloração de
núcleos Faloidina-CF647 conjugado (25 unidades/ml)	Biotium	00041	Coloração de
Sistema de tensão Flexcell FX-5000	Flexcell International Corporation	FX5K	Movimento de stretcing semelhante ao peristaltismo (10% de tensão celular, frequência de 0,15 Hz)
Microscópio de epifluorescência invertida	Zeiss	Axio Observer Z1	Imaging, DIC
Microscópio confocal de varredura	Leica	DMI6000	Imaging, Fluorescência
UVO Cleaner	Jelight Company Inc	342	Ativação superficial do colágeno tipo I do chip intestinal
	Gibco	A10483-01	Componente de matriz extracelular para cultura de células no chip
Matrigel	BD	354234	Componente de matriz extracelular para cultura de células no chip
Seringa descartável de 1 ml	BD	309628	Injeção de células e meios 25
G 5/8 agulha	BD	329651	Injeção de células e meios
Bomba de seringa Braintree	Scientific Inc.	BS-8000	Equipamento de injeção no chip
VSL#3	Sigma-Tau Pharmaceuticals	7-45749-01782-6	Uma formulação de 8 diferentes micróbios intestinais comensais
Meio Clostridial Reforçado	BD	218081	Meio de cultura de bactérias anaeróbicas
Sistema de Recipiente Anaeróbio GasPak EZ com Indicador	BD	260001	Sachê gerador de gás anaeróbico
157-4-100	microscopia eletrônica	do paraformaldeído de 4%	Fixando as pilhas para corar
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilizando as pilhas
Albumina bovina do soro	Sigma-Aldrich	A7030	Agente de bloqueio para a coloração das pilhas
Tratamento da corona	Produtos eletrotécnicos	BD-20AC	Gerador do plasma para a fabricação da microplaqueta
Steriflip	Millipore	SE1M003M00	Desgaseificação do meio de cultura completo
Hemocitômetro descartável	iNCYTO	DHC-N01	para contagem manual de células

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