Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Summary

O método Tandem Affinity Purification (TAP) tem sido amplamente utilizado para isolar complexos nativos de extrato celular, principalmente eucariótico, para proteômica. Aqui, apresentamos um protocolo do método TAP otimizado para purificação de complexos nativos para estudos estruturais.

Abstract

abordagens de purificação por afinidade foram bem sucedidos em isolar complexos nativas para a caracterização proteômica. heterogeneidade estrutural e um grau de heterogeneidade de composição de um complexo não costumam impedir o progresso na realização de tais estudos. Em contraste, um complexo destinado a caracterização estrutural deve ser purificado num estado que é tanto em termos de composição e estruturalmente homogénea, bem como a uma concentração mais elevada do que o necessário para proteómica. Recentemente, tem havido avanços significativos na aplicação da microscopia de electrões para a determinação da estrutura de grandes complexos macromoleculares. Isso tem aumentado o interesse em abordagens para purificar complexos nativas de qualidade e quantidade suficiente para a determinação estrutural por microscopia eletrônica. O método Tandem Affinity Purification (TAP) foi otimizado para extrair e purificar a 18 subunidade, ~ 0,8 Mda montagem ribonucleoprote�a a partir de levedura de brotamento (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

Muitos processos celulares importantes são realizadas por grandes complexos de proteínas e de ARN-proteína ^1. Um gargalo significativo para a realização de estudos biofísicos e estruturais destes complexos é a sua obtenção de uma qualidade adequada (isto é, a homogeneidade) e numa concentração adequada. Isolamento de um complexo a partir de uma fonte nativa tem muitas vantagens, incluindo a retenção de modificações pós-transcricionais e / ou traducionais relevantes de subunidades e segurar a montagem complexa adequada. No entanto, grandes complexos celulares estão frequentemente presentes em uma célula de um número de cópias baixo e a purificação ....

Protocol

Nota: O seguinte protocolo foi concebido para a purificação de um complexo a partir de 4 L de cultura de células, aproximadamente 40 g de peso molhado de células. Uma vez preparada, todos os tampões devem ser armazenadas a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês da sua preparação. Redutores inibidores de protease e agente são apenas adicionados aos buffers imediatamente antes da utilização.

1. Preparação do extracto celular total para purificação de afinidade em tandem

1. Crescimento de S. células cerevisiae
   1. Streak a TAP desejado marcado S. cerevisiae do armazenamento (-80 ° C) em uma dextrose de levedu....

Results

Um método TAP modificado foi usado para purificar a partir de S. cerevisiae U1 snRNP, um complexo ribonucleoproteico-18 subunidade. Uma purificação inicial da TAP complexo seguindo o protocolo publicado ^2,3 produziu um complexo que apareceu heterogénea, que migra como três bandas sobre um gel de poliacrilamida corado com prata nativa (Figura 2A). Múltiplos ciclos de optimização do método TAP, produziu um complexo que migrou como uma única banda, princ.......

Discussion

O método TAP utiliza duas marcas que equilibram a necessidade de rigorosa e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. Além disso, a TAP indivíduo com etiquetas ORFs estão disponíveis a partir de uma fonte comercial, de modo que pode obter-se qualquer estirpe de levedura com uma proteína etiquetada po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cepa marcada com S. cerevisiae TAP	Open Biosystems	YSC1177	Esta é a cepa de levedura primária usada para desenvolver o protocolo TAP. Seu fundo é S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2Δ 0, met15Δ 0, ura3Δ 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Moedor de café	Mr. Coffee	IDS77	Usado para hemocitômetro de lise celular
, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Usado para avaliar a lise celular
JA 9.100 rotor de centrífuga	Beckman Coulter, Inc.		Usado para colher as células de levedura
JA 20 rotor de centrífuga de ângulo fixo	Beckman Coulter, Inc.		Usado para limpar o extrato celular de material celular não solúvel
Ti 60 rotor de centrífuga de ângulo fixo	Beckman Coulter, Inc.		Usado para limpar ainda mais o extrato de célula solúvel
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Agitador controlado por temperatura
Sistema de gel Novex	Thermo Fisher Scientific
Resina IgG	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6
resina Calmodulin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Resina de afinidade
Coquetel de inibidores de protease, mini comprimidos	Sigma Aldrich	589297	Mini comprimidos completos ultra sem EDTA
Coquetel de inibidores de protease, comprimidos grandes	Sigma Aldrich	5892953	comprimidos completos ultra livres de EDTA
Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)			Dissolvido em isopropanol
2 ml Coluna Bio-spin	Bio-Rad Laboratórios, Inc.	7326008	Usado para embalar e lavar a resina Calmodulin
10 ml poly-prep column	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Usado para embalar e lavar a resina IgG
Pré-moldada nativa PAGE Bis-Tris géis	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% de géis de poliacrilamida pré-moldados
Padrão de proteína NativeMark	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Padrão de proteína não corada usado para PAGE nativo. Carga 7.5 μ l para um gel manchado de prata e 5 μ l para um gel manchado com rubi SYPRO
Pré-moldado SDS PAGE Bis-Tris géis	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% de géis de poliacrilamida pré-moldados
Padrão de proteína PageRuler	Thermo Fisher Scientific	26614	Padrão de proteína não corada usado para Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP anticorpo	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Anticorpo primário contra etiqueta CBP
Anticorpo secundário	Thermo Fisher Scientific	31341	Fosfatase alcalina anti-coelho conjugada
BCIP/NBT	de cabra Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitro azul tetrazólio
Unidades de diálise	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer mini unidades de diálise
Unidades de filtro centrífugo, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Unidade de filtro centrífugo Ultra-0.5 com membrana Ultracel-100
Grânulos absorventes de detergente	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 absorventes
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Corante fluorescente para coloração de ácido nucleico, ao detectar com SYPRO Ruby presente, use comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 532 nm
SYPRO	Ruby Molecular Probes	S-12000	Corante fluorescente para coloração de proteínas, ao detectar com SYBR Green II presente, use comprimento de onda de excitação de 457 nm e comprimento de onda de emissão de 670 nm
Grades de cobre	Microscopia eletrônica Ciências	G400-CP