Artigo de método

Preparação de Amostras de MALDI homogênea para Aplicações quantitativas

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DOI:

10.3791/54409

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28 de outubro de 2016

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1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para reduzir as heterogeneidades espaciais dos sinais de iões em espectrometria de massa MALDI por regulação da temperatura do substrato durante o processo de secagem da amostra é demonstrada.

Resumo

Este protocolo demonstra uma preparação simples de amostra para reduzir a heterogeneidade espacial em sinais de íons durante a espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI). A heterogeneidade dos sinais de íons é um problema grave no MALDI, o que resulta em baixa reprodutibilidade dos dados e torna o MALDI inadequado para análise quantitativa. Ao regular a temperatura da placa de amostra durante a preparação da amostra, os fluxos hidrodinâmicos induzidos termicamente dentro das gotículas da solução da amostra são capazes de reduzir o problema de heterogeneidade. Uma câmara de preparação de amostras à temperatura ambiente equipada com um bloco de base de cobre regulado por temperatura que contém placas de amostra MALDI facilita o controle preciso da condição de secagem da amostra. Após a secagem das gotículas de amostra, a temperatura das placas de amostra é devolvida à temperatura ambiente e removida da câmara para posterior análise espectrométrica de massa. As áreas das amostras são examinadas com espectrometria de massa de imagem MALDI para obter a distribuição espacial de todos os componentes da amostra. Em comparação com o método convencional de gotículas secas que prepara amostras em condições ambientais sem controle de temperatura, as amostras preparadas com o método aqui demonstrado apresentam distribuição espacial e intensidade de sinal significativamente melhores. De acordo com observações usando amostras de carboidratos e peptídeos, diminuir a temperatura do substrato e manter o ambiente à temperatura ambiente durante o processo de secagem pode efetivamente reduzir a heterogeneidade dos sinais de íons. Este método é geralmente aplicável a várias combinações de amostras e matrizes.

Introdução

A espectrometria de massa (MS) é uma das técnicas analíticas mais importantes para analisar as composições moleculares de amostras complexas. Dentre todos os métodos de ionização utilizados na EM, a dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) é o método mais sensível e amplamente utilizado em aplicações bioanalíticas. 1 Em comparação com outras técnicas de ionização, o MALDI tem a mais alta sensibilidade e alta tolerância a contaminantes de sal. Tais propriedades analíticas tornam o MALDI a primeira escolha para análise de carboidratos e muitas aplicações proteômicas. No entanto, a preparação da amostra é uma etapa crucial para a obtenção de dados de alta qualidade no MALDI-MS.

O método de preparação de amostras mais comumente usado para MALDI-MS é o método de gotículas secas, no qual as gotículas de amostra são depositadas em uma superfície e secas em condições ambientais. Este método de secagem é simples e geralmente eficaz. 2-5 No entanto, um problema comum no método de gotículas secas é que os cristais de analito / matriz resultantes normalmente se distribuem irregularmente. Em muitos casos, os cristais se agregam na periferia das áreas de amostra, resultando na chamada formação de manchas em anel. 6-8 As morfologias cristalinas heterogêneas afetam a distribuição espacial das moléculas do analito, o que resulta em flutuação severa no sinal de íons nas áreas de amostra. Essas flutuações severas de sinal e baixa reprodutibilidade de dados são conhecidas como o problema do "ponto ideal" no MALDI-MS. 9 Assim, há uma grande necessidade de reduzir as heterogeneidades espaciais nas aplicações de gotículas secas MALDI-MS.

Os fluxos hidrodinâmicos na gota da amostra desempenham um papel importante na determinação da distribuição espacial das amostras preparadas com o método da gota seca. 10-12 Verificou-se que a evaporação do solvente induz fluxos capilares externos dentro das gotículas, que são responsáveis pela formação da mancha do anel. 7,10 Em contraste, os fluxos de recirculação induzidos por gradientes tangenciais de tensão superficial podem contrabalançar os fluxos capilares externos. 13 Se as velocidades do fluxo de recirculação forem maiores do que as dos fluxos capilares externos, as amostras podem ser redistribuídas com eficiência para reduzir o problema da heterogeneidade. 14

Neste trabalho, demonstramos um protocolo detalhado para preparação de amostras com uma câmara de secagem simples para induzir fluxos de recirculação eficientes durante os processos de secagem de gotículas. As condições de secagem por gotículas são controladas com precisão, incluindo as temperaturas da placa de amostra e seus arredores e a umidade relativa dentro da câmara. Os analitos modelo incluem maltotriose e cadeia de bradicinina (1-7). A matriz utilizada para a demonstração é a 2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP). As amostras são examinadas com MS de tempo de voo (TOF) e os dados são analisados quantitativamente para mostrar a redução da heterogeneidade.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo é desenvolvido para reduzir a heterogeneidade espacial do fragmento maltotriose e bradicinina (1-7) preparado com o método da gota seco. O protocolo consiste em três etapas principais, incluindo a preparação e pré-condicionamento, a deposição de amostra e de secagem e análise de dados de espectrometria de massa. Os procedimentos são descritos e descritos com mais detalhe a seguir:

1. Preparação e pré-condicionamento

  1. Limpeza da placa de amostra
    1. Usar luvas de borracha nitrílica e mão-lavar a placa de amostra suavemente com detergente e destilada-água deionizada (DDW).
    2. Lavar a placa de amostra com metanol (MeOH) e DDW.
    3. Insira a placa de amostra num copo de 600 ml e encher com DDW.
    4. Sonicar a amostra na placa de DDW durante 15 minutos num banho de ultra-sons (200 W, 40 kHz).
    5. Remover DDW a partir do recipiente e encher a proveta com MeOH.
    6. Sonicar a placa de amostra em MeOH durante 15 min no banho de ultra-sons (200 W, 40 kHz).
    7. Blow off as gotas de solvente na placa com azoto gasoso e manter a placa de amostra seca, antes da deposição da amostra.
  2. Regulação da temperatura de secagem Câmara
    NOTA:. A câmara de secagem é de 35 x 20 x 45 cm3 (W x D x H) câmara de acrílico Figura 1 mostra a imagem deste sistema de secagem. A câmara é purgado com gás azoto a temperatura ambiente através de um medidor de fluxo de gás a uma velocidade de fluxo constante para manter uma condição de baixa humidade relativa controlada por um higrómetro calibrado instalado no interior da câmara de secagem. Um bloco de base de cobre na câmara de secagem equipada com uma constante circulação de água de temperatura programado é utilizado para acomodar placas de amostra de aço inoxidável. O bloco de base de cobre é capaz de regular a temperatura da placa de amostra de 5 a 25 ° C. As temperaturas do ar, do bloco da base de cobre, e a placa de amostra são monitoradas por termopares tipo K.
    1. Abra a porta e colocar rapidamente a placa de amostra sobre o cobrebloco da base, em seguida, fechar a porta.
    2. ajustar manualmente o medidor de vazão de gás para definir a taxa de fluxo de azoto a 10 pés cúbicos padrão por hora (scfh).
    3. Monitorar a umidade relativa do ar na câmara de secagem pelo higrômetro e afinar o medidor de vazão de gás para garantir a umidade relativa do ar é sempre inferior a 25%.
    4. Monitorar a temperatura da placa amostra por termopares tipo K e ajustar a temperatura da água de circulação manualmente até que o prato da amostra atinge 5 ° C durante experimento ou à temperatura ambiente (25 ° C) para o controlo.
      NOTA: De modo a estabilizar a placa de amostra a uma temperatura concebido, a temperatura de circulação de água é tipicamente definido de 0 a 5 ° C mais baixa do que a amostra concebido. Por exemplo, para manter a 5 ° C na placa de amostra, o ajuste da temperatura da bomba de circulação de água está compreendida no intervalo de 0 a 2 ° C; para manter a placa de amostras a 25 ° C, a regulação da temperatura da bomba de circulação de água é na gama de 23 a 25 ° C.
    5. Assegurar que as temperaturas exigidas e a humidade relativa são atingidos (Tabela 1), antes da deposição da amostra.
      NOTA: Todos os parâmetros, bem como os seus valores de ajuste para os processos de secagem com temperaturas de chapa de amostra diferentes estão apresentados na Tabela 1.
      NOTA: a uma temperatura baixa placa de amostra, a condensação de água na chapa de amostra, pode ocorrer se a porta da câmara é aberta para um longo período de tempo. Se ocorrer condensação de água, fechar a porta e não depositar qualquer amostra nele até a condensação da água é seco.
  3. Preparação da matriz e do analito Soluções
    1. Preparação de soluções de matriz
      1. Preparar solução 0,1 M THAP com 50% de acetonitrilo (ACN): 50% solução aquosa de DDW.
    2. Preparação de analitos
      1. Prepare 10 -4 solução maltotriose M com DDW.
      2. Preparar 10 -5 M fragmento bradicinina (1-7) em solução a 50% de acetonitrilo(ACN): 50% solução aquosa de DDW.

2. A deposição da amostra e Secagem

  1. Pré-mistura de 0,25 ml de solução 0,1 M THAP e 0,25 ul de 10 -4 M de maltotriose ou soluções em um tubo de microcentrífuga de 10 -5 M fragmento bradicinina (1-7).
  2. Vortex a solução misturada por 3 s.
  3. Centrifugar a solução mista de 2 seg (2000 xg) para recolher a solução no fundo do tubo de centrifugação.
  4. Abrir a porta da câmara de secagem, cuidadosamente depositar 0,1 ul da solução na placa de amostra com uma pipeta e fechar a porta imediatamente.
  5. Aguarde até que a gota de amostra a secar.
    . NOTA: Os tempos de secagem tipicamente observada com temperaturas de chapa de amostra diferentes estão listados na Tabela 1 para a temperatura da placa de amostra de 5 ° C, o tempo médio de secagem é de 800 a 1000 seg; para temperatura da placa de amostra de 25 ° C, o tempo médio de secagem é de 100 a 150 sec.
  6. Após a secagem, abrir a porta da câmara de secagem.
  7. Ajustar a temperatura da água de circulação até à temperatura ambiente (25 ° C).
    NOTA: Ignore este passo se a placa de amostra é mantida constantemente à temperatura ambiente (25 ° C) durante o processo de secagem.
  8. Depois da amostra de temperatura da placa de voltar à temperatura ambiente (25 ° C), remover o prato da amostra a partir da câmara de secagem.
  9. Examinar a morfologia da amostra sob um microscópio estereoscópico de 5x e tomar imagem de campo brilhante um instantâneo.
    NOTA: Se as morfologias de cristal não são como esperado, é necessário preparar uma nova amostra com o mesmo procedimento. Morfologias cristalinas típicas são apresentadas nos painéis superior da Figura 2.
    NOTA: Nos casos com temperaturas de chapa de amostra baixa, tal como 5 ° C, é importante para aquecer a placa de amostra para a temperatura ambiente antes de o levar para fora da câmara de secagem. Ao depositar as amostras, não mantenha o solutio pré-misturadon na ponta da pipeta ao longo de 10 seg. NÃO usar a solução pré-misturada de novo depois de depositar as amostras. Os painéis superior da Figura 2 mostrar as imagens de campo brilhante de amostras preparadas com temperaturas de chapa de amostra diferentes.

Análise 3. Espectrometria de Massa de dados

  1. Dados de espectrometria de massa Aquisição
    NOTA: Após a preparação, a amostra pode ser analisada utilizando espectrometria de massa de imagem. No presente estudo, as experiências de imagiologia MS são realizados utilizando um sincronizado TOF dupla polaridade construído em laboratório (DP-TOF) espectrómetro de massa de imagiologia. 15 espectrómetros de massa MALDI-TOF comercial com capacidade de imagiologia também são adequados para tais experiências. O espectrómetro de massa é operado na extração linear e modos de iões positivos com atrasos de extração otimizados. A energia cinética dos iões é de 20 kV. O tamanho do feixe de laser é de 35 um de diâmetro sobre a superfície da amostra, e o espectro de cada ponto representa a avraiva de 5 disparos de laser.
    1. Insira a placa de amostra para o espectrómetro de massa MALDI.
    2. Realizar imagem análise de espectrometria de massa para a amostra preparada em passos 2.1-2.9.
    3. Selecione um pico de massa característica da lista de massa mostrado na janela de resultados e clique em "2D" para traçar uma imagem ion bidimensional.
      NOTA: Para maltotriose misturado com THAP, os picos característicos são sodiated maltotriose, THAP protonada e sodiated THAP. Por fragmento de bradicinina (1-7) misturado com THAP, os picos característicos incluem protonado fragmento bradicinina (1-7), THAP protonado, e sodiated THAP.
    4. Clique nos botões de ajuste na janela de pop-up para determinar os limites superior e inferior da intensidade do sinal e clique em "salvar uma imagem". Esta configuração define o contraste das imagens íon.
      NOTA: Em cada conjunto individual de dados, as regiões rachados e os pontos nulos mostrando baixa luminosidade são eliminados.
    5. Observar e comparar o íonimagem com a imagem de campo brilhante que foi tomada no passo 2.9.
      NOTA: Geração de espectrometria de massa e produção de imagens de iões específicos pode ser conseguida com instrumentos comerciais. Devido à variedade de aquisição de dados e software de análise, os usuários devem seguir as instruções de software fornecidas pelo fornecedor do instrumento para obter imagens de alta qualidade.
  2. Análise de dados
    NOTA: A heterogeneidade das amostras é analisado quantitativamente. Nesta demonstração, cada amostra é dividida em várias áreas concêntricas por software desenvolvido in-house para analisar a distribuição espacial dos íons. A análise pode também ser realizada usando software de análise de dados independente.
    1. Clique os pontos nulos e as regiões rachados na imagem ion mostrado na janela de resultado para remover as áreas sem importância.
      NOTA: Este procedimento define a área essencial imagem de iões de.
    2. Clique em "encontrar edge" botão para encontrar a camada mais externa da imagem de ion.
    3. Clique em "deduzir" para salvar as informações abundância de íons da camada mais externa em um banco de dados e remover esta camada a partir da imagem de íon simultaneamente. Uma caixa de seleção que representa esta camada mais externa aparecerá na lista "de dados de saída" da janela de resultados.
    4. Repita os passos 3.2.2 e 3.2.3 até que o centro da imagem de iões é definido.
    5. Clique e selecione todas as caixas de seleção na lista de "dados de saída" e clique em "Exportar" para exportar os dados.
    6. Abrir os dados exportados usando o software de planilha para calcular a abundância média de iões de cada camada para obter as informações de distribuição espacial de íons.

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Resultados

As imagens de campo brilhante, bem como as imagens de MS fragmento maltotriose e bradicinina (1-7) preparado, com a temperatura da placa de amostra de 5 e 25 ° C são apresentados na Figura 1. No caso de maltotriose sodiated, o sinal de iões principalmente povoa na periferia da área de amostra quando é preparado com uma temperatura de placa de amostra de 25 ° C. Diminuindo a temperatura da placa de amostra a 5 ° C, o sinal preenche de forma homogénea sobre toda a área da ...

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Discussão

Com base em previsões teóricas anteriores, fluxos hidrodinâmicos induzidas pela temperatura dentro de gotículas pode ultrapassar para fora fluxos capilares induzidas por evaporação do solvente. A eficiência de tais moléculas de recirculação interna é aumentada quando a gradientes de temperatura dentro de um aumento de gotícula. De acordo com os resultados previstos, ao manter a temperatura da placa de amostra abaixo de 5 ° C, mantendo a sua envolvente, à temperatura ambiente, a velocidade média de fluxo de recirculação ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pelo Centro de Pesquisa Genômica, Academia Sinica e pelo Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan, República da China (Contrato nº 104-2119-M-001-014).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente
Detergente em póAlconox242985
MetanolMerck106009
AcetonitrilaMerck100003
2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP)Sigma-AldrichT64602 
Fragmento de bradicinina (1-7)Sigma-AldrichB1651
MaltotrioseSigma-Aldrich47884
Ponteiras de pipetaMettler Toledo17005091
Tubo de microcentrífugaAxygenMCT-150-C
Equipamento
Milli-Q purificação de água sistemaMilliporeZMQS6VFT1
Luvas de nitrilo sem póMicroflexSU-690
Copo de 600 mlDuran2110648
Limpador ultrassônicoDeltaDC300H
HigrômetroWisewind5330
Medidor de vazão de gás nitrogênioDwyerRMA-6-SSV
K-type termoparesDigitron311-1670
CentrífugaSelect BioProductsForce Mini 
PipetaRaininpipet-lite XLS
EstereomicroscópioOlympusSZX16
Câmara de secagem controlável por temperaturaneste laboratório
Espectrômetro de massa de imagem de tempo de voo de dupla polaridade sincronizada (DP-TOF IMS)este laboratório
MALDI-TOF amostra de aço inoxidável alvodeste laboratório

Referências

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