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Artigo de método

O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

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DOI:

10.3791/54415

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12 de setembro de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati

Neste artigo

Resumo

No atual clima de escassez de recursos, estão surgindo novas tecnologias que permitem aos pesquisadores realizar estudos de forma mais barata, rápida e precisa. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares baseado em esferas para medir a exposição humana a vários patógenos ambientais simultaneamente.

Resumo

A etiologia e os impactos da exposição humana aos patógenos ambientais são uma grande preocupação no mundo inteiro e, assim, a capacidade de avaliar a exposição e infecções usando rentáveis, abordagens de alto rendimento seria indispensável. Este manuscrito descreve o desenvolvimento e análise de um imunoensaio baseado em multiplex-grânulo capaz de medir a presença de anticorpos na saliva humana a vários patógenos simultaneamente. Saliva é particularmente atraente nesta aplicação porque é não-invasivo, mais barato e mais fácil de recolher além do soro. Os antigénios de agentes patogénicos ambientais foram acoplados a microesferas carboxiladas (grânulos) e utilizado para medir os anticorpos em volumes muito pequenos de amostras de saliva humana utilizando um ensaio solução-fase à base de grânulo. As esferas foram acoplados com antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovírus (G I.1 e G II.4) e vírus da hepatite A. Para assegurar que os antigénios foram suficientemente acoplado aas contas, o acoplamento foi confirmada usando, anticorpos de captura primária de origem animal espécie-específicos, seguido de incubação com biotinilados anti-espécies anticorpos de detecção secundárias e repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como um controlo para medir a ligação não específica, um conjunto de esferas foi tratada de forma idêntica aos outros, excepto que não foi acoplado a qualquer antigénio. As esferas juntamente com antigénio e de controlo foram então incubados com amostras de saliva humana prospectivamente-recolhidos, medido num analisador de alto rendimento com base nos princípios de citometria de fluxo, e a presença de anticorpos para cada antigénio foi medida em unidades de intensidade média de fluorescência (IMF) . Este imunoensaio multiplex tem um número de vantagens, incluindo mais dados com menos de amostra; redução de custos e de trabalho; e a capacidade de personalizar o ensaio para muitos alvos de interesse. Os resultados indicam que o imunoensaio multiplex salivar pode ser capaz de identificar as exposições e infecções anteriores, que pode ser especially útil em estudos de vigilância envolvendo grandes populações humanas.

Introdução

Oitenta e oito por cento das doenças relacionadas com a diarreia em todo o mundo está associada à exposição humana à água contaminada, alimentos não seguros, e falta de saneamento / higiene, causando cerca de 1,5 milhões de mortes, a maioria dos quais são crianças 1. Esta é uma das principais causas de preocupação para os funcionários de saúde pública e os decisores políticos. Em um esforço para investigar exposições e doenças associadas à base de água e de outros patógenos ambientais, foi desenvolvido um imunoensaio multiplex para medir anticorpos em amostras humanas 2-4. Este método pode ser aplicado a estudos epidemiológicos para determinar a exposição humana para estes agentes patogénicos e para melhor definir e infecções immunoprevalence incidentes.

Saliva é uma promessa considerável como uma alternativa ao soro para pesquisa com biomarcadores humano. Entre as vantagens da utilização de saliva são os não-invasivo e facilidade de recolha de amostras, de baixo custo, e as amostras podem ser facilmente obtidas de crianças 5-7 </ Sup>. As amostras de soro e saliva foram estudados extensivamente para anticorpos contra H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, vírus da hepatite A e C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, vírus da dengue 16, o vírus da imunodeficiência humana (VIH) 17, e Escherichia coli O157: H7 18.

Um imunoensaio em multiplex permite a análise de múltiplos analitos em simultâneo dentro de um único volume de amostra e dentro de um único ciclo ou correr. Antígenos multiplexados de C. jejuni, T. gondii, H. pylori, vírus da hepatite A, e duas noroviruses foram usadas para medir humano IgG salivar 4/2 e IgA IgG no plasma 3,4 e 2,3 respostas de anticorpos para estes agentes patogénicos usando um-Grânulo baseado imunoensaio multiplexação. Quando usado em conjunto com estudos epidemiológicos de exposição a micróbios em água, solo e dos alimentos, do tipo de ensaio descrito neste estudo pode fornecer informação valiosa para melhorar a compreensão de infecções causadas por agentes patogénicos ambientais. Além disso, os dados obtidos a partir de anticorpos salivares tais estudos pode ser usada para melhorar os modelos de avaliação do risco 19-22.

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Protocolo

A aprovação foi obtida a partir do Institutional Review Board (IRB # 08-1844, da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, NC, EUA) para a recolha de amostras de saliva crevicular estimulados de banhistas em Boquerón Beach, Puerto Rico, como parte dos Estados Unidos Environmental Protection Agency (EPA) epidemiológica Nacional e Avaliação ambiental de recreio (neear) Estudo de água 23 para avaliar as exposições e doenças de natação associado. Os sujeitos do estudo forneceu consentimento informado e foram instruídos sobre o uso do dispositivo de recolha de saliva por empreiteiros USEPA treinados. As amostras de saliva foram enviadas em gelo e, após a recepção, eles foram centrifugadas e armazenadas a -80 ° C como descrito 4.

1. A activação do grânulo

  1. Conjunto de esferas stocks Ressuspender por vórtex e ultrassons durante 20 segundos e transferência de aproximadamente 5,0 x 10 6 dos grânulos Stock (400 ul) a tubos de microcentrífuga.
    Nota: Tele grânulos são fornecidos a uma concentração de 12,5 x 10 6 contas / ml.
  2. Sedimentar as pérolas de banco por centrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas peletizadas em 100 ul de água destilada (dH2O) por vórtice e ultra-sons durante 20 seg. Repita o passo 1.2.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender as esferas lavadas em 80 ul de 100 mM de fosfato de sódio monobásico, pH 6,2 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
  5. Imediatamente antes da utilização, fazer uma solução 50 mg / ml de N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) por adição de 200 uL de dH2O de 10 mg, Sulfo-NHS alíquota. Misture por vórtice.
  6. Adicionar 10 ul de 50 mg / ml de sulfo-NHS para os grânulos. Misture por vórtice.
  7. Imediatamente antes da utilização, fazer uma de 50 mg / mL de 1-etil- [3dimethylaminopropyl] carbodiimida solução (EDC) de cloridrato por adição de 200 ul de água destilada (dH2O) para os 10 mg de EDC alíquota. Misture por vórtice.
  8. Adicionar 10 ul de 50mg / ml solução EDC para os grânulos. Misture por vórtice. Incubar as contas durante 20 min à temperatura ambiente, no escuro, com agitação por vortex em intervalos de 10 min. Agregar as esferas activadas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  9. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 250 ul de ácido 2- 50 mM de [N-morfolino] etanossulfónico (MES), pH 5,0 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
  10. Agregar as esferas activadas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  11. Repita os passos 1.9 e 1.10.
    Nota: Isto proporciona um total de duas lavagens com 50 mM de MES, pH 5,0.
  12. Ressuspender as pérolas em 100 ul de 50 mM de MES, pH 5,0 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.

2. Bead Coupling

  1. Par os antigénios para os conjuntos de esferas usando as concentrações apresentadas na Tabela 1.
  2. Adicionar cada antigénio para as esferas activadas e levar o volume total a 500 mL em MES 50 mM, pH 5,0. Misturar os antigénios umd grânulos por vortex.
  3. Incubar os antigénios e os grânulos durante 2 horas, com mistura por rotação (~ 15 rpm) à temperatura ambiente no escuro. Agregar as esferas acopladas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 500 ul de salina tamponada com fosfato (PBS), albumina de soro -bovine (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) de sódio a azida (PBS-TBN) pH 7,4 por vórtice e sonicação. Sedimentar as pérolas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min e remove-se o sobrenadante.
    Cuidado: A azida de sódio é um produto químico altamente tóxico. É fatal se ingerido ou entra em contato com a pele. Não respirar as poeiras / fumos / gases / névoas / vapores ou spray. Use equipamento de proteção pessoal adequado (do PPE) ao manusear e descartar de acordo com as leis apropriadas.
  5. Ressuspender as pérolas em 1 ml de PBS-TBN por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
  6. Sedimentar as pérolas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
  7. Repita os passos 2.5 e 2.6.
    Nota: Isto proporciona um total de duas lavagens com PBS-TBN.
  8. Ressuspender as esferas acopladas e lavadas em 1 ml de PBS, 1% BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Armazenar as esferas acopladas num refrigerador entre 2-8 ° C no escuro.

3. Contagem Bead

  1. Prepara-se uma diluição das pérolas acopladas em água ou tampão PBS 1:10.
  2. Carga de 10 ul da diluição o grânulo em um hemocitómetro no ponto de introdução da amostra.
  3. Contar as esferas visto em um dos 4 x 4 grelhas de canto. Calcular o número total de pérolas acoplado usando a seguinte fórmula: Contagem (uma esquina da grade 4 x 4) x (1 x 10 4) x (factor de diluição) x volume de ressuspensão em ml.

4. Confirmação do Antigen Coupling

  1. Ressuspender a mistura estoque de esferas acopladas a antígenos de interesse pelo vórtice e sonicação por 20 s.
  2. Prepare uma mistura de pérolas para trabalhar diluindo os estoques talão acoplados a uma finalconcentração de 100 esferas / mL de cada grânulo único situado em tampão PBS-BSA a 1% (PBS-BSA a 1%, pH 7,4).
  3. Preparar pelo menos duas 7 diluições em série de anti-IgG de espécies de anticorpo primário de acordo com as recomendações do fabricante em placa de 96 poços de fundo redondo com tampão PBS-BSA a 1%.
  4. Pré-molhou uma coluna de oito poços separada (8 linhas) de uma placa de fundo de filtro de 96 poços para cada teste de confirmação de ligação de antigénio com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Adicionar 50 ul de mistura de pérolas para trabalhar (grânulos acoplado-antigénio) aos poços pré-molhado.
  5. Adicionar 50 ul de diluições de anticorpos de linhas 1-7 de cada coluna da placa de filtro de 96 poços e 50 ul de tampão BSA a 1%, PBS a linha 8 no lugar de anticorpo diluído para servir como poços de fundo. Misture com uma pipeta multi-canal pipetando cima e para baixo 5 vezes. Execute o mesmo procedimento para cada conjunto de esferas acopladas-antigénio a ser confirmada.
  6. Tampa e deixa-se incubar no escuro à tempratura durante 1 h num agitador de microplacas a 500 rpm. Remover o sobrenadante por aspiração.
  7. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repetir 1x. Ressuspender as esferas em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
  8. Diluir biotinilados anti-espécies anticorpo de detecção secundário IgG específica para 16 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
  9. Adicionar 50 uL de anticorpo secundário diluído a cada poço, pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
  10. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  11. Ressuspender as esferas em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
  12. Diluir repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
  13. Adicionar 50 ul de repórter para cada poço e misture pipetando cima e para baixo 5 vezes.
  14. Csobre a placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  15. Ressuspender as pérolas em 100 ul de PBS-BSA a 1% e analisar 50 ul usando o analisador 29.
    Nota: Os resultados do imunoensaio multiplex com base em grânulo são medidas de intensidade de fluorescência média (IFM). Sempre consulte a versão mais recente do manual do software, se disponível para evitar erros.

5. salivar Multiplex Immunoassay

  1. Remover saliva da -80 ° C congelador e deixa-se descongelar à temperatura ambiente.
  2. antígeno Ressuspenda acoplado stocks talão por vórtice e sonicação por 20 s.
  3. Prepara-se uma mistura de pérolas de trabalho por diluição das existências grânulo acoplados a uma concentração final de 100 esferas / mL de cada conjunto de esferas original em PBS-1% de BSA tampão.
  4. Prepara-se uma diluição de 1: 4 de saliva Wom PBS-1 de tampão BSA% em um 96 bem, placa poço profundo.
  5. placa de filtro pré-molhado com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração.
  6. Adicionar 50 ul de uma mistura de pérolas de trabalho e um volume igual de saliva diluída a 95 poços das placas de filtro de 96 poços para uma diluição de 1: 8 definitiva. Misture reacções com uma pipeta multi-canal. Para o controlo de uma cavidade, adicionar 50 grânulos acoplado-antigénio ul, mais 50 ul de PBS-1% BSA (tampão como um substituto para a saliva).
  7. Tampa e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 1 h num agitador de microplacas a 500 rpm. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  8. grânulos Ressuspender em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
  9. Dilui-se o anticorpo de detecção secundário anti-IgG humano de cabra biotinilado a 16 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
  10. Adicionar 50 ul de anticorpo secundário diluído a cada poço e misturar o conteúdo comuma pipeta multi-canal.
  11. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  12. grânulos Ressuspender em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
  13. Diluir repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
  14. Adicionar 50 ul repórter a cada poço e misture com uma pipeta multi-canal.
  15. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
  16. Ressuspender as pérolas em 100 ul de PBS-BSA a 1% e analisar 50 ul usando o analisador 29.
    Nota: Os resultados do imunoensaio multiplex são medidos em unidades Mediana intensidade de fluorescência (MFI). Consulte sempre oa versão mais recente do manual de software, se disponível para evitar erros.

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Resultados

Um conjunto de esferas original foi utilizado como um controlo para medir a ligação não específica e amostra para amostra variabilidade. Estas esferas foram tratadas de forma idêntica ao antigénio esferas acopladas com a excepção de que não foram incubadas com qualquer antigénio no passo de acoplamento. IFM valores> 500 obtidos a partir das esferas de controlo incubadas com todas as amostras de saliva foram retirados da análise ainda mais devido à suspeita de contaminação do soro e as...

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Discussão

Estes resultados indicam que o método de imunoensaio em multiplex é útil para discriminar entre amostras de saliva que são imunopositivos ou immunonegative. Para determinar imunopositividade, um único ponto de corte foi desenvolvido através do cálculo da média mais três desvios-padrão do log transformado respostas IFM dos cordões desacoplados de controle testados com todas as amostras de saliva. O ponto de corte proporcionou a capacidade de avaliar a exposição e immunoprevalence a qualquer um único ou vários patógenos. ...

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Divulgações

A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos através do seu Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento financiada e gerida a pesquisa descrita aqui. Ele foi submetido a revisão administrativa da Agência e aprovado para publicação. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação para o uso.

Agradecimentos

Clarissa Curioso foi apoiada por meio de uma nomeação para o Programa de Participação em Pesquisa da Agência de Proteção Ambiental dos EUA, administrado pelo Instituto Oak Ridge de Ciência e Educação por meio de um acordo interagências entre o Departamento de Energia dos EUA e a EPA dos EUA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento e Software
MicrocentrifugeThermo Electron Corporation75002446Utilizado para centrifugar amostras
Misturador de vórticesVWRG560Utilizado para misturar amostras
Sonicator (mini)Fisher Scientific15-337-22Utilizado para separar esferas
Pipetadores P10, P20, P100, P1000, 8 ch. CappVários
Hemacitômetros (Linha Brilhante)Housser Scientific 3200Usado para contar contas acopladas
Coletor de vácuo multitelaMilliporeMSVMHTS00Usado em etapas de lavagem para remover o sobrenadante
MicroShakerVWR12620-926Usado para agitar contas durante incubações
Suporte para tubos (1,5 ml e 0,5 ml) (sortido)VWR30128-346
BalançaMettler ou outroUsado para medir reagentes de lavagem para fazer tampões
Misturador de amostras DynabeadInvitrogen947-01Usado durante a etapa de incubação do acoplamento
MatLab (R2014b)The MathWorks, Inc.Usado para analisar dados de resposta de anticorpos
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationUsado para analisar dados de resposta de anticorpos
Luminex Analyzer com software xPonent 3.1Luminex CorporationLX200-XPON3.1Instrumento e software usados para executar
ensaiosAntigens
GI.1 Vírus Norwalk: partícula pXi Jiang (CCHMC)*NA*Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 µg.
GII.4 Norovírus VA387: partícula pXi Jiang (CCHMC)*NA*Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 µg.
Vírus da hepatite A: concentrado de grau II de cultura de célulasMeridian Life Sciences8505Antígeno acoplado a 100 µ g
Helicobacter pylori: lisadoMeridian Life SciencesR14101Antígeno acoplado a 25 µ g
Toxoplasma gondii: p30 recombinante (SAG1)Meridian Life SciencesR18426Antígeno acoplado a 25 µ g
Campylobacter jejuni: células inteiras mortas pelo calorKPL50-92-93Antígeno acoplado a 50 µ g
Anticorpos primários
Guinea pig anti-Norovirus(CCHMC)*NAUsado para confirmação de acoplamento
Camundongo anti-hepatite A IgGMeridian Life SciencesC65885MUsado para confirmação de acoplamento
Camundongo anti-hepatite A IgGMeridian Life SciencesC65885MUsado para confirmação de acoplamento
Anticorpo purificado BacTraceAffinity para Helicobacter pyloriKPL01-93-94Usado para confirmação de acoplamento
PAb de cabra para Toxoplasma gondiiAbcamAb23507Usado para confirmação de acoplamento
BacTrace Cabra anti-Campylobacter espécieKPL01-92-93Usado para confirmação
de acoplamentoSecundário  Anticorpos
Biotin-SP-Conjugado AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson705-065-149Usado para confirmação de acoplamento
Coelho biotinilado anti-Goat IgG (H+L)KPL16-13-06Usado para confirmação de acoplamento
Cabra biotinilada anti-Mouse IgG (H+L)KPL16-18-06Usado para confirmação
de acoplamentoAfinidade Purificada Anticorpo Biotina Rotulado Cabra anti-Coelho IgG (H+L)KPL176-1506Usado para confirmação de acoplamento
Consumíveis
tubos de microcentrífuga de copolímero de 1,5 mlUSA Scientific1415-2500Usado como tubos de microcentrífuga de baixa ligação
10 µ l recargas de ponteira de pipetaBioVentures5030050C
200 µ l recargas de ponteira de pipetaBioVentures5030080C
1,000 µ l recargas de ponta de pipetaBioVentures5130140C
Folha de alumínioVários fornecedoresUsado manter as contas no escuro durante as incubações
Placas de poços profundosVWR40002-009Usado para diluir amostras de saliva
Placas de filtro multitelaMilliporeMABVN1250Usado para executar ensaios
Sistema de coleta de saliva OracolMalvern Medical Desenvolvimentos LimitadosUsado para coleta
de salivaReagentes
Microesferas carboxiladas (grânulos)Luminex CorporationDependente do conjunto de grânulosantígenos são acoplados às microesferas
EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida)Pierce77149 ou 22980Usado na ativação
do grânuloSulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)Pierce24510Usado na ativação do grânulo
Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml)Sondas MolecularesS-866Usado como repórter
MES (ácido 2-[N-Morpholino]etanossulfônico)SigmaM-2933Usado para acoplamento
Tween-20 (monolaurato de polioxietilenoorbitano)SigmaP-9416Usado no tampão de lavagem para remover tampões de <> ligação não específicos
< / forte >
< forte > PBS-TBN Buffer de bloqueio / armazenamento (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azida, pH 7,4) < / forte > **Filtro Esterilize e armazene a 4 ° C
PBS, pH 7,4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
BSASigmaA-78880,1% (p/v)
Tween-20SigmaP-94160,2% (v/v)
Azida de sódio (0,05% azida)**SigmaS-8032**Cuidado: A azida de sódio é agudamente tóxica. Evite o contato com a pele e os olhos. Use EPIs apropriados. Descarte de acordo com as leis aplicáveis.
MES/Tampão de acoplamento (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ácido etanossulfônico)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
Tampão de ensaio (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  < / forte >Filtro Esterilize e armazene a 4 graus; C
PBS, 1% BSA, pH 7,4SigmaP-3688138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2) < / forte >Filtro Esterilize e armazene a 4 ° C
NaH2PO4 (fosfato de sódio, anidro monobásico)SigmaS-31390,1 M NaH2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)Filter Esterilize e armazene a 4 ° C
PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN
Os

Referências

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