Este protocolo fornece diretrizes passo a passo para a criação de experimentos competitivos de transplante de medula óssea de camundongos para estudar a função das células-tronco/progenitoras hematopoiéticas sem purificação prévia de células-tronco por classificação de células.
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Artigo de método
Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell
Neste artigo
Resumo
Resumo
A definição padrão-ouro de uma célula-tronco hematopoiética (HSC) é uma célula que, quando transferida para um receptor irradiado, terá a capacidade de restabelecer a produção de células sanguíneas durante a vida útil do receptor. Este protocolo explica como configurar um ensaio funcional para comparar as capacidades de HSC de duas populações diferentes de células, como medula óssea de camundongos de dois genótipos diferentes, e como analisar os camundongos receptores por citometria de fluxo. O protocolo usa equivalentes HSC em vez de classificação de células para padronização e discute as vantagens e desvantagens de ambas as abordagens. Além disso, discutimos diferentes variações do protocolo básico, incluindo transplantes em série, ensaios de diluição limitante, ensaios de homing e transplantes não competitivos, incluindo as vantagens e usos preferidos dessas abordagens variadas. Esses ensaios são centrais para o estudo da função do HSC e podem ser usados não apenas para a investigação de aspectos intrínsecos fundamentais do HSC da biologia, mas também para o desenvolvimento de ensaios pré-clínicos para transplante de medula óssea e expansão do HSC em cultura.
Introdução
A hematopoiese é um processo regenerativo que garante o reabastecimento das células do sangue que foram perdidos devido a uma lesão, a radiação e a morte celular. Este processo é assegurada por células estaminais hematopoiéticas (HSC), que em grande parte residem na medula óssea de adultos. Além disso, as células estaminais hematopoiéticas podem ser utilizados para fins terapêuticos em doenças auto-imunes, doenças malignas hematológicas e imunodeficiências 1. Assim, há uma necessidade de compreender melhor os mecanismos que regulam a função HSC, incluindo sua expansão proliferativa e sua capacidade de alcançar e enxertar a medula óssea receptor após o tran....
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Protocolo
Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pelo comitê de ética animal institucional e seguir o Canadian Council on Animal Care orientações.
Nota: Para manter condições estéreis / ou específicas isentos de agentes patogénicos de habitação, realizar todos os procedimentos que envolvem a manipulação direta de ratos vivos dentro de uma cabine de segurança biológica ou uma capela de fluxo laminar. Limpe ou esterilizar gaiolas, dispositivos de retenção, materiais de construção, comida e água fornecida aos animais de forma adequada. Use, agulhas descartáveis única estéreis para as injeções e para coleta de sangue. A té....
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Resultados
Uma descrição geral da definição de transplante competitivo, incluindo transplantes secundárias (discutido mais adiante) pode ser encontrada na Figura 1. A análise representativa de medula pré-transplante ósseo HSCs pode ser encontrada na Figura 2. Informações mais detalhadas sobre a exclusão de dobletes e células mortas pode ser encontrada em outros lugares 9.
As Figuras 3<.......
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Discussão
O protocolo aqui descrito destina-se a avaliar a aptidão relativa de dadores (teste) HSCs contra competidor conhecido HSCs. A situação de concorrência aumenta a sensibilidade relativa do ensaio (maior probabilidade de detectar reduções moderadas na aptidão de células-tronco) e fornece um controle técnico interno para a eficácia da irradiação e injeção. No entanto, ele não deve ser utilizado como uma medida absoluta de HSC aptidão; uma diminuição na reconstituição competitivo não significa automaticamente que o HSCs não .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Somos gratos a Roxann Hétu-Arbour para a assistência com o design figura e demonstração dos procedimentos. Pesquisa no laboratório foi apoiado por uma concessão de Transição da Fundação Cole, Descoberta conceder nenhuma. 419226-2012 das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) e da Fundação Canadense para a Inovação (CFI Líderes Fundo conceder no. 31377). KMH é um Chercheur-Boursier Júnior para o Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos Microtainer com K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| Seringa | 20 G | Para amostragem de sangue da veia mandibular | |
| LabQuake Shaker rotisserie Thermo | Scientific | C415110 | |
| Purificado anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μ g / ml |
| CD3e anti-camundongo conjugado com Pe-Cy7 (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0,25 μ g/ml |
| camundongo conjugado com PE anti-camundongo CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0,25 μ g / ml |
| APC-eFluor780 (equivalente a APC-Cy7) - conjugado anti-camundongo GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0,25 μ g / ml |
| conjugado FITC anti-camundongo CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μ g / ml |
| eFluor450-conjugado anti-camundongo CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1,00 μ g / ml |
| Biotinilado anti-humano / camundongo CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1,25 μ g / ml |
| Biotinilated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1,25 μ g / ml |
| Biotinilated anti-mouse CD11b (clone M1 / 70) | eBioscience | 13-0112 | 1,25 μ g / ml |
| Biotinilado anti-rato GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1,25 μ g/ml |
| Biotinilado anti-rato TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0,625 μ g / ml |
| V500 estreptavidina | BD Biosciences | 56149 | 0,5 μ g/ml |
| camundongo conjugado com PE CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0,25 μ g / ml |
| camundongo conjugado com PE-Cy7 Ly6A / E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0,25 μ g / ml |
| PerCP-eFluor710-conjugado anti-camundongo CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0,5 μ g / ml |
| Alexa fluor 647-conjugado anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0,625 μ g/ml A BD Biosciences e a eBioscience não carregam o mesmo clone |
| Seringa de tuberculina de 1 ml com agulha de 27 G | Seringa BD | 309623 | |
| Seringa de tuberculina de 1 ml com agulha de 25 G | Seringa BD | 309626 | |
| 70 μ filtro de células m | BD Falcon | 352350 |
Referências
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and....
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Reimpressões e permissões
