Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

Resumo

Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões.

Resumo

Seleção rendimentos do timo em um microambiente tímico única e altamente organizada resultando na geração de um repertório de células T funcional, auto-tolerante. Modelos in vitro para estudar o compromisso linhagem T e desenvolvimento forneceram informações valiosas sobre este processo. No entanto, estes sistemas têm a meio do timo tridimensional completa necessária para o desenvolvimento da célula T e, por conseguinte, são aproximações incompletos in vivo de selecção tímica. Alguns dos desafios relacionados com o desenvolvimento de células T de modelagem pode ser superado usando em modelos in situ que fornecem um microambiente tímico intacta que apoia plenamente a seleção do timo de desenvolvimento de células T. Timo culturas fatia organotípicas complementar as técnicas in situ. fatias tímicos preservar a integridade das regiões corticais e medulares do timo e oferecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento de timócitos sobrepostas de um estágio de desenvolvimento definidas ou de endógena T cells dentro de um microambiente tímico maduro. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias por rato, fatias do timo apresentar uma vantagem única em termos de escalabilidade para experimentos de alto rendimento. Além disso, a relativa facilidade na geração de fatias do timo e potencial para sobrepor diferentes subconjuntos de timo ou de outras populações de células de diversas origens genéticas aumenta a versatilidade do presente método. Descrevemos aqui um protocolo para a preparação de fatias do timo, o isolamento e a sobreposição de timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo. Este sistema também pode ser adaptado para estudar o desenvolvimento de células T não-convencionais, bem como visualizar a migração de timócitos, as interacções das células de timócitos-estromal, e sinais associados com TCR selecção tímica por microscopia de dois fotões.

Introdução

As células T diferenciam por meio de uma série de intermediários de desenvolvimento no timo durante o qual eles encontram vários pontos de controlo que asseguram a geração de, um repertório de células T auto-tolerante funcional ^1-3. A selecção positiva promove a sobrevivência dos timócitos com receptores de células T (TCR), capazes de reconhecer, com baixa a moderada afinidade, péptido apresentados por moléculas de grandes complexos de histocompatibilidade (MHC) sobre as células epiteliais tímicas corticais ^(2,3 CTEC). Selecção negativa e desenvolvimento de células T reguladoras (T _reg) contribuir para o estabelecimento da auto-tolerâ....

Protocolo

Protocolos para todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal no Centro de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. colheita mouse Thymus para Preparação de tímicos Slices e suspensões de células individuais

1. Eutanásia do rato com CO _2, seguida por deslocação cervical.
2. Em uma capela de fluxo laminar, pin lado o rato ventral-se a uma placa de dissecação. Pulverizar o rato com 70% de etanol. Remova qualquer excesso de álcool, esfregando com uma gaze para evitar que o etanol de entrar na cavidade torácica e danificar o tecido.
3. Levantar a pele na base do esterno com um par de pinças e fazer....

Resultados

análise de suporte fatias do timo dos diferentes aspectos do desenvolvimento de células T, tais como selecção positiva e negativa. Para as experiências bem sucedidas, a qualidade da fatia tímico é primordial. Deste modo, as fatias do timo deve ser examinado para assegurar a integridade do tecido tímico e que a agarose em torno do timo fatia está intacto (Figura 1A). A tensão superficial pode ser comprometida quando a agarose é danificado causando uma d.......

Discussão

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de fatias do timo e resultados representativos de selecção positiva e negativa eficiente da pré-selecção do coberto MHC classe restrita-I TCR timócitos transgênicas por citometria de fluxo. Este sistema tem sido utilizado com sucesso similar para suportar a selecção positiva de células MHC de classe II restringidas CD4 ⁺ T a partir de pré-selecção DP timócitos ^32, e, na presença do antigénio com o agonista, a selecção negativa e do timo t desenvol.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	Agarose de Baixa Temperatura
de Fusão (T12)	Policiências	18986	22 mm x 22 mm quadrado, truncado para 12 mm x 12 mm
Lâminas de Preparação de Borda Dupla Adesivo de	Personna	74-0002
	3M	1469SB
0.4 µ m Inserções de Cultura de Células	BD Falcon	353090	De várias marcas testadas, estas mantiveram as células em cima das fatias o melhor
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 com L-glutamina	Wisent	350-000-CL
Soro Fetal Bovino	Wisent	080-110	L-Glutamina inativada por calor
, 200 mM	Wisent	609-065-EL
Penicilina/Estreptomicina, 100x	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoetanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders	Wheaton	357426
Nylon Mesh Filter	Component Supply	U-CMN-255
Tubo de Microcentrífuga Amostra Pilão	Bel-Art	F19922-0000
40 µ m Filtro de Células de Nylon	BD Falcon	352340
Fórceps Ponta Inox	Dumont	RS-5047	Pinça curva de ponta fina, tamanho .17 x .10 mm
Micro Pinça	Dumont	RS-5090

Molde de Incorporação de Tecido