Artigo de método

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

DOI:

10.3791/54405

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31 de agosto de 2016

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1Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Neste artigo

Resumo

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Uma nova técnica para a detecção de receptores endógenos de baixa abundância presentes em embriões de peixe-zebra é descrita. Nós o chamamos de AFLIP porque consiste na marcação de afinidade do receptor por seu ligante ligado à imunoprecipitação.

Resumo

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Ao combinar os poderes da afinidade Labeling e da Immunoprecipitation (AFLIP), foi implementada uma técnica para a detecção de receptores de baixa abundância em embriões de peixe-zebra. Essa técnica aproveita a seletividade e a sensibilidade conferidas pela marcação de afinidade de um determinado receptor por seu ligante com a especificidade da imunoprecipitação. Usamos o AFLIP para detectar o receptor TGF-β tipo III (TGFBR3), também conhecido como betaglicano, durante o desenvolvimento inicial do peixe-zebra. O AFLIP foi fundamental na validação da eficácia de um fenótipo de peixe-zebra do morfo TGFBR3. Na primeira etapa, extratos de proteínas embrionárias são preparados e usados para gerar 125complexos I-TGF-β2-TGFBR3 que são purificados por imunoprecipitação. Posteriormente, esses complexos são reticulados covalentemente e revelados usando separação SDS-PAGE e detecção de autorradiografia. Esta técnica requer a disponibilidade de um ligante marcado e de um anticorpo específico contra o receptor a ser detectado e deve ser facilmente adaptada para identificar qualquer fator de crescimento ou receptor de citocina que atenda a esses requisitos.

Introdução

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A detecção específica de proteínas expressas durante o desenvolvimento embrionário é necessária para validar os perfis de expressão obtidos pela medição de seus mRNAs cognatos com RT-PCR ou hibridização in situ (ISH). Isso é comumente alcançado por um western blot de extratos de embriões seguido pela detecção com anticorpos específicos. No entanto, essa abordagem é difícil de aplicar a proteínas que estão em abundância muito baixa ou que possuem propriedades que dificultam sua transferência quantitativa durante o blotting. O betaglicano, também conhecido como receptor β do fator de crescimento transformador tipo III (TGF-β) (TGFBR3), é um exemplo dessas dific....

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Protocolo

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Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê de Laboratório Animal Care e Use da Universidade Nacional Autônoma do México (UNAM), sob o número CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Preparação do extracto do embrião Proteína

  1. Colete 100 - 200 embriões para cada condição para comparar (morphants vs. tipo selvagem) no estágio desejado, por exemplo 72 horas após a fertilização (hpf).
  2. Embriões lugar em placas de Petri contendo água de peixe (ve....

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Resultados

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A Figura 1 mostra um resultado representativo obtido com AFLIP. Os sinais nas faixas 1 vêm do 125I-ligando ligado de forma covalente, quer a proteína de peixe-zebra betaglicano núcleo (núcleo BG, abaixo da kDa marcador 150) ou o núcleo BG que foi processado para a sua forma de proteoglicanos por ligação de glicosaminoglicanos (GAG, esfregaço variando de 170 kDa para a parte superior do gel). Este padrão de migração, uma proteína núcleo afiado mais um proteogli.......

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Discussão

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O uso de transferências de Western com um anticorpo específico contra uma proteína de interesse é uma ferramenta valiosa para estudar a sua expressão 7 durante a embriogénese. No entanto, immunoblotting de proteínas altamente glicosiladas não tem sido muito bem sucedida, devido à sua transferência ineficiente e de ligação fraca para nitrocelulose ou PVDF membranas 8,9.

Proteoglicanos são um bom exemplo desta lacuna, por causa de suas cadeias de glicosaminoglicanos (GAG .......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a Gilberto Morales pelo cuidado e manutenção dos peixes, e aos Drs. Claudia Rivera e Hector Malagòn (IFC-UNAM Animal Facility) por sua ajuda na imunização de coelhos. Este trabalho foi apoiado por doações da CONACYT 131226 e PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Suberato de disuccinimidil (DSS)ThermoFisher Scientific21555
Proteína G Sepharose 4GE Healthcare Life Sciences17-0618-01
Secador de Gel Modelo 583 BIO-RAD1651745
Tufão 9400GE Healthcare Life Sciences63-0055-78
Cobra II Auto gamma counterPackard
Exposure CassetteMolecular Dynamics63-0035-44
NaClJ.T. Baker3624
KClJ.T. Baker3040
Na2HPO4J.T. Baker3828
K2HPO4J.T. Baker3246
CH3OHJ.T. Baker9070
CH3COOHJ.T. Baker9508
HCHOJ.T. Baker2106
SDSSigma-AldrichL4509
EDTASigma-AldrichED
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
CaCl2Sigma-AldrichC3306
NaHCO3Fisher ScientificS233
PMSFSigma-AldrichP7626
Crystal Sea Marine MixMarine Enterprises Internationalhttp://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix
Fast Flow

Referências

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  1. López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
  2. Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J.

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Etiquetas

Imunoprecipita oDetec o de TGFBR3Ligante RadioativoSDS PAGEAutorradiografiaKnockdown por MorpholinoBetaglicanoReceptores de Fator de Crescimento

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