Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama

Summary

Este protocolo descreve o uso de três métodos diferentes para analisar a proliferação celular em linhagens celulares de câncer de mama. Isso inclui o uso de contagem de células convencional, viabilidade celular baseada em luminescência e contagem de células por meio do uso de um gerador de imagens de células. Cada um oferece vantagens para a medição reprodutível da proliferação celular.

Abstract

A medição da proliferação celular pode ser realizada por vários métodos diferentes, cada um com níveis variados de sensibilidade, reprodutibilidade e compatibilidade com formatação de alto rendimento. Este protocolo descreve o uso de três métodos diferentes para medir a proliferação celular in vitro, incluindo a câmara de contagem de hemocitômetros convencional, um ensaio baseado em luminescência que utiliza a mudança na atividade metabólica de células viáveis como uma medida do número relativo de células e um gerador de imagens celular multimodo que mede o número de células usando um algoritmo de contagem. Cada método apresenta suas próprias vantagens e desvantagens para a medição da proliferação celular, incluindo tempo, custo e compatibilidade de alto rendimento. Este protocolo demonstra que cada método pode medir com precisão a proliferação celular ao longo do tempo e foi sensível para detectar o crescimento em diferentes densidades celulares. Além disso, a medição da proliferação celular usando um gerador de imagens celular foi capaz de fornecer mais informações, como morfologia, confluência e permitiu um monitoramento contínuo da proliferação celular ao longo do tempo. Em conclusão, cada método é capaz de medir a proliferação celular, mas o método escolhido é dependente do usuário.

Introduction

O gene supressor do tumor, p53, é um regulador essencial de um número de processos celulares, incluindo a paragem do ciclo celular, apoptose e senescência ^1. Ela é responsável pela manutenção da estabilidade genómica, e é, portanto, crucial para manter o equilíbrio de morte celular e o crescimento celular. As mutações em p53 são comuns no cancro e são a principal causa de inactivação de p53 que conduz à proliferação descontrolada de células de cancro ^2. Curiosamente, as mutações em p53 representam apenas cerca de 25% dos cancros da mama ^3, sugerindo que outros mecanismos são responsáveis ​​pela perda de função de p53. As isoformas p53....

Protocol

1. Células Preparação para a proliferação Ensaios

Nota: Preparar as duas linhas celulares do mesmo modo e sementes no mesmo formato para cada método a ser analisado.

1. Crescer células MCF-7 e MCF-LEGO-7-Δ40p53 ⁷ células a 75-80% de confluência em T de 75 cm ² frascos de cultura de tecidos utilizando fenol-vermelho livre de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) , 200 mM de L-glutamina, 2 ug / ml de insulina e 1 ug / ml de puromicina a 37 ° C com 5% de CO _2. Lidar com células em uma biossegurança estéril classe gabinete II.
   Nota: A quantidade de ....

Results

Para estudar diferentes métodos de medição da proliferação de células em cultura, a proliferação de células de MCF-7-Δ40p53 células transduzidas foi comparado com o MCF-7-LEGO não transduzidas linha celular de cancro da mama. Os três métodos que foram comparados - o método de imagiologia hemocitómetro convencional, ensaio de luminescência a viabilidade das células, e células Análisis- são descritas no diagrama esquemático (Figura 1). Cada método tem vantagens e desvantag.......

Discussion

Neste protocolo foram examinados três diferentes métodos de medição da proliferação celular em células em cultura. Cada método foi capaz de medições reprodutíveis e precisos de proliferação de células durante 96 h, e os resultados foram comparáveis ​​entre cada um dos métodos testadas (Figura 2 e 3). Tanto o ensaio à base de luminescência e método de imagem de células produzido os resultados mais robustos, mostrando um aumento linear na proliferação de células após 96 horas (Figura 2b, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Meio Eagle Modificado de Dulbecco, sem fenol-vermelho	ThermoFisher Scientific	21063-045	Suplementado com 10% de FBS, 200 mM L-glutamina, 2 µ g/ml de insulina e 1 µ g / ml solução de puromicina
L-glutamina (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Solução de insulina humana	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Soro fetal bovino (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Cloridrato de puromicina	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0,5% solução de tripsina-EDTA (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Diluir para 2x em DPBS
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Frasco de cultura de tecidos, área > 75 cm2 células	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Contador	Merck Millipore		Contador de células automatizado
de 96 poços, fundo plano	Nunc	167008
Melhorado Neubauer Hemocitômetro	BOECO Alemanha	BOE 01
Microscópio invertido Olympus IX51 Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Ensaio	Promega	G9242	Ensaio baseado em luminescência
Leitor multimodo de imagem celular de citação 3 Leitor de	BioTek		luminescência, fluorescência e imagem de células de campo claro
Gen5 Software de análise de dados	BioTek	GEN5