Técnicas confiáveis e eficientes para o isolamento de células imunes renais são necessárias para aplicações a jusante. Isso requer a marcação de anticorpos de superfície de um pequeno número de células imunes renais. Aqui, descrevemos um método conciso para isolamento de células imunes renais que aparentemente atinge esse objetivo.
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Artigo de método
Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes
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Resumo
Resumo
A ativação do sistema imunológico ocorre em múltiplas doenças renais e processos fisiopatológicos. O sistema imunológico consiste em componentes adaptativos e inatos e vários tipos de células. Às vezes, o tipo de célula de interesse está presente em números muito baixos entre o grande número de células totais isoladas do rim. Portanto, o isolamento confiável e eficiente de populações de células mononucleares renais é importante para estudar os problemas imunológicos associados às doenças renais. Tradicionalmente, o isolamento tecidual de células mononucleares renais tem sido realizado por meio de digestão enzimática usando diferentes variedades e forças de colagenases / DNAses, produzindo números variados de células imunes viáveis. Recentemente, com o desenvolvimento dos disruptores mecânicos teciduais para isolamento de célula única, a etapa de digestão da colagenase é evitada e substituída por uma simples ruptura mecânica dos rins após a extração do camundongo. Aqui, demonstramos um método simples, mas eficiente, para o isolamento de células mononucleares renais para extrações diárias de células imunológicas. Além disso, demonstramos um exemplo de análise de subconjunto de células imunes no rim. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada a outros tecidos moles e não fibrosos, como fígado e cérebro.
Introdução
A activação do sistema imunitário ocorre em várias doenças renais e processos patofisiológicos 6,10,11,13. As áreas potenciais de investigação activa abranger os vários disparadores para a activação do sistema imunológico, vários tipos de células envolvidos, o padrão de citocinas / quimiocina num ambiente doença em particular, a modulação de todos os processos acima mencionados por um determinado medicamento, etc. Para exemplificar, na isquemia-reperfusão lesão (um modelo de lesão renal aguda), há um aumento em células imunitárias ou de medula óssea derivada de células hematopoiéticas ou CD45 + células dentro de algumas horas, que é sustentado ao longo do período de conservação ou fibrose (6 semanas mais tarde) 5, 12. Estas células imunitárias segregam ambas as citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias e quimiocinas para orquestrar o processo de reparação 5,12. Actualmente, a capacidade para utilizar vários fluoróforos simultaneamente para rotular populações de células numa suspensão de células individuais aumentou com o anúncioventilação de fluxo moderno citometria de máquinas com quatro a cinco lasers. Isto tem substancialmente adicionada à capacidade para discriminar as populações de células com base no seu estado funcional 3,7. Por exemplo, ao etiquetar com precisão um macrófago como F4 / 80 Baixo Alto Alto CD206 Ly6b CD11b baixa, pelo menos mais 3 fluoróforos seria necessário no mesmo volume de amostra a porta para as células vivas, CD45 + (leucócitos) e Ly6G- (neutrófilos) e isso é muito possível com o novo fluxo Citómetros 3. No entanto, os ensaios a jusante para a secreção de citoquina, proliferação celular, a citotoxicidade, a activação de macrófagos e a quantificação dos números de vários subconjuntos de linfócitos e monócitos não só precisa de boa qualidade (células vivas, singuletos) mas um número adequado de células.
O sistema imunológico no rim, é constituído por dois componentes de adaptação e inatas e vários tipos de células 1,7,13. Por exemplo, em ratinhos a dois miúdo+ células Neys juntos são relatados para conter 2-17% (28,000-266,000) CD45 das células do sistema imune de rim total isolado (1,4 x 10 6 células) e cerca de 5-15% (1,400-4,200) destes são células CD4 + 1 , 5,12. Uma pequena percentagem (5-15%, 70-630) destas células CD4 + são FoxP3 + células (Figura 1) 1. Devido a estas etapa reduções sábios em percentagens de células, por vezes, a população de células de interesse (neste caso CD45 + CD4 + Foxp3 + células) é representado por um simples ~ 100 células. O pequeno número de CD45 + CD4 + células FoxP3 + torna imperativo que um grande número de células totais são isoladas e as células são de boa qualidade para estudos a jusante, tais como ensaios de secreção de citocinas. Além disso, pode ser necessário combinar rins 2-3 murganhos uma vez que as subpopulações não são representados em número suficiente altos para realizar ensaios quantificáveis. Por isso, o isolamento fiável e eficaz de populações de células mononucleares do rim é desejável, a fim de estuy o espectro imunológicas associadas com doenças renais.
Tradicionalmente, para o isolamento de células mononucleares de rim, os investigadores têm usado uma variedade de digestões enzimáticas, tais como a colagenase 1A ou II, incluindo ADNase 1 1,5,12. É bem sabido que as colagenases têm actividade enzimática que varia de acordo com os números de lote e pela empresa de fabrico, necessitando de titulação para a concentração óptima e a duração da incubação 4,14,15. Além disso, a digestão com colagenase adiciona tempo para picagem do rim em pedaços pequenos, requer a incubação dos pedaços de rim em A (37 ° C), banho de aquecimento e um tempo adicional para a incubação em EDTA para parar a reacção. Além disso, a menos que a esterilidade pode ser conseguido por alguns processos a jusante que necessitam de cultura de células. Mais importante ainda, dependendo do investigador e todas as variáveis envolvidas, que conduz a variabilidade dos dados e interpretação entre laboratórios. Recentemente, com adesenvolvimento de tecido mecânicos / disruptores homogeneizadores 16, a etapa de digestão de colagenase é completamente evitados e substituídos por uma ruptura mecânica simples dos rins 2. Aqui, nós demonstramos um método simples mas eficaz para o isolamento de células do sistema imunológico nos rins para extrações de células imunes diárias. Mais importante, esta técnica pode ser adaptado para outros tecidos moles e não fibrosos, tais como o fígado e o cérebro 16.
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Protocolo
Todos os passos de protocolo realizados foram revistos e aprovados pela Universidade de Missouri Animal Care e do Comitê Use (ACUC). Para este protocolo, foram utilizados ratos machos C57BL / 6 machos com idade de 15 semanas, embora teoricamente qualquer roedor em qualquer idade pode ser utilizado para experiências. Uma vez que, esta é uma cirurgia não sobrevivência, a eutanásia é conseguido por exsanguinação e pneumotórax bilateral.
1. Perfusão dos Rins
Nota: A perfusão de órgãos tais como coração, fígado e rim remove o sangue que possam interferir com a interpretação dos dados. Assim, se possível, sempre perfundir os órgãos.
- Posicione o mouse em uma isoflurano (3 ml / min) câmara de indução até que seja imóvel. Em seguida, remova o mouse para fora da câmara, colocá-lo dorsal na mesa de dissecação e coloque o cone isoflurano no nariz mouse e empurrar isoflurano a uma taxa de 1,5 ml / min através do regulador.
- Confira os respons toe pitadae com uma pinça para avaliar se o animal ter atingido um plano cirúrgico de anestesia. Limpe o abdômen ventral com solução salina e cortar abrir o abdômen com uma tesoura e empurre os órgãos abdominais (fora do campo cirúrgico) para o lado esquerdo do mouse.
- Recolha de sangue a partir da veia cava inferior, com uma agulha de calibre 25-fixo a uma seringa de 1 cc e adicioná-lo para um tubo de microcentrífuga de 1.5 ml contendo 10 ul de 0,5 M de EDTA.
Nota: A coleta de sangue é opcional. O plasma pode ser utilizado para medições bioquímicas. Os leucócitos podem ser utilizadas para ensaios de citometria de fluxo. - Com uma tesoura, faça um pequeno corte nos átrios direito para deixar sair a mistura de sangue e PBS a partir da próxima etapa.
- Dê uma seringa de 50 cc e encher com PBS gelado (20-30 cc). Em seguida, anexar uma agulha G 21-25 à seringa, perfurar o ventrículo esquerdo em seu ápice (enquanto segura o coração delicadamente entre fórceps) e, lentamente, perfundir do ventrículo esquerdo com tampão fosfato pH 7,4 solução salina (PBS) durante o cursode 1-2 minutos.
Nota: O coração blanches imediatamente após os primeiros mililitros de perfusão. Observar o fígado para o branqueamento, como isso indica que a drenagem está a perfusão de sangue para fora do fígado através de retorno venoso através da veia cava. Além disso, certifique-se de que os pulmões não estão se expandindo durante a infusão, pois isso indica punção do ventrículo direito. Se os pulmões foram para expandir, retirar a agulha ligeiramente para trás para o ventrículo esquerdo e continuar a perfusão. O tempo levado desde a primeira incisão até que a eutanásia é conseguido é inferior a 2 min
2. Dissecção da Rins
- Após a perfusão for concluída, usar tesouras e pinças para dissecar o rim direito aos seus anexos (vasos sanguíneos, gordura e glândulas supra-renais) e sobre o consumo.
- Remova cuidadosamente a cápsula que cobre o rim através do corte e dissecando com uma pinça. Pesa-se o rim.
Nota: Pesando o rim é opcional. No entanto, algumas experiênciaspode resultar na alteração do tamanho / peso, que pode ser usada para normalizar rendimento das células por grama de tecido renal. - Depois de pesar o rim, colocá-lo em 1 ml de meio RPMI-1640 contendo FBS a 0,5% ou citometria de fluxo solução tampão de coloração (50 ml de rosca cónica de tubo de tampa) e colocar o tubo em gelo até à sua utilização.
Nota: Para facilidade de descrição, vamos descrever o resto do isolamento das células do sistema imunológico na citometria de fluxo solução tampão de coloração. Além disso, iremos descrever o isolamento de células do sistema imunológico de um único rim, embora ambos os rins ou 1 + 1/3 Rd dos rins podem ser usados dependendo das experiências a jusante (opcionais). 1/3 do rim poderia ser congelada para experiências de proteína / ARN e 1/3 podem ser colocados nos buffers para microscopia de imuno-histoquímica ou de transmissão de electrões.
3. A homogeneização dos Rins
- Rotular um 5-80 ml saco de capacidade de homogeneização com a amostra de dados de identificação,remover o filtro para dentro (STR) e descartá-lo. Encher o saco com 5 ml de solução gelada de Citometria de Fluxo A coloração Tampão e transferir para o buffer de rim. Repita esse processo para uma segunda amostra ou mais amostras que precisam de processamento.
- Dobrar o saco de homogeneização no meio, de tal modo que uma metade tem o rim submerso na solução de tampão de citometria de fluxo de coloração e a outra metade é simplesmente dobrada sobre ela.
- Ligue o homogeneizador de tecidos e configurá-lo para rápida (configuração) rpm. Coloque o saco de homogeneização dobrado com o rim de frente para a parede, perto da borda inferior, mas certifique-se a extremidade inferior dos sacos não estão deslizando abaixo da borda inferior das pás.
- Processar a segunda amostra, simultaneamente, como há 2 pás. Selecione o tempo como 120 segundos. Observe as pás se mover para trás e para homogeneizar os rins.
Nota: Entretanto, este tempo de inactividade pode ser usado para preparar mais duas renal (ou outro tecido) amostras enquanto os dois primeiros são o processamento.
- Processar a segunda amostra, simultaneamente, como há 2 pás. Selecione o tempo como 120 segundos. Observe as pás se mover para trás e para homogeneizar os rins.
- Depois de completar com o primeiro conjunto de homogeneização, transferir os sacos de gelo e recarregar o homogeneizador de tecido com o próximo conjunto de amostras e assim por diante. Visualmente garantir que os rins são adequadamente homogeneizada e há pedaços grandes são visíveis.
Nota: Em geral, durante 2 min com o homogeneizador de tecidos em rápida rpm é adequada para o rim. - Coloque um filtro de células de 100 um para o tubo de 50 ml em gelo. Em seguida, pipeta-se o homogeneizado completamente para o filtro de células. Situado numa centrífuga andar a 50 xg durante 1 min a 4 ° C e carregar as amostras para a centrífuga.
Nota: A centrifugação vai assegurar que todos os homogenatos (contendo células) ter passado através do filtro de células. - Retire os tubos da centrífuga e colocá-los novamente em gelo. Elimine os filtros de células e manter o homogeneizado. Adicionar um volume igual (~ 6 ml) de tampão de lise 1x RBC para a pelete de células / sobrenadante e pipeta cima e para baixo várias vezes para fazer uma suspensão de células uniforme. Visually, observar alguma da cor vermelha na diminuição suspensão imediatamente. Deixe os tubos em gelo durante 5 min para atingir o máximo de lise RBC.
Nota: o passo de lise RBC pode ser ignorado se o investigador está confiante da perfusão renal e menos manipulação de células é desejada. Temos observado um aumento significativo no rendimento de células de rim, não sujeitando a suspensão de células a lise de glóbulos vermelhos. - Girar os tubos na centrífuga que tenha sido definido a 500 xg, a 4 ° C durante 5 minutos para formar um sedimento celular.
Nota: Durante as etapas 3.6 e 3.7, se preparar para sílica coloidal (Percoll) com base gradiente de densidade de centrifugação.- Tome 10 ml redondas tubos de polipropileno de fundo e rotulá-los com números de amostragem correspondentes e colocá-los num suporte de tubos.
Nota: O seguinte descreve como fazer reagentes gradiente de densidade suficiente para 4 amostras de rim. - Tome 7 ml de solução de Citometria de Fluxo A coloração de buffer e pipeta-lo em um tubo de 15 ml. Adicionar 1 ml de sacarose a 2 Mpreparar a 0,25 M de sacarose.
- Em seguida, tomar 7,2 ml de reagente de gradiente de densidade e pipeta-lo em outro tubo de 15 ml. Adicionar 1,55 ml de solução tampão de citometria de fluxo de Coloração e 1,25 ml de 2 M de sacarose para preparar a 72% de reagente de gradiente de densidade e 0,25 M de sacarose.
- Pipeta de 1 ml de 72% de reagente de gradiente de densidade em uma única rodada tubo de polipropileno de fundo para cada amostra.
- Tome 10 ml redondas tubos de polipropileno de fundo e rotulá-los com números de amostragem correspondentes e colocá-los num suporte de tubos.
4. Centrifugação Gradiente
- Após o passo 3.7, tirar os tubos de fora e suavemente decantar o sobrenadante em um movimento suave e também decantar a próxima gota de líquido que se forma quando o tubo é realizada de cabeça para baixo.
Nota: Este passo é importante, uma vez deixando para trás o excesso de líquido pode mudar o gradiente de densidade suficiente para criar variação nos rendimentos. Quando o tubo é um retrocesso na posição vertical, ~ 200-300 mL de líquido permanece com o pellet celular. - Pipeta de 1 ml de 0,25 M de sacarose para o pellet celular e suavemente, mas vigorosamente pipeta cima e para baixo para bring para as células de uma suspensão uniforme. Em seguida, adicionar a suspensão de células a 1 ml de 72% de reagente de gradiente de densidade (3.7.4) e mais uma vez pipetar vigorosamente para misturar as células para formar um reagente de gradiente de densidade de 36%.
- Tomar 1 ml do reagente de gradiente de densidade de 72% para um polipropileno Pasteur (transferência) da pipeta. Com uma pressão uniforme sobre o bolbo (mantém a coluna de líquido na ponta e impede a formação de bolhas), inserir a pipeta de Pasteur para a parte inferior da suspensão de células (36% de reagente de gradiente de densidade) suavemente e descarregar o reagente de gradiente de densidade de 72% para formar uma camada mais pesada distinta.
- Escolher os tubos de amostra suavemente e colocar no centrifugador, o qual está à temperatura ambiente para este passo. Rotação durante 20-30 min a 500 x g.
- Enquanto isso, prepare mais dois conjuntos de polipropileno rodada tubos de centrífuga de fundo com os identificadores de amostragem correspondentes.
- Após o passo 4.4 estiver concluída, remova a amostra contendo tubos de polipropileno suavemente, com agitação mínima e configurá-lo para baixono suporte de tubos.
- Pegar o primeiro tubo de amostra e seu tubo vazio correspondente. Com uma pipeta de polipropileno Pasteur, suave mas completamente com sucção medida, retire o "camada de lixo" superior ou "materiais pegajosos" e colocá-lo dentro do tubo inferior centrífuga rodada vazio.
- Continuar a remoção da parte superior do gradiente até o "buffy coat" é atingido (pode aparecer esbranquiçado com um tom avermelhado [glóbulos vermelhos]). Pare de aspiração, se uma altura de ~ 3 mm é alcançado a partir do "buffy coat".
Nota: Certifique-se de que este material é completamente desaparecido da parte superior do gradiente antes de continuar a sucção.
- Continuar a remoção da parte superior do gradiente até o "buffy coat" é atingido (pode aparecer esbranquiçado com um tom avermelhado [glóbulos vermelhos]). Pare de aspiração, se uma altura de ~ 3 mm é alcançado a partir do "buffy coat".
- Tome uma pipeta Pasteur fresco e um tubo inferior centrífuga nova rodada e retire cuidadosamente o creme leucocitário. Continue a sucção 3 - 5 mm abaixo da buffy coat, para garantir que a maioria das células são recolhidos e adicionados ao tubo de fundo redondo de 2 nd novo com o identificador de amostra apropriada.
- Adicionar 1-2 ml osolução f Citometria de Fluxo Coloração Buffer para o tubo 2 nd e misture bem por pipetagem cima e para baixo.
- Girar as células a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. A etapa de lavagem 2º com uma solução de Citometria de Fluxo A coloração de buffer é opcional. Ressuspender em 500 ml de solução de Citometria de Fluxo A coloração de buffer e proceder à contagem de células usando um hemocitômetro.
5. Opcional (Labeling celular)
- Aliqout cada amostra para o mesmo número de células. Adicionar o anticorpo bloqueador a uma diluição de 0,5 ug por 10 6 células (CD16 anti-/ CD32 FcR) e incubar em gelo durante 15 min.
- Adicionar o cocktail desejado de anticorpos primários (conjugados com os fluoróforos adequados) que são determinados a trabalhar bem uns com os outros pelo investigador, antes das experiências reais. Incubar em gelo durante 30 min. Lavam-se as células com PBS.
Nota: Para a demonstração de rotulagem de células imunes rim para este manuscrito, foi utilizado um T-lymphocyte e / painel da célula dendrítica macrófagos. O painel de linfócitos T consistia em fixável Viabilidade Stain FVS510, anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (clone: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (clone RM4-5) de APC-Cy7, anti-CD8 (clone 53-6,7) BV785. O painel de macrófagos consistiu em fixável Viabilidade Stain FVS510, anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC, anti-CD11b (Clone: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti- APC, Anti-CD11c (Clone: N418): / 80 (BM8 Clone) F4 BV785. - Adicione o fixável Viabilidade Stain e deixar no banco-top por 5 min. Lavam-se as células com solução de coloração de citometria de fluxo tampão para remover o excesso do fixável Viabilidade mancha.
- Adicionar Fixation reagente / permeabilização e incubar durante a noite a 4 ºC. Lave em solução de permeabilização.
- Para mancha intracelular, bloquear novamente com anti CD16-/ 32 FcR por 10min. Adicionar as manchas intracelulares e incubar por 20-30 min. Lavar 2x em epsolução rmeabilization.
- Ressuspender em amostras de solução e execução Citometria de Fluxo A coloração de buffer através de FACS máquina de 3,9.
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Resultados
O número de painéis que podem ser executados depende do número de células imunes que podem ser extraídos de forma fiável dos rins. Aqui, nós demonstramos a capacidade de executar 2 painéis, um para linfócitos T e outra para macrófagos células / dendríticas. No painel de linfócitos T, primeiro olhar para a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral padrão (SSC) e delinear a população de interesse, como mostrado na Figura 1 (gráfico de pontos superior esquerdo). Em ...
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Discussão
Nós apresentamos aqui uma metodologia para obter células imunes de rim de forma confiável e eficiente. A modificação principal para a etapa de digestão de colagenase amplamente utilizado (disrupção mecânica do tecido) economiza cerca de 30 min e o isolamento de um grande número de células viáveis imunes demora menos de duas horas para 4 amostras de rim. Além disso, dependendo da nossa questão de pesquisa, que agora só usar um único rim (o outro rim pode ser utilizado para a análise de proteínas por manchas de Western,...
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado por uma bolsa de pesquisa da Dialysis Clinics Inc. e da University of Missouri Research Board Grant.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de laboratório Stomacher 80 Biomaster | Seward | ||
| Stomacher 80 Bolsas clássicas | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Ou equipamento equivalente | |
| Hemocitômetro | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Citômetro de fluxo analítico | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Tubos de polipropileno, sem tampa | Becton Dickinson | 352002 | |
| Mancha de Viabilidade Fixável | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μ Filtro M | Tubos Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand 50 ml | Fisher | Ou equipamento equivalente | |
| Tubos Fisherbrand 15 ml | Fisher | Ou equipamento equivalente | |
| Sucarose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Pipeta de transferência ponta fina | Samco Scientific | 232 | Ou equipamento equivalente |
| Solução Tampão para Coloração por Citometria de Fluxo | EBioscience | 00-4222-26 | Ou equipamento equivalente |
| 1x Tampão de Lise RBC | EBioscience | 00-4333-57 | Ou equipamento equivalente |
Referências
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Reimpressões e permissões
