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Artigo de método

Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

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DOI:

10.3791/54355

⸱

6 de agosto de 2016

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões.

Resumo

Seleção rendimentos do timo em um microambiente tímico única e altamente organizada resultando na geração de um repertório de células T funcional, auto-tolerante. Modelos in vitro para estudar o compromisso linhagem T e desenvolvimento forneceram informações valiosas sobre este processo. No entanto, estes sistemas têm a meio do timo tridimensional completa necessária para o desenvolvimento da célula T e, por conseguinte, são aproximações incompletos in vivo de selecção tímica. Alguns dos desafios relacionados com o desenvolvimento de células T de modelagem pode ser superado usando em modelos in situ que fornecem um microambiente tímico intacta que apoia plenamente a seleção do timo de desenvolvimento de células T. Timo culturas fatia organotípicas complementar as técnicas in situ. fatias tímicos preservar a integridade das regiões corticais e medulares do timo e oferecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento de timócitos sobrepostas de um estágio de desenvolvimento definidas ou de endógena T cells dentro de um microambiente tímico maduro. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias por rato, fatias do timo apresentar uma vantagem única em termos de escalabilidade para experimentos de alto rendimento. Além disso, a relativa facilidade na geração de fatias do timo e potencial para sobrepor diferentes subconjuntos de timo ou de outras populações de células de diversas origens genéticas aumenta a versatilidade do presente método. Descrevemos aqui um protocolo para a preparação de fatias do timo, o isolamento e a sobreposição de timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo. Este sistema também pode ser adaptado para estudar o desenvolvimento de células T não-convencionais, bem como visualizar a migração de timócitos, as interacções das células de timócitos-estromal, e sinais associados com TCR selecção tímica por microscopia de dois fotões.

Introdução

As células T diferenciam por meio de uma série de intermediários de desenvolvimento no timo durante o qual eles encontram vários pontos de controlo que asseguram a geração de, um repertório de células T auto-tolerante funcional 1-3. A selecção positiva promove a sobrevivência dos timócitos com receptores de células T (TCR), capazes de reconhecer, com baixa a moderada afinidade, péptido apresentados por moléculas de grandes complexos de histocompatibilidade (MHC) sobre as células epiteliais tímicas corticais (2,3 CTEC). Selecção negativa e desenvolvimento de células T reguladoras (T reg) contribuir para o estabelecimento da auto-tolerância através da eliminação ou desvio de timócitos que respondem fortemente a auto-peptídeo apresentado por MHC 2,4. Imaturos CD4 + CD8 + positivas dupla (DP) timócitos expressando TCRs que passam o processo de selecção diferenciam em subpopulações de células T maduras, a maioria dos quais são de classe I-restringida de MHC de células CD8 + citotóxicasou MHC de classe II restrito de células T CD4 + auxiliares individuais positivas (SP), antes de sair do timo para realizar as funções efectoras nos órgãos linfóides secundários 1-3.

Adicionando à complexidade do desenvolvimento de células T é a migração dinâmica e encontros celulares do desenvolvimento de timócitos em toda a rede celular de estroma 5-9. Estas células estromais desempenham papéis distintos no desenvolvimento de timócitos e são diferencialmente distribuídos entre as regiões corticais e medulares do timo, onde positivo e seleção negativa ocorrem 10. Embora a selecção positiva ocorre principalmente no córtex, não há acumulação de provas de que os timócitos DP migrar para a medula e continuar a exigir que os sinais de TCR, antes de se diferenciar em células T maduras, sugerindo que a medula pode fornecer sinais adicionais necessários para a realização de selecção positiva e linhagem 11,12 diferenciação. Mais distante,apesar da presença de células especializadas medulares do timo epiteliais (MTEC) que expressam e apresentam antigénios restrita a um tecido que facilitem a eliminação de timócitos autorreactivas 13,14, uma grande proporção de selecção negativa ocorre no córtex em resposta a expresso ubiquamente auto-péptido apresentado por dendrítica células 15,16. Assim, modelos precisos de desenvolvimento de células T deve proporcionar um microambiente tímico altamente organizada, com cortical intacta e regiões medulares, que facilita a interacção entre timócitos e células do estroma, e suporta a migração de timócitos como estas células sofrem de selecção positiva e negativa.

Para complementar ex vivo análises de timócitos como um meio de estudar a selecção positiva e negativa, um certo número de ensaios in vitro, in situ, e em modelos in vivo do desenvolvimento de células T têm sido desenvolvidos 17-22. Tem sido notoriamente difícil de recapitulara selecção positiva, in vitro, mas co-cultura de populações de células estaminais ou precursores de células T com células estromais que expressam ligando de Notch, nomeadamente OP9-DL1 / 4 células, tem a capacidade de suportar compromisso linhagem T e selecção positivo reduzido tornando-se um valor inestimável modelo in vitro para desenvolvimento de células T estudo 23-25. As limitações deste sistema, no entanto, incluem o facto de estas células não possuem a maquinaria de processamento de péptidos única encontrada nas células do estroma de timo e o microambiente tímico tridimensional.

Embora tecnicamente mais complicada, in situ e in vivo em modelos de selecção tímica pode superar alguns dos obstáculos relacionados com os sistemas in vitro. Culturas de órgãos tímicos Reaggregate (RTOC) contêm misturas de timócitos e de células do estroma de timo 18,26,27 definido. Estas células epiteliais tímicas reaggregates manter a MHC de classe I e II de expressão e pode suportar development de ambos os subconjuntos de células T convencionais, mas ainda não têm definido estruturas corticais e medulares. Fetal cultura de órgão tímico (FTOC) é um modelo popular de desenvolvimento de células T que pode ser semeada com timócitos via cultura de suspensão-gota de lóbulos do timo lymphodepleted ou por meio de injecção de timócitos em lymphoreplete lóbulos do timo e apoiar o desenvolvimento eficiente de células T CD4 + e CD8 + T células ao longo do tempo na cultura 18,28-31. No início da cultura de lobos do timo fetal há uma escassez de mTECs, mas as estruturas corticais e medulares definidos podem desenvolver ao longo do tempo, dependendo das condições. Uma consideração importante é que este modelo pode preferencialmente suportar fetal contra o desenvolvimento de células T do adulto. Finalmente, injeção intratímico de precursores do timo definidos em camundongos adultos é tecnicamente desafiador, mas claramente fornece um ambiente para apoiar Desenvolvimento de células T in vivo. Estes in situ e em modelos in vivo são excelentes ferramentas to desenvolvimento de células T estudo ea sua utilização deve ser considerada a título experimental de-by-experimento.

Fatias do timo, no entanto, surgiram recentemente como um modelo versátil, complementares para estudar a seleção do timo in situ com a possibilidade de acomodar única, complexa e experimentos de taxa de transferência, geralmente mais elevados. Fatias do timo manter a integridade das regiões corticais e medulares e fornecer um quadro de células estromais que suporta a migração de timócitos durante o desenvolvimento, bem como eficiente selecção positiva e negativa 11,32-39. Subconjuntos de timócitos adicionados no topo de fatias do timo migram para o tecido e seu nicho microambiental adequada 34,37. Os timócitos sobrepostas podem ser distinguidas das células endógenas fatia de timo através de marcadores cong�icas ou marcadores fluorescentes e podem ser mantidas em cultura durante vários dias. culturas organotípicas fatia do timo pode ser utilizado para estudar vários aspectosdo desenvolvimento de células T, incluindo selecção tímica, o comportamento de timócitos (migração e interacções celulares), e localização de timócitos, entre outros. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias do timo por ratinho, a escalabilidade das experiências é geralmente maior do que o outro em modelos in situ de selecção tímica. Embora a preparação de fatias do timo requer equipamento especializado, tal como o vibratome, e o tempo de vida de fatias do timo em cultura é limitada devido à perda de células ao longo do tempo através de morte celular e a ausência de uma membrana de encapsulação, as fatias do timo fornecer um excelente modelo por análise de selecção tímica de populações sincronizadas de timócitos dentro de um microambiente tímico madura. Aqui, descrevemos a preparação de fatias do timo, incluindo a colheita (o timo, a incorporação de agarose de lóbulos do timo e vibratome seccionamento do tecido embebido), isolamento e revestimento dos timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo.

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Protocolo

Protocolos para todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal no Centro de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. colheita mouse Thymus para Preparação de tímicos Slices e suspensões de células individuais

  1. Eutanásia do rato com CO 2, seguida por deslocação cervical.
  2. Em uma capela de fluxo laminar, pin lado o rato ventral-se a uma placa de dissecação. Pulverizar o rato com 70% de etanol. Remova qualquer excesso de álcool, esfregando com uma gaze para evitar que o etanol de entrar na cavidade torácica e danificar o tecido.
  3. Levantar a pele na base do esterno com um par de pinças e fazer um corte através da pele. Estender o corte da pele para cima para cada membro anterior.
  4. Fazer um corte adicional na base do esterno para separar o diafragma da caixa torácica. Em seguida, corte cada lado da caixa torácica para a clavícula. Virar a caixa torácica na direção da cabeça expondo a cavidade torácica. Os dois lóbuloso timo se encontram na parte superior do coração.
  5. Remover o tecido conjuntivo em torno dos lobos do timo usando uma pinça, tesoura micro-dissecação, e / ou tesoura curva afiadas. Use um par de ponta curvada uma pinça fina para levantar os lobos individuais por baixo ou através do restante do tecido conjuntivo.
    Nota: Não segure o timo diretamente.
  6. Coloque os lóbulos do timo em um tubo cônico de 15 ml contendo PBS e reserve em gelo até ser necessário.

2. Agarose Embedding e Vibratome Corte do timo Lobes

  1. Preparar a solução de agarose a 4% para a incorporação dissolvendo 2 g de baixo ponto de fusão de agarose em 50 ml estéril PBS e microondas em um nível baixo até que a agarose se dissolva completamente. Cubra balão com folha de alumínio e coloque num banho de água a 55 ° C até que esteja pronto para uso.
  2. Num capuz de cultura de tecidos, preparar meio completo RPMI-1640 que contém soro fetal de bovino 10% (FBS), L-glutamina 4 mM, 1x penicilina / estreptomicina, e 10 uM2-mercaptoetanol.
  3. Adicionar 1,5 ml de meio RPMI-1640 completo por poço para uma placa de cultura celular de 6 poços e colocar uma inserção de cultura de células em cada poço. Definir o prato de lado numa incubadora a 37 ° C até ser necessário.
  4. Prepare um banho de água gelada lamacenta com água e gelo em um balde de gelo.
  5. Remova cuidadosamente todo o tecido conjuntivo permanecendo em torno de cada lóbulo do timo usando uma pinça de ponta fina. Fazer isto enquanto o lóbulo tímico é submersa em PBS numa placa de cultura de tecidos, depois de transferência para um lenço de papel embebido com PBS, ou sob um microscópio de dissecação.
  6. Permitir que a agarose arrefecer abaixo de 40 ° C, quando o balão é apenas a quente ao toque, para evitar o sobreaquecimento do tecido. Verter a arrefeceu-se 4% de agarose para um molde de tecido a uma altura de 1 cm ~.
  7. Use um par de fórceps para transferir cuidadosamente o lobo do timo a um lenço de papel e enrole-o delicadamente para secá-lo sem danificar o tecido. Certifique-se de que o tecido seque completamente ou ele vai deslizar para fora da agarose durante cortando.
  8. Cuidadosamente inserir o lóbulo em que a agarose e posicioná-lo horizontalmente, quer (para aumentar a área de superfície de cada fatia) ou verticalmente (para aumentar o número de fatias), na parte inferior do molde. Coloque o molde em água de gelo durante 5-10 minutos para permitir que a agarose solidificar.
  9. Durante este tempo, preparar vibratome para cortar através da montagem de tabuleiro de tampão, a montagem do disco de amostra, e inserir a lâmina vibratome. Coloque um pedaço de fita de laboratório sobre o disco de amostra. Esterilizar o espaço de trabalho limpo, montado com 70% de etanol.
  10. Uma vez que os solidifica de agarose, inverter o molde e pressione suavemente em seu centro para liberar a agarose incorporado lóbulo.
  11. Usar uma lâmina afiada para cortar o excesso de agarose em torno do lóbulo deixando ~ 2 mm de agarose em cada lado e ~ 0,5 cm na parte inferior.
  12. Fixe cada bloco de agarose com uma gota de cola de tecido para o pedaço de fita adesiva no disco de amostra. Vários blocos podem ser colados na fita.
  13. Alinhe o wi lâmina vibratomepo do topo do bloco de agarose. Encha a bandeja de tampão com PBS estéril até que o bloco (s) de lâmina e agarose são totalmente imersos.
  14. Secção do tecido de agarose incorporado para obter fatias com uma espessura de 400-500 um. Defina o vibratome a 0,225 mm / seg de velocidade, freqüência de 100 Hz e 5 ° ângulo.
  15. Usar uma espátula dobrada para recolher as fatias do timo em uma placa de cultura de tecido contendo PBS estéril à medida que são cortadas. Rejeitar a primeira e última fatia.
  16. Examine as fatias sob um microscópio de luz em uma ampliação de 4X. Escolha as fatias com tecido tímico intacta e em torno de agarose (Figura 1A).
  17. Transferir as fatias para a placa, preparado no passo 2.3, utilizando uma ponta de pipeta para deslizar suavemente a fatia timo da espátula dobrada sobre a inserção de cultura de célula. Cada inserção pode acomodar ~ 3 fatias. Certifique-se as fatias não se tocam ou as paredes da inserção de cultura de células.
  18. Manter a placa a 37 ° C até ser necessário.
3. Preparação de timócitos para sobrepor

  1. Isolar lóbulos do timo, tal como descrito na secção 1. dissociar os lóbulos manualmente para fazer uma suspensão de células individuais utilizando um triturador de tecido de 15 ml esterilizado cheia com 5 ml de PBS estéril contendo 2% de FBS. Transferir as células para um tubo cónico de 15 ml.
  2. Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de tampão de lise 1x ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM de KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA) à temperatura ambiente durante 3 min para lisar as células vermelhas do sangue.
  3. Encher o tubo para 15 ml com PBS contendo 2% de FBS. Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Ressuspender as células em 10 ml de PBS contendo 2% de FBS e passar as células através de um filtro de malha de 255? M.
  5. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C, e ressuspender a pelete de células em PBS contendo 2% de FBS, para uma concentrção de 1 x 10 7 células por ml.
  6. Marcar as células com corantes celulares, tais como o éster de succinimidilo carboxifluoresceína (CFSE) de acordo com os protocolos do fabricante, se não utilizando timócitos de ratinhos que expressam marcadores cong�icas ou repórteres fluorescentes geneticamente codificados para distinguir a partir de células endógenas fatia.
  7. Após a lavagem final das células marcadas, ressuspender o sedimento de células em meio RPMI-1640 completo a 1-3 x 10 6 culas por 15 ul.

4. Sobreposição de timócitos para o timo Slices

  1. Usar uma pipeta para aspirar qualquer líquido que rodeia as fatias do timo sobre a inserção.
    Nota: Tome cuidado para não danificar a agarose. Se a agarose é danificado, os timócitos sobrepostas não irá aderir à superfície da fatia devido a perda da tensão de superfície.
  2. Sem tocar na fatia com a ponta da pipeta, sobreposição de 15 ul de timócitos preparados na seção 3 para cada fatia do timo.
  3. Incubar as plate a 37 ° C durante 2 horas para permitir que as células migrem para as fatias do timo.
  4. Após 2 h, lavar as fatias do timo 3 vezes com 1 ml de PBS para remover o excesso de timócitos sobrepostas que ainda não migraram para o tecido.
  5. Incubar a placa a 37 ° C até que as fatias do timo estão prontas para ser colhidas, tipicamente 1-72 horas, dependendo da experiência.

5. A dissociação de tímicos Slices para citometria de fluxo

  1. Preparar um tubo de microcentrífuga para cada fatia através da adição de 150 uL de PBS contendo 2% de FBS.
  2. Adicionar 1 ml de PBS contendo 2% FBS para a inserção de cultura de tecido com as fatias do timo e agitar suavemente com uma espátula dobrada para separar as fatias a partir da superfície da inserção de cultura de célula.
  3. Transferir a fatia a partir da inserção para o tubo de microcentrífuga utilizando uma espátula dobrada.
  4. interromper manualmente a fatia usando um pilão microcentrifuge amostra de tubo. Adicionar 150 uL de PBS contendo 2% de FBS para um volume final de 300ul.
  5. Filtra-se o tecido dissociado através de um filtro de 40 um para um novo tubo de microcentrifugação. As células filtradas está pronto para ser corada para análise de citometria de fluxo 40.
  6. Filtrar as células uma segunda vez antes de passá-los num citómetro de fluxo para garantir que toda a agarose é removida e não entupir o citómetro de fluxo.
  7. Adquirir as células num citómetro de fluxo e análise de dados, como foi anteriormente descrito 40.

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Resultados

análise de suporte fatias do timo dos diferentes aspectos do desenvolvimento de células T, tais como selecção positiva e negativa. Para as experiências bem sucedidas, a qualidade da fatia tímico é primordial. Deste modo, as fatias do timo deve ser examinado para assegurar a integridade do tecido tímico e que a agarose em torno do timo fatia está intacto (Figura 1A). A tensão superficial pode ser comprometida quando a agarose é danificado causando uma d...

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Discussão

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de fatias do timo e resultados representativos de selecção positiva e negativa eficiente da pré-selecção do coberto MHC classe restrita-I TCR timócitos transgênicas por citometria de fluxo. Este sistema tem sido utilizado com sucesso similar para suportar a selecção positiva de células MHC de classe II restringidas CD4 + T a partir de pré-selecção DP timócitos 32, e, na presença do antigénio com o agonista, a selecção negativa e do timo t desenvol...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Marilaine Fournier por seus comentários sobre o manuscrito e a Josée Tessier pela assistência técnica. C57BL / 6-Tg (OT-I) -RAG1 # 4175 foram obtidos através do Programa de Intercâmbio NIAID, NIH. O apoio a esta pesquisa é fornecido por uma doação da SickKids Foundation e CIHR-IHDCYN (NI15-002), uma bolsa operacional do CIHR-III (MOP-142254) e fundos iniciais do FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) e da Fundação Hôpital Maisonneuve-Rosemont para HJM. HJM é um bolsista júnior 1 do FRQS, um Novo Investigador do CIHR (MSH-141967) e ganhador do prêmio Cole Foundation Early Career Transition.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
VibratomeLeica BiosystemsVT1000S 
NuSieve GTG AgaroseLonza50080Agarose de Baixa Temperatura
de Fusão (T12)Policiências1898622 mm x 22 mm quadrado, truncado para 12 mm x 12 mm
Lâminas de Preparação de Borda Dupla Adesivo dePersonna74-0002
3M 1469SB
0.4 µ m Inserções de Cultura de Células BD Falcon353090De várias marcas testadas, estas mantiveram as células em cima das fatias o melhor
Solução salina tamponada com fosfato de DulbeccoThermoFisher21600-010
RPMI-1640 com L-glutaminaWisent350-000-CL
Soro Fetal BovinoWisent080-110L-Glutamina inativada por calor
, 200 mMWisent609-065-EL
Penicilina/Estreptomicina, 100xWisent450-201-EL
2-MercaptoetanolAlfa AesarA15890
15 ml Tenbroeck Tissue GrindersWheaton357426
Nylon Mesh FilterComponent SupplyU-CMN-255
Tubo de Microcentrífuga Amostra PilãoBel-ArtF19922-0000
40 µ m Filtro de Células de NylonBD Falcon352340
Fórceps Ponta InoxDumont RS-5047Pinça curva de ponta fina, tamanho .17 x .10 mm
Micro PinçaDumont RS-5090
Molde de Incorporação de Tecido

Referências

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