Engenharia genética de um fermento Unconventional para Renewable Biofuel e Produção Biochemical

Ai-Qun Yu; Nina Pratomo; Tee-Kheang Ng; Hua Ling; Han-Saem Cho; Susanna Su Jan Leong; Matthew Wook Chang

doi:10.3791/54371

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Artigo de método

Engenharia genética de um fermento Unconventional para Renewable Biofuel e Produção Biochemical

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DOI:

10.3791/54371

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20 de setembro de 2016

Ai-Qun Yu¹^,² , Nina Pratomo¹^,² , Tee-Kheang Ng¹^,² , Hua Ling¹^,² , Han-Saem Cho¹^,² , Susanna Su Jan Leong¹^,²^,³ , Matthew Wook Chang¹^,²

¹Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, ³Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

Relatamos métodos sobre a manipulação genética molecular da cepa Yarrowia lipolytica Po1g para melhorar a eficiência da deleção de genes. As cepas de Y. lipolytica resultantes têm aplicações potenciais na produção de biocombustíveis e bioquímicos.

Resumo

Yarrowia lipolytica é um não-patogênicos, dimorfismo e estritamente aeróbias espécies de leveduras. Devido às suas características fisiológicas distintas e características metabólicas, esta levedura não convencionais é não só um bom modelo para o estudo da natureza fundamental de diferenciação de fungos, mas é também uma plataforma microbiana promissora para a produção bioquímica e diversas aplicações biotecnológicas, os quais requerem extensivas manipulações genéticas. No entanto, as manipulações genéticas de Y. lipolytica ter sido limitado devido à falta de um sistema de transformação genética eficiente e estável, bem como muito elevadas taxas de recombinação não homóloga que pode ser atribuída principalmente ao gene Ku70. Aqui, descrevemos um protocolo fácil e rápido para a transformação genética eficiente e para a deleção do gene em Y. lipolytica Po1g. Em primeiro lugar, um protocolo para a transformação eficiente do ADN exógeno em Y. lipolytica Po1g foi estabelecida. SecoND, para atingir a taxa de recombinação homóloga de dupla permutação reforçada para posterior eliminação de genes alvo, o gene Ku70 foi eliminado por transformação de uma cassete de disrupção transportando 1 kb braços de homologia. Em terceiro lugar, para demonstrar a eficiência deleção do gene reforçada após a eliminação do gene Ku70, nós apagadas individualmente 11 genes alvo que codificam álcool desidrogenase e álcool oxidase utilizando os mesmos procedimentos sobre a tensão Ku70 plataforma nocaute. Observou-se que a taxa de recombinação homóloga precisa aumentou substancialmente de menos de 0,5% para eliminação do gene Ku70 em Po1g a 33% -71% para a deleção do gene único dos 11 genes-alvo em Po1g Ku70 Δ. Um plasmídeo replicativo que transporta o marcador de resistência a higromicina B e o sistema Cre / LoxP foi construído, e o gene marcador de selecção nas estirpes knockout de levedura foi finalmente removido por expressão da recombinase Cre para facilitar a múltiplas rondas de targeted manipulações genéticas. Os mutantes de deleção de um único gene resultantes têm potenciais aplicações em biocombustíveis e produção bioquímica.

Introdução

Ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, uma levedura convencional, pode crescer sob a forma de levedura ou micélio em resposta a alterações das condições ambientais ^1,2. Assim, esta levedura dimorphic pode ser usado como um bom modelo para o estudo da diferenciação fúngica, a morfogénese e ^3,4,5 taxonomia. É geralmente considerada como uma espécie de levedura seguros (GRAS), que é amplamente utilizado para produzir uma variedade de aditivos alimentares, tais como ácidos orgânicos, poli-álcoois, compostos de aroma, agentes emulsionantes e agentes tensioactivos ^6,7,8,9. É um aeróbio obrigatório e....