Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo de fluorescência de células activadas (FACS) para estudar alterações moleculares em Fos-expressando conjuntos neuronais a partir de tecido cerebral fresco e congelado. O uso de tecido congelado permite o isolamento FACS de muitas áreas do cérebro mais várias sessões para maximizar o uso de indivíduos animais valiosos.

Resumo

O estudo da neuroplasticidade e alterações moleculares em comportamentos aprendidos está a mudar a partir do estudo de regiões do cérebro inteiro ao estudo de conjuntos específicos de neurônios ativados escassamente distribuídos chamados conjuntos neuronais que medeiam aprendidas associações. Fluorescência de células activadas (FACS) foi recentemente optimizada para o tecido do cérebro do rato adulto e permitiu o isolamento de neurónios activados utilizando anticorpos contra o marcador neuronal NeuN e proteínas Fos, um marcador de neurónios fortemente activado. Até agora, os neurónios que expressam-Fos e outros tipos de células foram isoladas a partir de tecido fresco, o que implicou dias longos de processamento e permitiu número muito limitado de amostras de cérebro de ser avaliadas após procedimentos comportamentais longas e complexas. Aqui descobrimos que os rendimentos de Fos-expressando neurônios e mRNA Fos de striatum dorsal foram semelhantes entre o tecido recém-dissecados e tecido congelado a -80 ºC durante 3 - 21 dias. Além disso, confirmou o fenótipodas células NeuN positivos e NeuN-negativas classificados por expressão avaliar gene de natureza neuronal (NeuN), astrócitos (GFAP), oligodendrocíticos (Oligo2) e microgial marcadores (Iba1), o que indica que o tecido congelado pode também ser utilizado para o isolamento de FACS de tipos de células gliais. Em geral, é possível recolher, dissecar e congelar o tecido cerebral para sessões múltiplas de FACS. Isto maximiza a quantidade de dados obtidos a partir de sujeitos animais valiosos que têm muitas vezes sido submetidos a procedimentos comportamentais longos e complexos.

Introdução

Durante o aprendizado, os animais formam associações entre conjuntos complexos de estímulos altamente específicos. Esta informação de alta resolução é pensado para ser codificado por alterações dentro dos padrões específicos de neurônios escassamente distribuídos chamados conjuntos neuronais. Conjuntos neuronais foram recentemente identificados pela indução de genes imediatamente precoces (IEGs), tais como Fos, arco, e Zif268 e seus produtos proteicos em neurónios que foram fortemente activadas durante o comportamento ou a exposição a estímulos. Fos-expressando neurônios, em particular, têm sido mostrados para desempenhar papéis causais no contexto e comportamentos aprendidos ^1-4 específico-cue. Assim, neuroadaptações moleculares únicas dentro desses neurônios Fos-expressando ativados são os melhores candidatos para os mecanismos neurais que codificam aprendidas associações formadas durante distúrbios de aprendizagem e de aprendizagem anormal normais, tais como vício e transtorno de estresse pós-traumático (PTSD) ^5.

fluoréscence de células activadas (FACS) permitiu recentemente a análise de neuroadaptações moleculares únicas dentro dos neurônios Fos-expressam. A citometria de fluxo e classificação celular foram desenvolvidos na década de 1960 para ^6,7 caracterizar e isolar as células de acordo com as suas características de dispersão de luz e de imunofluorescência, e têm sido muito utilizados em imunologia e na investigação do cancro. No entanto citometria de fluxo e FACS requer células individuais dissociadas que são difíceis de obter a partir de tecido do cérebro adulto. FACS foi usado pela primeira vez para isolar e analisar Green Fluorescent Protein (GFP) -expressing neurónios do estriado de ratos transgénicos que não exigem rotulagem anticorpo ^8,9. Foi desenvolvido um método de FACS baseada em anticorpos ¹⁰ para isolar e avaliar alterações moleculares em Fos-expressando neurónios activados por droga e / ou sinais do tipo em animais selvagens ^11-15. Neste método, os neurónios são marcadas com um anticorpo contra o marcador neuronal geral NeuN, enquanto que os neurónios fortemente activadosão marcadas com um anticorpo contra Fos. Embora o nosso método inicial necessário o agrupamento de até 10 ratos por amostra de tecido fresco, modificações posteriores do protocolo permitiu o isolamento FACS de Fos-expressando neurônios e Polymerase Chain Reaction quantitativa de análise (qPCR) de áreas cerebrais distintas de um único rato ^13-15 . No geral, as alterações moleculares únicas foram encontrados em Fos-expressando neurônios ativados durante uma variedade de comportamentos ao contexto e ativada por sinalização em pesquisa vício ^12,14,15.

Um grande problema logístico com a realização de FACS em tecido fresco é que leva um dia inteiro para dissociar o tecido e processo pelo FACS. Além disso, apenas cerca de quatro amostras pode ser processado por dia. Isto normalmente significa que apenas uma área do cérebro pode ser avaliado a partir de todos os cérebros e os restantes áreas do cérebro têm que ser descartados. Este é um grande problema para os procedimentos comportamentais baixo rendimento como a auto-administração e trai extinçãoning que requer cirurgia e muitas semanas de treinamento intensivo. Além disso, os procedimentos comportamentais longas e complicadas no dia do teste faz com que seja difícil de executar de FACS no mesmo dia. Seria uma vantagem significativa de ser capaz de congelar os cérebros dos animais imediatamente após o teste de comportamento, e, em seguida, isolar-Fos neurónios que expressam a partir de uma ou mais áreas do cérebro em momentos diferentes da escolha do investigador.

Aqui demonstramos que o protocolo de FACS pode ser usado para isolar neurónios Fos-expressam (e outros tipos de células) a partir de tecido cerebral, tanto frescos e congelados. Como um exemplo, nós isolamos neurônios do corpo estriado de ratos após as injeções de metanfetamina agudas e de ratos ingênuos, sem injeções (condição de controle) Fos-expressar. No entanto, este protocolo FACS pode ser usado após qualquer tratamento comportamental ou farmacológica. análise qPCR subsequente de nossas amostras indicaram que a expressão do gene a partir desses tipos de células pode ser avaliada com simieficiência lar a partir de tecido fresco e congelado.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) dos Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório ^16.

Nota: Todos os passos abaixo uso tubos de ligação baixas centrífuga que foram mantidos em gelo, a menos que especificado em contrário.

1. Preparação antes da coleção Tissue

1. Definir a centrífuga a 4 ^o C.
2. Fogo polonês um conjunto de três pipetas Pasteur de vidro com decrescentes diâmetros de cerca de 1,3, 0,8, e 0,4 mm para cada amostra.
3. Preparar 1,7 ml rotulados-tubos contendo 1 ml de tampão A frio e manter os tubos em gelo.
4. Prepare uma bandeja de gelo contendo o cérebro cortando matriz, espátulas e placas de vidro (ou invertida Petri prato de vidro) no qual executar a dissecação. Pré-chill dois ou mais lâminas de barbear sobre a placas de vidro e tecidos uso de papel para secar todos os instrumentos que tocam a tquestão.
5. Descongelar a solução de enzima à temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos antes da recolha de tecidos.

2. Tissue Recolha e Dissection

1. Inicie a comportamental ou farmacológica de tratamento 90 min antes da coleta do tecido.
   NOTA: Para os resultados apresentados aqui, injecções intraperitoneais agudas de 5 mg / kg de metanfetamina em ratos num ambiente novo (situação de teste) e ratos ingénuos mantidos nas suas gaiolas (condição de controle) foram realizados.
2. Anestesiar o rato, colocando-o em um frasco de vidro com secador isoflurano saturada e decapitar o rato 30 - 60 seg mais tarde usando uma guilhotina.
   Utilize uma tesoura para remover o músculo e pele da cabeça e expor o crânio. Use fórceps para cortar o crânio e abrir o forame magno e remover a parte de trás do crânio. Use fórceps para corte ao longo das bordas de topo do crânio para expor o cérebro. Tenha cuidado para não danificar o cérebro. Use uma pequena espátula para colher suavemente sob umd elevar o cérebro. Elevar o cérebro e cortar os nervos até o cérebro é livre ^17.
3. Dissecar o tecido usando lâminas de barbear.
   NOTA: obter amostras de tecido usando um dos seguintes métodos: (2.3.1) do tecido recém-dissecados; (2.3.2) tecido congelado após a dissecção; ou (2.3.3) de tecido congelado dissecado a partir do cérebro inteiro congelado. Manter a matriz de corte cérebro, lâminas de barbear e placa de vidro seco em toda a dissecção e picagem processos como a água condensada pode levar à lise hipotônica de células. Use lupas para garantir dissecção precisa.
   1. Para o tecido recém-dissecados, colocar o cérebro recentemente extraído em uma matriz de corte cerebral (um molde de metal em forma de cérebro de rato com ranhuras para as lâminas de barbear, em intervalos de 1 mm) que foi arrefecida em gelo. Inserir dois ou mais lâminas de barbear pré-refrigerados nas ranhuras para cortar fatias coronais que contêm a região do cérebro (s) de interesse. Coloque a fatia cortada na placa de vidro refrigerado.
      Nota: Dissecar a regio cérebrons de juros sobre uma placa de vidro refrigerada.
   2. Para tecidos congelados após a dissecação, dissecar a região do cérebro (s) de interesse a partir de fatias de cérebro extraído fresco, semelhante ao descrito acima em 2.3.1. Colocar o tecido dissecado em um microtubo e congelar rapidamente o tecido através da submersão do microtubo em -40 ° C durante 20 seg isopentano. Manter o tecido dissecado congelados em todos os tempos em uma ºC congelador -80 até novo processamento.
   3. Para o tecido congelado, congelar imediatamente o cérebro recém-extraído em -40 ºC isopentano e armazenar em um saco selado a -80 ºC por até 6 meses.
      1. No dia da dissecção, colocar o cérebro congeladas em criostato ajustada para aproximadamente -20 ° C (não mais que -18 ° C) durante aproximadamente 2 horas para equilibrar a temperatura.
         NOTA: Cérebros pode ser cortado facilmente a esta temperatura, enquanto que as temperaturas mais frias muito tornar o cérebro demasiado frágil para ser cortada com segurança.
      2. Use lâminas de barbear para cortar 1-2 mm cortes coronais deos cérebros congelados em um criostato. Use uma agulha de 12 a 16 de calibre embotada obter socos de tecido de essas fatias sob condições de congelamento. Manter o tecido congelado dissecado em todos os momentos até ulterior processamento.
4. Adicionar 1 - 2 gotas de tampão A para cobrir o tecido dissecado antes da trituração. Remover a maior parte da matéria branca do tecido com duas lâminas de barbear para evitar a perda de neurónios durante o resto do processo de trituração. Se começando com tecido congelado, em seguida, permitir que o tecido para descongelar sobre a placa de vidro frio para não mais do que 1 minuto antes de aplicar Tampão A solução.
5. Picar o tecido 100 vezes em cada direcção ortogonal com uma lâmina de barbear sobre uma placa de vidro gelada. Segure a lâmina de barbear vertical à placa de vidro, quando picados.
   NOTA: picagem minuciosa é fundamental para todas as etapas do protocolo.
6. Use lâminas de barbear para transferir o tecido moído em tubos de microcentrifuga contendo 1 ml de tampão frio A. Inverter o tubo 3 - 5 vezes para keep todo o tecido picada na solução.

A dissociação 3. celular

NOTA: O uso final mais suave final de mistura para todos os passos seguintes. Não use um misturador de vórtice e evitar bolhas de ar que causam danos às células.

1. Centrifugar os tubos de amostra a 110 g durante 2 minutos a 4 ºC. sobrenadante de descarte. Adiciona-se lentamente 1 ml de solução de enzima recentemente descongelado frio (contendo uma mistura de enzimas proteoliticas) para baixo da parede interior do microtubo. sugar imediatamente backup de todo o sedimento e gentilmente pipeta cima e para baixo apenas 4 vezes com uma pipeta moderadamente grande diâmetro da ponta para dispersar o sedimento de tecido picada.
2. Inverta microtubos imediatamente para evitar que a pastilha se colem ao fundo e incubar as amostras com mistura-sobre-extremidade final durante 30 minutos a 4 ^o C.
3. Após a digestão enzimática do tecido, os tubos de centrifugação a 960 xg durante 2 min a 4 ºC. Remover o sobrenadante e adicionar 0,6 ml de tampão A. frio immediately após a adição do tampão A, use a mesma ponta de pipeta para dispersar o sedimento por sugando todo o sedimento e gentilmente pipeta cima e para baixo 5 vezes.
4. Mecanicamente tritura-se o tecido digerido e recolher em tubos de 15 ml, utilizando os seguintes passos. Para cada amostra, utilizar um conjunto separado de 3 pipetas Pasteur de vidro polido-fogo com descendente diâmetros de cerca de 1,3, 0,8 e 0,4 mm ligados a lâmpadas de látex.
   1. Gentilmente triturar cada amostra 10 vezes com a pipeta de vidro 1,3 mm. Deixe a amostra se contentar com 2 min no gelo (os detritos e células sem dissociar vai assentar no fundo). Recolhe-se o sobrenadante (~ 0,6 ml) e transferir para um tubo de 15 ml (tubo # 1).
   2. Adicionar 0,6 ml de tampão A solução para o sedimento restante. Tritura-se a amostra 10 vezes, com a pipeta de vidro de 0,8 mm. Deixe a amostra se contentar com 2 min em gelo. Recolher o sobrenadante (~ 0,6 ml) e transferir para os mesmos 15 ml cônico tubo # 1.
   3. Adicionar 0,6 ml de tampão A solução para o Pelle restantet. Tritura-se a amostra 10 vezes, com a pipeta de vidro de 0,4 milímetros. Deixe a amostra se contentar com 2 min em gelo. Recolher o sobrenadante (~ 0,6 ml; sem tocar a pelota com células não-dissociada) e transferir para os mesmos 15 ml cônico tubo # 1.
      NOTA: Mantenha a pipeta de diâmetro 0,4 mm de tubo # 1 para os seguintes passos trituration.
   4. Repita o passo 3.4.3 mais três vezes usando a pipeta de vidro menor (~ 0,4 mm de diâmetro), e recolher o sobrenadante para um separadas tubo de 15 ml (Tubo # 2).
   5. Tritura-se as suspensões de células colhidas em tubos # 1 e # 2 para mais de 10 vezes, utilizando a pipeta de vidro de 0,4 milímetros e manter em gelo.

4. celular Fixação e permeabilização

1. Prepare 4 microtubos por amostra (dois microtubos para células do Tubo # 1 e para duas células de tubo 2 #) adicionando 800 ul de etanol frio a 100% (armazenada a -20 ^° C antes da utilização) a cada tubo e mantê-los em gelo . Nota: O final de etanolconcentração será de 50%.
2. Pipeta ~ 800 ul das suspensões de células a partir de tubo (# 1 e # 2 tubo) a cada um dos 4 tubos contendo etanol frio e inverter os tubos para misturar as amostras.
3. Incubar os tubos em gelo durante 15 min, enquanto se invertendo os tubos a cada 5 min.
4. Após a fixação / permeabilização, centrifugar os tubos a 1.700 g durante 4 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Deixar 50 ul de solução para prevenir a perda de células.
   NOTA: As pastilhas, nesta fase, são de cor branca e ficar menos à parede dos tubos que antes permeabilização. Por isso, remover o sobrenadante cuidadosamente por tocar a parede do microtubo, onde não existe um pelete e o sobrenadante elaborar-se lentamente utilizando uma micropipeta.

Filtration 5. celular

1. Re-suspender as pelotas do passo 4.4 com PBS frio como se segue:
   1. Adicionar 550 ul de PBS frio a uma das duas microtubos provenientes do tubo # 1, e usar um moderadamente grande diâmetro pipette dica para pipeta suavemente a suspensão de células para cima e para baixo 5 vezes. Repetir o mesmo para um microtubo vindo do tubo # 2.
   2. Para as células de tubo # 1, utilizando a mesma pipeta, transferir a primeira suspensão de células para a segunda pastilha. Ressuspender o segundo pellet com cuidado pipetando para cima suspensão de células combinadas e para baixo 5 vezes.
   3. Para as células de tubo # 2, ressuspender e combinar as pelotas (ou seja, terceiro e quarto microtubos) tal como descrito em 5.1.2.
2. Filtrar as duas suspensões de células a partir de passos 5.1.2 e 5.1.3 separadamente usando dois pares diferentes de filtros de células (de 100 um e 40 um tamanho de poro) como segue:
   1. Pré-molhado cada filtro de células por adição de PBS para o interior do filtro. Usar uma pipeta para remover o excesso de PBS a partir do exterior do filtro.
   2. Pipetar a suspensão de células a partir do passo 5.1.2 uniformemente sobre o primeiro filtro de células com tamanho de poro de 100 um. Recolhe-se o fluxo através de um tubo de 50 ml em gelo. Use o pipette para recolher o fluxo-ligado através na parte inferior do lado exterior do filtro de células.
   3. Utilizar o mesmo pipeta para transferir o fluxo através do filtro de células de 100 um para o filtro de células de 40 ^ m. Recolha este flow-through em outro tubo de 50 ml em gelo. Ao transferir o fluxo através do filtro 40 mm celular, mudar para novas pontas de pipeta para evitar a contaminação de 100 mm filtro celular.
   4. Repita essas etapas para a suspensão de células a partir do passo 5.1.3, usando um novo conjunto de filtros.
3. Combinar os dois fluxo através de cada amostra para um volume final de cerca de 1 ml por amostra.

6. A incubação com anticorpos

NOTA: Use pequenas alíquotas das suspensões de células do cérebro para preparar várias amostras de controlo para definir o fluxo adequado citômetro configurações antes de executar a amostra principal. Para cada rotulagem de anticorpos, preparar amostras de controlo que incluem não anticorpos, somente a sicundária anticorpo (ou outro marcador fluorescente), e, em seguida, ambos os anticorpos primário e secundário (ou outro marcador fluorescente). Use esses controles para definir as portas que separam específica contra rotulagem não-específica no citômetro de fluxo. Quando possível, use fluorocromos que não exigem compensação. Aumenta o volume final das amostras de controlo de propagação para um volume final de 700 ul por adição de PBS antes da adição do anticorpo primário.

1. Prepare de dispersão de luz e a amostra de controlo, transferindo DAPI uma amostra de 100 ul das células filtradas para um microtubo de 1.7 ml. Adicionar 600 ul de PBS frio com 1 ug / ml de DAPI para a coloração de núcleos. Incubar durante 10 min, com mistura-sobre-extremidade final, e lava-se (tal como indicado nos passos 6.4.2 a 6.4.5) antes de passar através do citómetro de fluxo.
   Observação: Este exemplo é usado apenas para definir o núcleo / gate celular antes de classificar as células restantes na máquina de FACS.
2. Prepare amostras únicas de controle immunolabeled através da transferência de 100 & #181; l das células filtradas para um microtubo de 1.7 ml. Adicionar 600 ul de PBS frio com um anticorpo (por exemplo, anticorpo NeuN). Adicionar 600 ul de PBS frio para um microtubo com outro anticorpo (por exemplo, anticorpo Fos). Adicionar o anticorpo secundário correspondente, se não é um anticorpo primário conjugado directa.
   NOTA: As amostras serão usadas para determinar a tensão de tubo fotomultiplicador apropriado (PMT), e para avaliar a sobreposição dos dois sinais de fluorescência, se necessário. As concentrações de anticorpos deve ser titulada para alcançar os melhores rácios de sinal-ruído em todos os canais. A sobreposição de sinais fluorescentes também pode ser compensado por calibração interna de diferentes canais fluorescentes dentro do citómetro de fluxo.
3. Prepare amostra de controlo negativo fluorescente duplamente marcada pela transferência de 100 ul das células filtrados para um microtubo de 1,7 ml. Adicionar 600 ul de PBS frio, com os anticorpos secundários sozinho ou anticorpos primários direta conjugados IgG.
   NOTA: Thiamostra s controle pode ser usado todas as vezes antes de triagem para determinar a fluorescência de fundo para cada fluoróforo.
4. Prepare amostra principal a ser classificado.
   1. Transferir 700 uL das células filtrada para um microtubo de 1.7 ml. Adicionar 7 l (1: 100) de anticorpo primário Fos conjugados directamente com Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) e 1,4 ul (1: 500) de anticorpo primário NeuN conjugados directamente com ficoeritrina (anti-NeuN-PE). Incubar os tubos durante 30 minutos a 4 ºC com mistura-over-end end.
   2. No final da incubação, adicionar 800 ul de PBS frio a cada microtubo, incluindo a amostra principal e as amostras de controlo, e misturar por inversão.
   3. microtubos centrifugar a 1300 xg por 3 min a 4 ºC. Descartar o sobrenadante, deixando 50 ul de sobrenadante para evitar perda de células.
   4. Adicionar 1 ml de PBS frio para as células pellet e ressuspender utilizando uma pipeta com uma moderadamente grande diâmetro da ponta.
   5. Centrifugar a 1.300 xg durante 3 min a 4 ºC. Discard o sobrenadante.
   6. Re-suspender o sedimento em 500 ul de PBS frio (Ajustar o volume final dependendo do tamanho da pastilha).
   7. Transferência e filtrar a suspensão para um tubo de ensaio de fundo redondo de FACS com um tampão de filtro de células (40 ^ M). Manter as células imunomarcadas em gelo e executar imediatamente FACS. Nota: Para filtragem, toque a ponta da pipeta na vertical sobre a tampa do filtro e empurre a suspensão de células através dele.
5. Definir citômetro de fluxo portões utilizando amostras de controlo.
   1. Use a luz-se espalhando e amostra de controlo DAPI para identificar a população de células neuronais do total de eventos e restos celulares.
      NOTA: Os corpos celulares nesta preparação são apenas 1 - 2% do total de eventos (o resto são detritos e processos celulares quebradas). Com base no sinal fluorescente DAPI (indicando núcleos) e dispersão para a frente (tamanho da célula) é possível localizar corpos celulares e para trás portão com base na frente e o lado de propriedades de dispersão de luzas células (como mostrado na Figura 1 A, B).
   2. Use as amostras únicas de controle immunolabeled para determinar as configurações de tensão PMT, e analisar transbordamento da emissão de um fluorocromo específico em outro filtro / canal (por exemplo, Alexa Fluor 488 / FITC ou ficoeritrina). Se os sinais fluorescentes sobrepor-se, corrigir a sobreposição ajustando os níveis de compensação manualmente.
   3. Use o controle negativo fluorescente duplamente marcada para configurar o limiar para a população positiva.
      NOTA: O sinal proveniente desta amostra é pensado ser devido a auto-fluorescência e as células da amostra principal localizada acima deste limite pode ser considerada como positiva. Normalmente, os parâmetros de limite para classificação são mais rigorosas e aproximadamente o topo 2/3 das células marcadas acima do controlo negativo são realmente ordenados.
6. Separar os neurônios a partir da amostra principal por FACS em 1,7 ml microtubos. Recolher as células em 50 ul de ARNtampão de extracção. Após a triagem, vortex e centrifugar o tubo e misturar a suspensão por pipetagem cima e para baixo 10 vezes para recuperar todas as células classificadas a partir das paredes do tubo.
7. Incubar a suspensão de células ordenada a 42 ºC durante 30 minutos para assegurar que todas as células são lisadas antes da extracção de ARN e, em seguida, centrifugar a 2800 xg durante 2 min a 4 ºC.
8. Transferir o sobrenadante para um tubo livre de ARNase para o armazenamento a longo prazo a -80 ° C ou imediatamente a processar a amostra para o isolamento de ARN, a síntese de cDNA, do gene alvo pré-amplificação e qPCR, como descrito anteriormente ^13-15.

Resultados

Classificando neurônios Fos-positivos e Fos-negativos de tecido dorsal striatum frescos e congelados de ratos individuais após as injeções de metanfetamina agudas.

O protocolo acima descrito foi utilizado para classificar os neurónios positivos e Fos-Fos-negativas a partir de um único rato estriado dorsal 90 minutos depois de uma injecção intraperitoneal de metanfetamina (5 mg / kg). ratos ingênuos em suas gaiolas foram utiliz...

Discussão

FACS pode ser usado para classificar os neurónios e outro tipo de células a partir de qualquer tecido cerebral adulto fresca ou congelada. Como mencionado na introdução, a capacidade de usar tecido congelado permite uma utilização óptima das amostras de animais que tenham sido submetidos a procedimentos comportamentais complexas e prolongadas, como a auto-administração e de recaída estudos em pesquisa vício. Estes procedimentos comportamentais geralmente leva 1-2 horas ou mais tempo, e necessitam de todos os animais (10...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz cerebral	CellPoint Scientific	69-2160-1	para obter fatias de cérebro coronal
Hibernar A baixa fluorescência	Brain Bits	HA-lf	Buffer A no protocolo é usado para processar tecidos e células da dissociação às etapas de fixação
Accutase	Millipore	SCR005	A solução enzimática no protocolo é usada para digestão enzimática do tecido antes da trituração
Tubo de Proteína LoBind 1.5 ml, PCR clean	Eppendorf	22431081	para prevenir a perda de células durante o protocolo
Cell Strainer, 40 µ m	BD Falcon	352340	para filtrar a suspensão de células
Cell Strainer, 100 µ m	BD Falcon	352360	para filtrar a suspensão celular
Falcon Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 ml com tampa de pressão do filtro de células	BD Bioscience	352235	filtrar a suspensão celular antes de passar pelo citômetro de fluxo
Pasteur Pipet, Glass	NIH fornece	6640-00-782-6008	para fazer trituração de tecidos
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (monoclonal de camundongo)	anticorpo EMD Millipore	FCMAB317PE	anticorpo para detectar neurônios
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)	Tecnologia de Sinalização Celular	8677	anticorpo para detectar células que expressam Fos
DAPI	Sigma	D8417	para rotular núcleos
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	O kit inclui o tampão de extração de RNA para a etapa 6.14. É usado para coletar células classificadas
Superscript III sistema de síntese de cDNA de primeira fita	Invitrogen	18080-051	para sintetizar cDNA do RNA
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	fazer pré-amplificação direcionada a partir do cDNA
TaqMan Advance Fast Master	Biossistemas Aplicados.	4444963	fazer PCR usando sondas TaqMan
Fos TaqMan sonda	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	sonda TaqMan/primers
NeuN sonda TaqMan	Applied Biosystems.	CACTCCAACAGCGTGAC	para marcador de gene neuronal
NeuN Primer direto	Applied Biosystems.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	para marcador de gene neuronal
NeuN Primer reverso	Applied Biosystems.	TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	para marcador de gene neuronal
Gfap sonda TaqMan	Applied Biosystems.	Rn00566603_m1	sonda / primers TaqMan para marcador genético astrocityc
iba-1 sonda TaqMan	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	sonda / primers TaqMan para marcador genético de microglia
Gapdh< / em> sonda TaqMan	Applied Biosystems.	CTCATGACCACAGTCCA	para referência/manutenção gene
Gapdh Primer direto	Applied Biosystems.	GACAACTTTGGCATCGTGGAA	sequência de nucleotídeos para referência / manutenção gene
Gapdh< / em> Primer reverso	Applied Biosystems.	CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA	para referência/manutenção gene
Oligo2 sonda TaqMan	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	Sonda/primers TaqMan para marcador genético oligodendrocítico
Pipetador P1000	Rainin	17014382	É referido como a pipeta com um grande diâmetro de ponta nas etapas 3.1 e 3.3 para trituração de tecido leve e na etapa 6.7 para ressuspender células
7500 Sistema de PCR rápido em tempo real	Applied Biosystems.	446985	para PCR quantitativo
FACSAria I Cell Sorter	BD Biosciences		para classificação FACS