Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

Resumo

Uma nova técnica para a detecção de receptores endógenos de baixa abundância presentes em embriões de peixe-zebra é descrita. Nós o chamamos de AFLIP porque consiste na marcação de afinidade do receptor por seu ligante ligado à imunoprecipitação.

Resumo

Ao combinar os poderes da afinidade Labeling e da Immunoprecipitation (AFLIP), foi implementada uma técnica para a detecção de receptores de baixa abundância em embriões de peixe-zebra. Essa técnica aproveita a seletividade e a sensibilidade conferidas pela marcação de afinidade de um determinado receptor por seu ligante com a especificidade da imunoprecipitação. Usamos o AFLIP para detectar o receptor TGF-β tipo III (TGFBR3), também conhecido como betaglicano, durante o desenvolvimento inicial do peixe-zebra. O AFLIP foi fundamental na validação da eficácia de um fenótipo de peixe-zebra do morfo TGFBR3. Na primeira etapa, extratos de proteínas embrionárias são preparados e usados para gerar ¹²⁵complexos I-TGF-β2-TGFBR3 que são purificados por imunoprecipitação. Posteriormente, esses complexos são reticulados covalentemente e revelados usando separação SDS-PAGE e detecção de autorradiografia. Esta técnica requer a disponibilidade de um ligante marcado e de um anticorpo específico contra o receptor a ser detectado e deve ser facilmente adaptada para identificar qualquer fator de crescimento ou receptor de citocina que atenda a esses requisitos.

Introdução

A detecção específica de proteínas expressas durante o desenvolvimento embrionário é necessária para validar os perfis de expressão obtidos pela medição de seus mRNAs cognatos com RT-PCR ou hibridização in situ (ISH). Isso é comumente alcançado por um western blot de extratos de embriões seguido pela detecção com anticorpos específicos. No entanto, essa abordagem é difícil de aplicar a proteínas que estão em abundância muito baixa ou que possuem propriedades que dificultam sua transferência quantitativa durante o blotting. O betaglicano, também conhecido como receptor β do fator de crescimento transformador tipo III (TGF-β) (TGFBR3), é um exemplo dessas dificuldades. O TGFBR3 é um proteoglicano de membrana em tempo parcial que se liga ao TGF-β através de sua proteína central¹, com afinidade notavelmente maior pela isoforma TGF-β2, uma propriedade que o distingue de qualquer outra proteína² de ligação ao TGF-β. O TGFBR3 no peixe-zebra é expresso a partir de 8 hpf, atingindo um máximo de 72 hpf, conforme detectado por RT-PCR de seu mRNA³.

No entanto, apesar da disponibilidade de um^{anticorpo 3} muito específico, todas as tentativas de detectar seu produto traduzido por western blot não tiveram sucesso. Reconhecendo que a natureza proteoglicana do TGFBR3, bem como a suposta baixa abundância, podem ser responsáveis por essa falha, foi desenvolvido um método de detecção, AFLIP, que aproveita a alta afinidade do TGFBR3 pelo TGF-β2. Neste método, um extrato de proteína de embriões agrupados pode se ligar especificamente ao TGF-β2 marcado com ¹²⁵I e os complexos receptor-ligante são purificados por imunoprecipitação e reticulados antes da separação por SDS-PAGE. Os padrões de migração observados pela autorradiografia dos géis revelaram a presença e a natureza das espécies receptoras marcadas. Essa abordagem combina a especificidade do ligante da marcação de afinidade com a imunoprecipitação por anticorpos específicos, aumentando o alcance de detecção, evitando o ineficiente blotting de transferência de TGFBR3. Devido às suas propriedades inerentes, o ensaio AFLIP não é um ensaio quantitativo, mas pode ser usado para avaliar com segurança as diferenças experimentais relativas no receptor analisado.

Protocolo

Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê de Laboratório Animal Care e Use da Universidade Nacional Autônoma do México (UNAM), sob o número CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Preparação do extracto do embrião Proteína

1. Colete 100 - 200 embriões para cada condição para comparar (morphants vs. tipo selvagem) no estágio desejado, por exemplo 72 horas após a fertilização (hpf).
2. Embriões lugar em placas de Petri contendo água de peixe (ver Tabela 1) e dechorionate manualmente embriões usando uma pinça de ponta fina. Evitar o uso de pronase durante este passo (ou qualquer outra protease ao longo do protocolo), uma vez que podem digerir o receptor alvo.
3. embriões lugar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e lavar embriões twgelo com uma solução de tampão de fosfato de 1x (PBS) (ver Tabela 1).
4. Adicionar 500 ul de tampão deyolk (ver Tabela 1).
5. Liberar mais de gema de cuidado pipetando para cima e para baixo (cerca de 30 - 40 vezes) os embriões na solução. Para 72 hpf e 48 embriões HPF usar azul e amarelo pontas de pipeta, respectivamente. pontas amarelas pode precisar de ser ligeiramente cortada para evitar a destruição de embriões. O lançamento gema de sucesso pode ser verificado observando-se os embriões sob o microscópio.
6. Recolhe embriões por centrifugação a 600 xg durante 15 seg.
7. Elimine o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta.
8. Embriões lavar duas vezes com 500 ul de tampão de lavagem (ver Tabela 1) por vortex suavemente na velocidade mais baixa.
9. Recolhe embriões por centrifugação a 600 xg durante 15 seg.
10. A partir daqui, o processo continua a 4 ° C.
11. Elimine o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta.
12. Ressuspender embriões em 350 ul de tampão de lise (ver Tabela 1) e homogeneizar utilizando um pilão de plástico.
13. Incubar embriões lisadas 30 min, com agitação num agitador tubo de ensaio a 4 ° C.
14. Centrifugar embriões lisadas a 11000 xg durante 15 minutos a fim de remover os detritos insolúveis.
15. Transferência afastada sobrenadante utilizando uma pipeta para um tubo fresco.
16. Determinar a proteína total pelo ensaio de proteína de Bradford ^4, ou outro procedimento adequado. Se ensaio de Bradford é utilizado, realizar a curva de calibração na presença de concentrações equivalentes dos detergentes presentes no tampão de lise, uma vez que causam uma subestimação da proteína padrão ^4.

2. Detecção da proteína endógena do Receptor

1. Affinity Labeling e Immunoprecipitation (todos estes passos, a 4 ^° C)
   1. Coloque 400-500 ug de proteína total de embriões num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e diluir até 1 ug / uL com tampão 1 (ver Tabela 1).
      Nota: A fim de obter 500 mg de proteína embrião total, cerca de 100-200 embriões devem ser inicialmente processado. 72 hpf embriões rotineiramente obter ~ 5 ^ g de proteína total de embrião, o qual é suficiente para a detecção betaglicano.
   2. Adicionar um volume suficiente de estoque de TGF-β2 marcado para atingir uma concentração final de 150 pM e incubar com agitação em um tubo de ensaio balancim 2 h a 4 ° C. TGF-β2 deve ser marcado antes AFLIP é iniciado, com ¹²⁵ I pelo método da cloramina T como descrito por Cheifetz et ai. ^5.
      CUIDADO: O uso de blindagem para minimizar a exposição ao manusear ¹²⁵ I ligando marcado.
   3. Adicionar um volume suficiente de anticorpo não diluído contra o receptor de interesse, a fim de chegar a uma diluição de 1: 100 e continuar a incubação durante mais 2 horas a 4 ° C (de incubação pode ser O / N). Esta é a diluição óptima de anti-soro # 31, utilizado neste estudo e descrito noutro local ^3, mas, dependendo da qualidade do umtibody, uma diluição maior ou menor pode ser a ideal.
   4. Adicionar 50 ul de pérolas de ligação de imunoglobulina adequada (por exemplo, a proteína G-Sepharose ', que foi previamente equilibrada em TNTE e ressuspensas 1: 5 do seu volume original em TNTE) e incubar durante 50 minutos com agitação num agitador tubo de ensaio a 4 ° C.
   5. Recuperar os grânulos por microcentrifugação a 11000 xg durante 20 seg.
   6. Elimine o sobrenadante em um recipiente de lixo radioactivo apropriado.
   7. Lavam-se as esferas de IP-se três vezes com 1 ml de tampão de lavagem de IP (ver Tabela 1), por agitação em vórtice e microcentrifugação a 11000 xg durante 20 seg de cada vez.
   8. Ressuspender IP-grânulos em 250 ul de tampão de lavagem IP.
   9. Adicionar 1,5 uL de suberato de dissuccinimidilo (DSS, dissolvido em DMSO a 10 mg / ml). Preparar a solução de DSS imediatamente antes da sua utilização neste passo.
   10. Incubar durante 15 min a 4 ° C com agitação.
   11. A fim de parar a reacção de reticulação, adicionar 500 ul Otampão de lavagem f IP, suplementado com suficiente de Tris-Cl pH 7,4 estoque para atingir 25 mM de Tris-Cl. Os grupos amino livres em Tris capturar DSS que não reagiu.
   12. Centrifuga-se a 11000 xg durante 20 seg para recolher IP-grânulos e descartar o sobrenadante.
   13. Ressuspender IP-esferas em 30 ul de tampão redutor de Laemmli.
   14. Ferver as amostras 5 min a 94 ° C.
   15. Opcionalmente, analisar amostras em um contador gama usando o protocolo do fabricante.
2. Análise de amostras
   1. amostras submetido a uma desnaturação SDS-PAGE. Use poliacrilamida na percentagem adequada para a massa do receptor e executar gel sob procedimento padrão.
   2. Mergulhar em gel de solução fixadora (ver Tabela 1) durante 30 min à TA.
   3. Lavar o gel com água destilada durante 15 min.
   4. Coloque gel em papel de filtro previamente hidratado e cubra com filme de envolvimento Saran.
   5. gel seco a 80 ° C durante 1 h.
   6. Expor gel em um scre phosphorimager brancoen à TA S / N.
   7. Digitalizar tela exposta usando um phosphorimager usando o protocolo do fabricante.

Resultados

A Figura 1 mostra um resultado representativo obtido com AFLIP. Os sinais nas faixas 1 vêm do ^125I-ligando ligado de forma covalente, quer a proteína de peixe-zebra betaglicano núcleo (núcleo BG, abaixo da kDa marcador 150) ou o núcleo BG que foi processado para a sua forma de proteoglicanos por ligação de glicosaminoglicanos (GAG, esfregaço variando de 170 kDa para a parte superior do gel). Este padrão de migração, uma proteína núcleo afiado mais um proteogli...

Discussão

O uso de transferências de Western com um anticorpo específico contra uma proteína de interesse é uma ferramenta valiosa para estudar a sua expressão ⁷ durante a embriogénese. No entanto, immunoblotting de proteínas altamente glicosiladas não tem sido muito bem sucedida, devido à sua transferência ineficiente e de ligação fraca para nitrocelulose ou PVDF membranas ^8,9.

Proteoglicanos são um bom exemplo desta lacuna, por causa de suas cadeias de glicosaminoglicanos (GAG ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suberato de disuccinimidil (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Proteína G Sepharose 4	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Secador de Gel Modelo 583	BIO-RAD	1651745
Tufão 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix