Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

Resumo

Um método de polimorfismo de fragmentos de reacção em cadeia da polimerase restrição melhorado para genotipagem espécies pufferfish por cromatografia / espectrometria de massa líquida é descrito. Uma coluna de sílica de fase inversa monólito é empregue para a separação de fragmentos amplificados digeridos. Este método pode elucidar as massas monoisotópico de oligonucleótidos, que é útil para identificar a composição de base.

Resumo

Uma versão melhorada de um método para a genotipagem de espécies tóxicas pufferfish por espectrometria de massa de cromatografia / ionização por electrospray líquida (LC / ESI-MS) de reacção em cadeia da polimerase (PCR) fragmento -restriction polimorfismo de comprimento (RFLP), está descrito. a extracção do ADN é realizada utilizando um estojo de extracção de ADN à base de membrana de sílica. Após a amplificação por PCR utilizando um tampão de PCR livre de detergente, as enzimas de restrição são adicionados à solução sem purificar a solução da reacção. Uma coluna de sílica monólito de fase inversa e uma transformação de Fourier espectrómetro de massa de alta resolução com um analisador de armadilha Kingdon modificada são utilizados para a separação e detecção, respectivamente. A fase móvel, que consiste em mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol 400, trietilamina 15 mM (pH 7,9) e metanol, é entregue a um caudal de 0,4 ml / min. O tempo de ciclo para a análise / ESI-MS LC é de 8 min incluindo equilíbrio da coluna. software Deconvolution ter um isótopo modelo de distribuição of o oligonucleótido é utilizado para calcular a massa monoisotópica correspondente do espectro de massa. Para a análise de oligonucleotídeos (variação de 26-79 nucleótidos), precisão de massa foi de 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) e excelente exatidão e precisão foram mantidas por 180 horas sem o uso de um padrão de massa de bloqueio.

Introdução

Espectrometria de massa (MS) é uma tecnologia aceite para identificação rápida e fiável de ácidos nucleicos, de laser assistida por matriz dessorção / ionização (MALDI) e ionização por electrospray (ESI) a ser utilizado para ionização ^1,2. A técnica MALDI é tipicamente combinado com um tempo de voo com analisador (TOF); No entanto, a aplicação de MALDI-TOF MS está limitada a oligonucleótidos curtos (~ 25 nucleótidos (nt)) devido à fragmentação posterior, formação do aduto e baixa eficiência de ionização de ^1,2. Em contraste, a ESI é aplicável a oligonucleótidos mais longos (> 100 nt), mas muitos estados de carga múltipla de iões carregados ([M-NH] ^n-) são produzidos simultaneamente de biomacromoléculas e, por conseguinte, a massa do analito pode exceder o máximo limite da gama m / z do espectrômetro. Isto requer a interpretação dos espectros convoluta, ou seja, a transformação de uma série estado de carga na massa correspondendovia deconvolução.

No caso da medição de massa de uma molécula pequena, o pico da massa monoisotópica, ou seja, a massa da molécula contendo apenas o isótopo mais comum de cada elemento é o mais abundante e observada naturalmente ^3. Como o peso molecular aumenta, os deslocamentos de distribuição isotópica para maior m / z e o pico monoisotópico é obscurecida pelo ruído de linha de base ^3-5. Uma vez que o pico monoisotópico não é mais detectável por massas superiores a 10 kDa ^3, a massa molecular média é utilizado para a medição em vez do que a massa monoisotópica ^5. Em tais casos, a distribuição isotópica em que cada um dos picos individuais são separados por uma Da só pode ser observado quando um analisador de massa de alta resolução tal como um TOF, uma ressonância de ciclotrão ião transformada de Fourier modificado Kingdon analisador armadilha ^6, ou uma transformada de Fourier analisador é utilizado para análise. No entanto, o pico mais abundante é a sometimes não é consistente com a massa molecular média de ^5. Estes problemas podem levar a dificuldades para a determinação exacta analitos.

Dada a variação na abundância natural dos isótopos estáveis ​​e as dificuldades na determinação da massa molecular média, a medição da massa monoisotópica é ideal para a caracterização de massa de biomoléculas ^3,4. Na prática, se um pico monoisotópico podem ser observadas ou não, a massa monoisotópica pode ser estimado por comparação do padrão de distribuição isotópica observada para a teórica calculada a partir de um modelo de analito ^4,7-10. O algoritmo de ajuste ⁸ está agora incorporado no software proprietário.

No contexto de ESI-MS, a dissociação de um duplex de DNA, purificação e dessalinização são necessárias para a medição directa para evitar a falha de ionização devido à supressão de iões e formação de aduto ^2,10-14. Estes procedimentos são troublesome, no entanto, sistemas analíticos totalmente automatizados foram desenvolvidos comercialmente envolvendo reacção em cadeia da polimerase (PCR), a preparação da amostra e ESI-MS para a detecção de agentes patogénicos ^15-20. Outra abordagem é a introdução de cromatografia líquida (LC) para a separação. LC proporciona uma separação em linha dos analitos a partir de substâncias que coexistem e não requer uma preparação da amostra trabalhoso antes da ionização ^21,22. No entanto, a separação de ácidos nucleicos utilizando uma fase móvel MS-compatível é mais difícil do que para a maioria dos outros compostos tais como fármacos, péptidos e proteínas, devido à natureza polianiónica dos nucleótidos. Os exemplos mais bem sucedidos de LC / ESI-MS envolvem o uso de par-ião de LC de fase reversa. Uma fase móvel de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol foi inicialmente proposto por Apffel et al., Para separar e detectar os oligonucleótidos curtos ^23. Aplicação de LC / genotipagem ESI-MS para differentiation de espécies de agentes patogénicos, polimorfismos de nucleotídeo único e repetições curtas em tandem foi relatado usando uma coluna de polímero monólito capilar que pode separar oligonucleotídeos mais ^1,21,24-33.

No Japão e nos Estados Unidos, intoxicação alimentar grave ocorreu devido a erros de identificação e preparação inadequado de baiacu, e isso apesar do fato de que a distribuição e preparação de baiacu é rigorosamente controlada por legislação de segurança alimentar ^34,35. Além disso, um homicídio intencional utilizando extrato de baiacu aconteceu no Japão ^36. Portanto, a diferenciação de espécies pufferfish é necessária tanto a saúde pública e pontos de vista de investigação forense. Além disso, porque Takifugu Rubripes é muito mais caro do que outros tipos de baiacu, uma capacidade de diferenciação é também necessária no contexto de investigações de fraude alimentar.

Aqui, um método detalhado para a determinação do monoisotopic massa de um produto de PCR por LC / ESI-MS, utilizando uma coluna de sílica monólito de fase reversa e um espectrómetro de massa de alta resolução é descrito. Especificamente, a abordagem foi desenvolvida para permitir a diferenciação de espécies tóxicas pufferfish baseadas na utilização da PCR, comprimento de polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP) Método ^37, o qual é o primeiro exemplo para a diferenciação de espécies de animais, utilizando MS.

Protocolo

1. Extração de DNA

Nota: Use uma sala separada para exames de extração de DNA e pós-PCR, tais como eletroforese em gel e LC / ESI-MS. Adicionar etanol ao tampão de lavagem 1 (contendo cloridrato de guanidina) e tampão de lavagem 2 (não contendo cloridrato de guanidina) de acordo com o protocolo do kit de extracção de ADN. As amostras de peixes foram obtidos a partir de peixe grossistas e mercados retalhistas no Japão.

1. Coloque 30-50 mg de tecido de peixe num tubo de 0,5 ml ou 1,5 ml de microcentrífuga. Esmagar o tecido usando um micro-espátula (exceto para fin e pele).
   Nota: No caso de aleta, utilizar um tubo de 0,5 ml de imersão.
2. Adicionar 180 ul de tampão de lise e 40 ul de proteinase K e vortex brevemente. Incubar a 56 ° C num bloco de aquecimento durante 2 horas ou durante a noite. Misturar em vortex brevemente a cada 15 minutos durante a incubação.
   Nota: lise completa não é necessária.
3. Centrifugar durante 5 min a 13.000 x g. Após centrifugação, se uma pequena amount de óleo existe sobre a superfície, no caso de uma amostra gordos tais como o fígado, descartá-lo. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Adicionar 200 ul de tampão de caotrópico contendo cloridrato de guanidina e misturar por vortex. Adicionar 200 uL de etanol (99,5%) e mistura por turbilhonamento novamente.
5. Transferir a mistura para a coluna de rotação colocados num tubo de recolha de 2 ml. Centrifugar durante 1 min a 13.000 x g. Descartar o fluxo de passagem.
   Cuidado: Não adicione água sanitária para o lixo porque guanidina pode formar compostos altamente reativos com lixívia.
6. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem 1 (contendo cloridrato de guanidina) e centrifugação durante 1 min a 13.000 x g. Elimine o escoamento eo tubo de coleta.
7. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml fornecido com o kit. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem 2 e centrifuga-se durante 3 min a 20.000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha. Transferir a coluna de centrifugação para uma nova1,5 ml tubo de microcentrífuga.
8. Pipete 200 pi de tampão de eluição para o centro da membrana por coluna de centrifugação. Após 1 min, centrifugar durante 1 min a 6000 x g.
9. Pipetar 50 ul do eluato a uma cuvete descartável de UV e medir o espectro de UV do eluato a 220-300 nm e a absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro.
10. Verificar o espectro de UV do DNA com o pico a 260 nm. Calcula-se a concentração de DNA aproximado utilizando a equação simples "concentração de ADN (ng / mL) = absorvância a 260 nm x 50".
    Nota: concentração de DNA típica extraído das aletas de pufferfish é de 63 ± 30 ng / mL (n = 20).
11. Se a concentração de ADN é maior do que 10 ng / mL, diluir as amostras de ADN com tampão Tris-EDTA (TE) (pH 8) a 5 ng / mL.
12. Armazenar a amostra a -20 ° C ou prosseguir para a amplificação por PCR (Secção 2).

2. PCR

1. Configurar 25 mL PCR para cada extragiu amostra de ADN, de controlo positivo (0,2 uM de oligonucleótidos sintetizados possuindo a sequência alvo em tampão TE a pH 8,0) e controlo negativo (água ultra-purificada em vez da amostra de DNA) em gelo de acordo com as Tabelas 1 e 2 numa bancada limpa para evitar a contaminação.
   Nota: Para a operação fácil, fazer uma quantidade suficiente de cocktail contendo todos os reagentes sem DNA modelo e dispensá-la. Use polimerase com actividade correctora de ADN para evitar a adição de 3 'salientes para o produto de PCR.
2. Levar a cabo uma amplificação por PCR na termociclador utilizando o programa do ciclo mostrado na Tabela 3.

3. Digestão Enzimática

1. Adicionar 2 ml da solução contendo Tris-HCl 100 (pH 7,5), _MgCl2 100 mM, ditiotreitol 10 mM e NaCl 500 mM à solução de PCR.
2. Adicionar 1 ml de cada enzima de restrição (Dra I e Msp I) e misture delicadamente. Incubar durante 30 min a 37 ° C no thcycler ermal.
3. Incubar durante 5 min a 72 ° C para activar a polimerase de ADN remanescente, que enche a extremidade coesiva gerado por Msp I.
4. Opcional: Analisar cada uma com 2,5 ul da solução da reacção por electroforese em gel de poliacrilamida usando uma razão transversal de ligação (% C, percentagem de bisacrilamida) de 3,33 (% em peso) e uma concentração do gel de poliacrilamida (% T) de 15 (% w / v) ^38. Manchar o gel usando o corante de ADN fluorescente e observar DNA dupla vertente num transiluminador de luz azul usando uma tela de âmbar.
5. Filtra-se a solução de reacção com um dispositivo de filtro centrífugo 0,2-0,5 uM para evitar o entupimento, o que iria danificar a coluna analítica.
6. Transferir o filtrado para um frasco de polipropileno afunilada e armazenar a -20 ° C até à análise.

4. LC / ESI-MS Análise

1. Pesar 67,2 g (ca. 42 ml) de HFIP e 1,52 g (cerca de 2,0 ml) de TEA em uma garrafa de 1 L. Adicione 955 ml de água ultrapura (LC / MS graDE) e agita-se com um agitador magnético até que os reagentes estão completamente dissolvidos. Tome-se uma alíquota da solução e verificar o pH (entre 7,85 e 7,95; idealmente pH = 7,9) utilizando um medidor de pH.
   Nota: Não envie a alíquota para a garrafa para evitar a contaminação por íons metálicos. Se o pH não é 7,9, adicionar uma pequena quantidade de HFIP ou qualquer TEA para ajustar o pH e medir novamente o pH.
2. Ligue o frasco com a linha A do cromatógrafo líquido com arrefecimento da garrafa utilizando um refrigerador portátil arrefecimento directo (para uso doméstico) para evitar a vaporização. Conectar uma outra garrafa cheia com metanol a linha B.
3. Ligar a coluna de guarda e a coluna analítica (2,0 x 50 mm, tamanho de mesoporos = 30 nm) para o cromatógrafo líquido. Começar a fluir a fase móvel inicial (95% de A e 5% de B) para equilibrar as colunas.
4. Prepare a 0,5 mg / ml de sódio trifluoroacetato (pH 3,5) como um calibrador ^39.
   1. Pesar 50 mg (ca. 34 uL) de ac trifluoroacéticoID numa proveta.
   2. Adicionar 30 ml de água ultra-purificada e titula-se a pH 3,5 com hidróxido de sódio a 10 mM, com o auxílio de um medidor de pH.
   3. Encha até 50 ml com água ultrapura. Adicionar 50 ml de acetonitrilo (LC / MS grau) e misturar.
   4. Pegue uma porção da solução de trabalho e armazená-lo à temperatura ambiente. Armazenar o resto da solução a 4 ° C.
5. Reduzir a pressão de azoto de C-armadilha como se segue.
   Nota: Fourier recentes transformar espectrómetros de massa, que são adequados para a análise de proteínas intactas, tem software de controlo para controlar a pressão.
   1. Remova a tampa superior esquerda do espectrômetro de massa. A válvula C-armadilha está no canto do primeiro plano esquerdo.
   2. Verifique o valor da pressão de alto vácuo na janela de estado instrumento de software de controle.
      Nota: O valor é tipicamente, 3 x 10 ^-8 bar.
   3. Puxe o botão para desbloquear e transformar o sentido anti-horário o botão de forma muito lenta para reduzir a imprensa alto vácuoure a 1/3 (tipicamente, de 1 x 10 ^-8 bar). A pressão indicada deve mudar gradualmente de uma forma retardada. Ignorar a mensagem de aviso sobre baixa pressão. Pressione o botão para bloquear.
   4. Restaurar a tampa superior para a segurança.
6. Calibrar o espectrômetro de massa usando trifluoroacetato de sódio ^39.
   Nota: A calibração de massa diária pode ser substituído pelo presente protocolo, no entanto, a calibração recomendado sugerido pelo fabricante deveria ter sido concluído antes desta calibração.
   1. Definir parâmetros de digitalização e aquecidos parâmetros da fonte ESI na caixa de controle do instrumento do software de ajuste da seguinte forma: tipo de digitalização MS completo; varredura de intervalo m / z 500-4,000; fragmentação (in-fonte de dissociação (CID) Tensão 60 eV colisão induzida; polaridade negativa; auto controle de ganho (AGC) alvo 1 x 10 ^6, tempo máximo de injetar 50 ms; caudal de gás 5 bainha; aux caudal de gás 0; gás de varrimento taxa de 0 fluir; spray de tensão de 3 kV; temperatura capilar 320 ° C; S-lente de radiofrequência (RF) nível 100; temperatura do aquecedor 30 ° C.
      1. Entrada da lista de íons negativos para ser monitorado como m / z 792,85908, 1.064,80870, 1.336,75832, 1.608,70794, 1.880,65755, 2.152,60717, 2.424,55679, 2.696,50640, 2.968,45602, 3.376,38045.
   2. Mover a sonda ESI aquecida para mais perto da interface do espectrómetro de massa (posição B). Ligar a sonda e uma seringa com um tubo.
   3. Infundir a calibração constantemente a uma taxa de fluxo de 10 mL / min usando a bomba de seringa encaixado. Verificar apenas a 6 inferiores iões de massa (m / z) 792,85908-2.152,60717 na tabela de calibração personalizado.
      1. Continuar com a calibração depois de a intensidade dos sinais são estabilizados. Após a calibração, verificar apenas os seis íons de maior massa (m / z 1.880,65755-3.376,38045) e prossiga com a calibração. Evite calibrar usando todos os íons de uma vez para evitar o fracasso.
7. Mova a sonda para o appropriaposição TE para uma taxa de fluxo de 0,4 ml / min (posição D) e conectar-se o cromatógrafo de fase líquida com um tubo de metal inerte.
8. Defina os parâmetros aquecidos fonte ESI na caixa de controle do instrumento do software de ajuste como segue: taxa de fluxo de gás bainha 50; taxa de fluxo de gás aux 15; varrer caudal de gás 1; pulverizar tensão de 2,5 kV; temperatura capilar de 350 ° C; S-lente nível de RF 100; temperatura de aquecimento 350 ° C.
9. Definir parâmetros de aquisição do espectrômetro de massa na janela de configuração instrumental da seguinte forma: método de duração 8 min; desviar a válvula, 3.5-6 min para espectrômetro de massa, 0-3,5 e 6-8 min para o lixo; tempo de execução 3,5 a 6 min; polaridade negativa; em tensão CID fonte de 15,0 eV; microscans 3; poder de resolução nominal (em m / z 200) 140.000; -Alvo AGC 1 x 10 ^6; tempo ion máximo 50 ms; número de scans 1; varredura de intervalo m / z 700-3,500; espectro de perfil tipo de dados.
10. Definir parâmetros de cromatógrafo líquido as seguintes: Coluna de temperatura do forno 20 ° C; sample temperatura de tabuleiro de 10 ° C; programa de gradiente de 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% de B, 5-6 min 98% B, 6- 6,05 min 98-5% de B, 6,05-8 min 5% de B; taxa de fluxo 0,4 ml / min.
11. Purge bolhas tocando o fundo dos frascos. Definir frascos de amostra no suporte de amostras e injetar 1,0 ul de uma amostra usando o amostrador automático para iniciar a análise.
12. Abrir arquivos de dados brutos com o software navegador e confirmar que todas as aquisições são concluída com êxito, incluindo os controlos positivos e negativos.
    Nota: Normalmente, dois ou três picos seria observado no cromatograma corrente iónica total a um tempo de retenção de 4-5,5 minutos quando pufferfish ADN é amplificado e digerido com sucesso.

5. Deconvolution e Interpretação

1. Inicie o software de deconvolução. Selecione o tipo de experiência "extrato de auto (isotopicamente resolvido)".
2. Editar um método utilizando os seguintes parâmetros: a produção de massa M; S / N threshold 3 limiar abundância relativa 0; carga negativa yes; calcular extraído ion cromatograma corrente (XIC) sim; gama m / z 700-3,500; cobrar transportadora H ^+; número mínimo de carga detectada 3; isótopo rácio de nucleotídeos; fator de ajuste de 80%; limiar restante 0%; Considere sobreposições yes; cobrar faixa de 3-50; intensidade mínima 1; Espera erro intensidade 3.
   1. Salvar como um novo método e selecione-o.
3. Selecione o diretório onde os arquivos existem dados brutos. Selecione os arquivos de dados brutos a serem analisados ​​e clique em "Adicionar para a Fila" botão.
4. Clique no botão "Run" no separador 'Run Queue' para iniciar deconvolução.
5. Depois que a fila é completada, selecione uma linha e clique em 'Resultado Open' na legenda superior para obter os resultados da deconvolução.
6. Interpretar os resultados a partir das massas monoisotópico derivados dos picos a um tempo de retenção de 4-5,5 minutos utilizando a tabela 4.

Resultados

Três colunas comercialmente disponíveis foram avaliados para a separação de oligonucleótidos longos a taxas de fluxo de 100-400 mL / min. Uma grande poro de octadecilo de cadeia de carbono (C ₁₈₎ da coluna de partículas de sílica -bonded (a), um poli comercialmente disponível (estireno-divinilbenzeno) (PS-DVB) monólito coluna (b) e uma coluna de sílica monólito -bonded C ₁₈ ( C) foram comparadas (Figura 1). Três pares de cadeias duplas de ADN (26, 37 e 53 pb) foram separados utilizando todas as colunas, e a sílica -bonded monólito coluna C ₁₈ foi utilizado em estudos subsequentes.

Os resultados representativos para a análise de uma amostra de ADN extraído a partir do músculo do T. rubripes é mostrado na Figura 2. isotopicamente picos resolvidos, como mostrado na figura 2a, são necessários para o cálculo com êxito a massa monoisotópica. O teórico e measured massa monoisotópico de T. rubripes são mostradas na Figura 2b. Uma vez que a digestão com as endonucleases é realizada apenas após amplificação por PCR, sem purificação, a extremidade 3'-pegajoso gerado pelo Msp I endonuclease é preenchido com a polimerase de ADN restante. De acordo com a análise de produtos de amplificação derivados de moldes de ADN sintéticos, precisão de massa variou entre -2,48 a 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm em média, n = 280). Assim, uma tolerância de massa de 3 ppm foi utilizado para a diferenciação de espécies (Tabela 4). Usando a tabela, todas as amostras pufferfish obtidos de mercados e lojas foram devidamente diferenciados como espécies específicas ^37.

De acordo com a análise periódica da amostra obtida a partir do modelo de ADN sintético de T. chrysops, todas as massas monoisotópico dos analitos foram determinados com sucesso dentro de ± 3 ppm por pelo leAST 180 HR, sem qualquer calibração de massa (Figura 3). Isto significa que a calibração de massa seria necessário numa base semanal.

Figura 1: Total de iões cromatogramas correntes do produto de PCR-RFLP derivado a partir do modelo de ADN sintetizada de T. pardalis utilizando uma coluna C ₁₈ -bonded de partículas de sílica (a, 3 x 250 mm, dimensão das partículas 3 micrómetros), um poli (estireno-divinilbenzeno) (PS-DVB) coluna monólito (b, 1,0 × 250 mm) e um C ₁₈ -bonded monólito coluna de sílica (C, presente método) Condições de (a):. velocidade de fluxo de 0,2 ml / min; proporção de metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Condições para (b):taxa de fluxo 0,1 ml / min; proporção de metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. A temperatura para ambas as colunas foi de 20 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Os resultados representativos para a análise de músculo cru de T. rubripes. (a) íon total de cromatogramas atuais típicos e espectro de massa. (B) massas monoisotópico teóricas e medidas dos produtos de PCR-RFLP derivados a partir do modelo de ADN sintetizada de T. rubripes. Por favor clique aqui para ver um grander Versão desta figura.

Figura 3:. Teste de estabilidade digerido amplicões obtidos a partir do ADN sintético de T. Chrysops foram analisados ​​a cada 10 h. Calibração de massa não foi realizada durante o teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome	Seqüência
lago86F	5'-3'-CCATGTGGAATGAAAACACC
taki114F	5'-3'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA
fugu86-114R	5'-3'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG

Tabela 1: PCR primers.

reagentes da RCP	volume utilizado	A concentração final
água ultrapurificada	15,75 mL
sem detergente 5x Tampão	5,0 ul	1x
de mistura de dNTP (10 mM cada)	0,5 ul	0,2 mM
mistura de iniciadores (10 uM cada de lago86F, taki114F e fugu86-114R em tampão TE pH 8,0)	1.0 ul	0,4 uM cada
DNA polimerase (2,5 unidades / ul)	0,25 mL	0,1 unidades / ul
DNA molde em tampão de TE pH 8,0 (5,0-10 ng / pL de amostra extraída, 0,2 uM de ADN sintético como controlo positivo)	2,5 ul	0,5-1,0 ng / ul de ADN extraído e 20 nM para o ADN sintético
	Total: 25 ul

Tabela 2: Componentes de uma escala de 25 ul de PCR.

Ciclo	Condição	Função
1	2 min a 95 ° C	A desnaturação inicial
2	30 s a 95 ° C	desnaturação
3	30 s a 56 ° C	Recozimento
4	30 s a 72 ° C	Alongamento
5	Repetir 2-4 (no total 30 ciclos)
6	7 min a 72 ° C	Alongamento final
7	Manter a 12 ° C até à remoção da amostra

Tabela 3: programa de PCR.

número de pico no tempo de retenção de 4,0-5,5 min	massa monoisotópica de o terceiro pico na gama (Da)		massa monoisotópica do segundo pico na gama (Da)		espécies Pufferfish
	Strand menor	maior cadeia	Strand menor	maior cadeia
2	→	→	15890,707-15890,803	16177,531-16177,629	L. inermis
			15921,702-15921,797	16146,537-16146,634	L. gloveri
			15930,713-15930,809	16137,525-16137,622	L. lunaris
			15937,697-15937,792	16131,537-16131,634	L. wheeleri
			24173,034-24173,179	24566,905-24567,053	T. chrysops
3	16295,706-16295,804	16467,610-16467,709	11341,851-11341,919	11466,875-11466,944	T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus
			11654,908-11654,978	11770,920-11770,991	T. niphobles
	16296,701-16296,799	16468,605-16468,704	→	→	T. rubripes
	16311,701-16311,799	16452,610-16452,709	→	→	T. poecilonotus T. exascurus
	16320,713-16320,811	16443,599-16443,697	→	→	T. porphyreus T. obscurus
	16599,751-16599,851	16780,667-16780,767	→	→	T. vermicularis

Tabela 4: A diferenciação de massas de pufferfish monoisotópico derivados de LC / ESI-MS.

Tabela 5: sequência de ADN amplificado (a) a sequência é idêntica a.a das outras espécies pufferfish, conforme descrito na Tabela 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Discussão

Para extrair ADN, um kit comercial para a extracção de ADN a partir de sangue e de tecidos é utilizado de acordo com o protocolo do fabricante com pequenas modificações (quantidade de proteinase K e centrifugação da solução de lise). No entanto, qualquer kit de extracção pode ser utilizado, desde que o ADN celular pode ser extraída com recuperação e pureza apropriada para PCR. Este método foi testado usando o músculo, aleta, fígado, ovário e pele ^37. Barbatana é especialmente apropriado devido à grande área de superfície, o que permite a rápida lise com proteinase K. frescos, congelados, secos, cozidos e amostras pufferfish cozidos foram testados com sucesso ^37.

O conjunto de primers PCR (Tabela 1) é projetado para baiacu e amplifica o gene do RNA ribossomal 16S mitocondrial de baiacu. O ADN alvo a amplificar é 114-115 pb (género Takifugu) e 86 pb (género lagocephalus) (Tabela 5). Para facilitar método development, foram utilizados oligonucleotídeos sintetizados com as sequências alvo para a referência em vez de recolher espécimes pufferfish autênticos. O conjunto de iniciadores pode ser substituído por um outro conjunto de iniciadores, em resposta ao efeito, no entanto, o comprimento final de ADN após a digestão enzimática deve ser inferior a 100 nt em termos de manutenção da qualidade do espectro de massa necessária para desconvolução bem sucedida. Além disso, a pressão de azoto no C-armadilha deve ser reduzida quando o oligonucleótido alvo é mais do que cerca de 75 nt e a qualidade do espectro de massa não é suficiente para desconvolução bem sucedida. Estas limitações podem ser controlados por meio de desenvolvimentos recentes no software do instrumento, caso contrário, a válvula para o C-armadilha no interior do chassis deve ser ajustado, como descrito na secção de protocolo. Quanto à preparação da amostra, a utilização de reagentes sem detergente é crítica para a LC subsequente em termos de formato de pico apropriado, a intensidade do pico e suficiente tempo de retenção estável ^31.

Um PS-DVB coluna capilar ^21,24-33 monólito, um _C-18 de fase inversa em coluna de sílica em partículas ^23,40,41 e uma cromatograf ia de interacção hidrofóbica (HILIC) coluna ⁴² foram utilizados para a LC / ESI-MS análise de oligonucleótidos. Entre eles, a coluna monólito capilar é superior aos outros em termos de capacidade de separação, no entanto, a coluna monólito capilar utilizado em estudos anteriores foi feita em casa e operado a um caudal baixo (2 ul / min), o que requer instrumentação dedicado a micro LC. Para facilitar a operação fácil, colunas comercialmente disponíveis foram avaliados para a separação de oligonucleótidos longos a taxas de fluxo mais elevadas (100-400 mL / min). Três pares de cadeias duplas de ADN (26, 37 e 53 pb) foram separados usando colunas acima mencionadas, no entanto, os tempos de ciclo da coluna C ₁₈ de partículas de sílica e a coluna -bonded PS-DVB monólito eram 65 e 70 min, respectivamente , enquanto que a da C _{18 -bonded coluna de sílica monólito foi de 8 min (Figura 1). Tomando em consideração a análise rápida, a coluna de sílica monólito C 18 -bonded foi escolhido para os nossos propósitos, apesar da capacidade de separação limitada; No entanto, os restantes duas colunas podem ser empregues quando é necessária a separação melhorada. Teoricamente, no caso de uma coluna monólito, não há o volume intersticial e a fase móvel seria forçado a fluir através dos poros da fase sólida, mantendo um comprimento de percurso consistente, possibilitando assim uma separação eficiente ^27. Tais processos seriam manifesta, particularmente na análise de biomacromoléculas, tais como um oligonucleótido, como o lenta difusão das moléculas grandes. Uma das vantagens práticas de uma coluna monólito é que a contra-pressão é mais baixa do que a de uma coluna de sílica em partículas ^27. Apesar da elevada taxa de fluxo (400 ul / min) e baixa temperatura da coluna (20 ° C), pressão de retorno máxima dosistema foi de 12,5 MPa ^37. Esta é a primeira demonstração da vantagem de uma coluna de sílica -bonded monólito C 18 para a análise rápida de um oligonucleótido de comprimento. Devido à elevada taxa de fluxo, um instrumento dedicado para micro LC e alinhamento preciso na interface não são necessários. Em vez disso, uma sonda de ESI aquecida é necessária para dissociar o duplex de DNA e auxiliar de ionização de ADN, tal como descrito mais tarde.}

cromatograf ia de par iónico é comumente utilizado para a separação de MS-compatível de oligonucleótidos. No entanto, um reagente de par iónico geralmente interfere com o processo de ESI e diminui a sensibilidade de ESI-MS. Portanto, o HFIP é frequentemente utilizada para a fase móvel, para melhorar a sensibilidade do oligonucleótido. No entanto, HFIP (ponto de ebulição 59 ° C) vaporiza-se rapidamente na interface antes (ponto de ebulição 65 ° C) de metanol e, por conseguinte, esta perda de solvente aumenta o pH e promove a dissociação do reagente de par iónico (ou seja, TEA)a partir do oligonucleótido. Porque o presente método emprega uma sonda ESI aquecida, que nebuliza o eluato com azoto quente a 350 ° C, este efeito pode ser mais enfatizado. Em vez de tampão de HFIP-TEA, Erb e Oberacher recomendado etilo cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA; pH 8,4) para a análise de genotipagem devido a uma redução na formação de produtos de adição com os iões metálicos vestigiais ^33. Os autores deduzido que em si CycHDMAA suprimida a formação do aducto de metal. Apesar da literatura, formação de aduto não significativo foi observado no presente método. Além disso, o benefício notável do sistema HFIP-TEA-metanol é que a área do pico obtido com o sistema de HFIP-TEA-metanol foi 17 vezes maior do que a obtida a partir do sistema CycHDMAA-acetonitrilo ao analisar um amplicon 86 bp de T. poecilonotus (dados não mostrados). Uma desvantagem do sistema de HFIP-TEA-metanol, no entanto, é o aumento do custo em relação ao sistema CycHDMAA-acetonitrilo.

Cálculo da massa monoisotópica requer a separação de picos isotópicos de iões de cargas múltiplas. Portanto, a resolução é crítica para a presente análise. Apesar de poder de resolução requerida é dependente do comprimento de pares de bases do analito, analisadores TOF convencionais, que têm um poder de resolução de várias dezenas de milhares de pessoas, pode ser limitado para a análise de oligonucleótidos curtos.

As massas teóricas monoisotópico mostrados na Tabela 4 foram calculados a partir das composições de base de correspondentes dos analitos. Alternativamente, Muddiman et ai. Desenvolveram uma aplicação de software para calcular a composição da base da massa ⁴³ precisas. Um programa similar foi integrado no sistema automatizado ESI-MS ^16-18. A utilização destes algoritmos pode melhorar a robustez do presente método porque uma massa monoisotópica medido nem sempre corresponde a uma base única composição óasa para a tolerância de massa de 3 ppm resultante do erro de medição inevitável. Infelizmente, não foi possível obter esses produtos de software para o presente estudo.

A presente determinação espécies baseado na massa monoisotópica podem ser adequados não só para a diferenciação de pufferfish mas também para a detecção de outros polimorfismos do ADN, porque o presente método baseia-se na análise da composição de base e não envolve um processo especialmente concebido para pufferfish. Tal como para a detecção de polimorfismos de ADN, o sistema de ESI-MS dedicado é totalmente automatizada e fácil de operar, que pode ser adequado para utilização em diagnóstico, tais como a detecção de agentes patogénicos ^{15,17,18,20,30.} Por outro lado, o presente método é viável com instrumentos comuns de investigação e aparelhos e, portanto, adequados para usos de investigação. ESI-MS já foi aplicada ao polimorfismo de ADN humano tal como ^13,28,32 single nucleotide polymorphism, repetição tandem curtas ²⁶, E DNA mitocondrial analsis ^16,19. Micro RNA também foi analisado via LC capilar / ESI-MS ^44. Estas aplicações publicadas também pode ser realizado através do presente método. Além disso, este método pode ser adequado para o controlo da interacção entre os compostos de oligonucleótidos e de baixo peso molecular, tais como a interacção de antibióticos e ARN ribossomal ⁴⁵ devido à separação de baixa temperatura. Em tais casos, oligonucleótidos e compostos de baixo peso molecular devem ser detectados simultaneamente, o que é uma vantagem da utilização de LC / ESI-MS.

Não há uma limitação de que a instrumentação não é adequado para a realização de análise paralelo como em técnicas convencionais, tais como a sequenciação de Sanger e PCR em tempo real. Além disso, o presente método identifica apenas a composição de base e qualquer substituição de base dentro da mesma molécula não podem ser distinguidos. No entanto, a análise de DNA baseado no MS descrito aqui ainda pode ter mérito no prazoS de precisão em comparação com a ligação técnicas à base de corantes, tais como electroforese em gel e PCR em tempo real de ADN.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DNeasy Sangue & Kit de lenços de papel (50)	Qiagen	69504	Kit de extração de DNA
Proteinase K	Qiagen	19131
Etanol (99,5+ vol%)	Wako	054-07225	Para diluição de tampões de lavagem
Tampão TE (pH 8,0)	Wako	310-90023	Para diluição de amostra de DNA
PCR primer	Fasmac	NA	Purificado com coluna de cartucho de fase reversa pelo fornecedor
Modelo DNA	Eurofins Genomics	NA	Purificado por HPLC pelo fornecedor
Água ultrapurificada	NA	NA	Gerado com um sistema de purificação direta de água Milli-Q (Merck Millipore), usado para preparação de amostras
Sem detergente 5x Phusion HF Buffer	Thermo Fisher	F-520L	Use em vez do tampão fornecido de DNA polimerase
Pfu-X DNA polimerase	Jena Bioscience	Mistura de dNTP PCR-207S
(20 mM cada)	Jena Bioscience	NA	Fornecido com a DNA polimerase
10&vezes; Tampão universal M	Takara Bio	NA	Contendo 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de MgCl2, 10 mM de ditiotreitol e 500 mM de NaCl
Dra I	Thermo Fisher	FD0224	Enzima
de restrição Msp I	Thermo Fisher	FD0544	Enzima de restrição
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Fluka	42060-50ML	Aditivo eluente para grau LC-MS.
Trietilamina (TEA)	Fluka	65897-50ML	Aditivo eluente para grau LC-MS.
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508	Para preparação de calibrante.
Hidróxido de sódio (1,0 M)	Fluka	72082	Diluir a 10 mM com água ultrapurificada e utilizar para titulação de ácido trifluoroacético.
Acetonitrila	Fluka	34967	Para preparação de calibrante, grau LC/MS.
Metanol	Kanto	25185-76	Para fase móvel, grau LC / MS.
Água	Thermo Fisher	W6-1	Para fase móvel, grau LC / MS.
Tubo de microcentrífuga (0,5 ml)	Eppendorf	0030123301	PCR clean grade
Tubo de microcentrífuga (1,5 ml)	Eppendorf	0030123328	PCR clean grade
UVette	Eppendorf	0030106300	Cubeta UV descartável.
Gel Green	Biotium	41004	Coloração de DNA fluorescente
Filtro Cosmospin G (0.2 μ m)	Nakalai Tesque	06549-44	Feito de membrana hidrofílica de politetrafluoretileno (PTFE). Qualquer unidade de filtro centrífugo (tamanho do poro, 0.2– 0,5 μ m) feito de PTFE hidrofílico ou outra membrana de baixa ligação é aplicável.
300 μ l Frasco de parafuso PP	American Chromatography Supplies	V0309P-1232
Tampa de rosca pré-montada e septos	Coluna analítica Finneran	5395-09R
Monobis C18 (2.0× 50 mm, tamanho do mesoporo = 30 nm)	Kyoto Monotech	2050H30ODS	Fora do Japão, disponível para compra na GL Sciences através de seus distribuidores. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Coluna de guarda Monobis C18	Kyoto Monotech	GCSET-ODS3210	Suporte incluído.
Cadenza CW-C18 (3.0&vezes; 250 mm)	Imtakt	CW036	C18-ligado coluna de sílica particulada
ProSwift RP-4H (1,0&vezes; 250 mm)	Thermo Fisher	066640	Coluna monolítica de poli (estireno-divinilbenzeno)
Misturador Themo C	Eppendorf	5382 000.023	Para digestão de tecidos de peixes.
Espectrofotômetro	Shimadzu	UV-3150	Quantificação da concentração de DNA.
Termociclador	Bio-Rad	T100
Frigorífico portátil	Twinbird	D-CUBE	Para fase móvel aquosa para evitar a evaporação do HFIP. Isso pode ser substituído por uma caixa de gelo.
Cromatógrafo líquido Ultimate 3000	Thermo Fisher	NA
Q Espectrômetro de massa exativo	Thermo Fisher	NA	Espectrômetro de massa com transformada de Fourier equipado com o analisador de armadilha Kingdon modificado.
Deconvolução de proteínas 3.0	Thermo Fisher	NA	Use a versão 3.0 ou superior com um modelo de padrão isotópico de nucleotídeo.