No atual clima de escassez de recursos, estão surgindo novas tecnologias que permitem aos pesquisadores realizar estudos de forma mais barata, rápida e precisa. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares baseado em esferas para medir a exposição humana a vários patógenos ambientais simultaneamente.
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Artigo de método
O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais
Neste artigo
Resumo
Resumo
A etiologia e os impactos da exposição humana aos patógenos ambientais são uma grande preocupação no mundo inteiro e, assim, a capacidade de avaliar a exposição e infecções usando rentáveis, abordagens de alto rendimento seria indispensável. Este manuscrito descreve o desenvolvimento e análise de um imunoensaio baseado em multiplex-grânulo capaz de medir a presença de anticorpos na saliva humana a vários patógenos simultaneamente. Saliva é particularmente atraente nesta aplicação porque é não-invasivo, mais barato e mais fácil de recolher além do soro. Os antigénios de agentes patogénicos ambientais foram acoplados a microesferas carboxiladas (grânulos) e utilizado para medir os anticorpos em volumes muito pequenos de amostras de saliva humana utilizando um ensaio solução-fase à base de grânulo. As esferas foram acoplados com antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovírus (G I.1 e G II.4) e vírus da hepatite A. Para assegurar que os antigénios foram suficientemente acoplado aas contas, o acoplamento foi confirmada usando, anticorpos de captura primária de origem animal espécie-específicos, seguido de incubação com biotinilados anti-espécies anticorpos de detecção secundárias e repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como um controlo para medir a ligação não específica, um conjunto de esferas foi tratada de forma idêntica aos outros, excepto que não foi acoplado a qualquer antigénio. As esferas juntamente com antigénio e de controlo foram então incubados com amostras de saliva humana prospectivamente-recolhidos, medido num analisador de alto rendimento com base nos princípios de citometria de fluxo, e a presença de anticorpos para cada antigénio foi medida em unidades de intensidade média de fluorescência (IMF) . Este imunoensaio multiplex tem um número de vantagens, incluindo mais dados com menos de amostra; redução de custos e de trabalho; e a capacidade de personalizar o ensaio para muitos alvos de interesse. Os resultados indicam que o imunoensaio multiplex salivar pode ser capaz de identificar as exposições e infecções anteriores, que pode ser especially útil em estudos de vigilância envolvendo grandes populações humanas.
Introdução
Oitenta e oito por cento das doenças relacionadas com a diarreia em todo o mundo está associada à exposição humana à água contaminada, alimentos não seguros, e falta de saneamento / higiene, causando cerca de 1,5 milhões de mortes, a maioria dos quais são crianças 1. Esta é uma das principais causas de preocupação para os funcionários de saúde pública e os decisores políticos. Em um esforço para investigar exposições e doenças associadas à base de água e de outros patógenos ambientais, foi desenvolvido um imunoensaio multiplex para medir anticorpos em amostras humanas 2-4. Este método pode ser aplicado a estudos epidemiológicos para determinar a....
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Protocolo
A aprovação foi obtida a partir do Institutional Review Board (IRB # 08-1844, da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, NC, EUA) para a recolha de amostras de saliva crevicular estimulados de banhistas em Boquerón Beach, Puerto Rico, como parte dos Estados Unidos Environmental Protection Agency (EPA) epidemiológica Nacional e Avaliação ambiental de recreio (neear) Estudo de água 23 para avaliar as exposições e doenças de natação associado. Os sujeitos do estudo forneceu consentimento informado e foram instruídos sobre o uso do dispositivo de recolha de saliva por empreiteiros USEPA treinados. As amostras de saliva foram enviadas em gelo e, após a ....
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Resultados
Um conjunto de esferas original foi utilizado como um controlo para medir a ligação não específica e amostra para amostra variabilidade. Estas esferas foram tratadas de forma idêntica ao antigénio esferas acopladas com a excepção de que não foram incubadas com qualquer antigénio no passo de acoplamento. IFM valores> 500 obtidos a partir das esferas de controlo incubadas com todas as amostras de saliva foram retirados da análise ainda mais devido à suspeita de contaminação do soro e as.......
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Discussão
Estes resultados indicam que o método de imunoensaio em multiplex é útil para discriminar entre amostras de saliva que são imunopositivos ou immunonegative. Para determinar imunopositividade, um único ponto de corte foi desenvolvido através do cálculo da média mais três desvios-padrão do log transformado respostas IFM dos cordões desacoplados de controle testados com todas as amostras de saliva. O ponto de corte proporcionou a capacidade de avaliar a exposição e immunoprevalence a qualquer um único ou vários patógenos. .......
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Divulgações
A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos através do seu Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento financiada e gerida a pesquisa descrita aqui. Ele foi submetido a revisão administrativa da Agência e aprovado para publicação. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação para o uso.
Agradecimentos
Clarissa Curioso foi apoiada por meio de uma nomeação para o Programa de Participação em Pesquisa da Agência de Proteção Ambiental dos EUA, administrado pelo Instituto Oak Ridge de Ciência e Educação por meio de um acordo interagências entre o Departamento de Energia dos EUA e a EPA dos EUA.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento e Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Utilizado para centrifugar amostras |
| Misturador de vórtices | VWR | G560 | Utilizado para misturar amostras |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Utilizado para separar esferas |
| Pipetadores P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Vários | |
| Hemacitômetros (Linha Brilhante) | Housser Scientific | 3200 | Usado para contar contas acopladas |
| Coletor de vácuo multitela | Millipore | MSVMHTS00 | Usado em etapas de lavagem para remover o sobrenadante |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Usado para agitar contas durante incubações |
| Suporte para tubos (1,5 ml e 0,5 ml) (sortido) | VWR | 30128-346 | |
| Balança | Mettler ou outro | Usado para medir reagentes de lavagem para fazer tampões | |
| Misturador de amostras Dynabead | Invitrogen | 947-01 | Usado durante a etapa de incubação do acoplamento |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Usado para analisar dados de resposta de anticorpos | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Usado para analisar dados de resposta de anticorpos | |
| Luminex Analyzer com software xPonent 3.1 | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrumento e software usados para executar |
| ensaiosAntigens | |||
| GI.1 Vírus Norwalk: partícula p | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 µg. |
| GII.4 Norovírus VA387: partícula p | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 µg. |
| Vírus da hepatite A: concentrado de grau II de cultura de células | Meridian Life Sciences | 8505 | Antígeno acoplado a 100 µ g |
| Helicobacter pylori: lisado | Meridian Life Sciences | R14101 | Antígeno acoplado a 25 µ g |
| Toxoplasma gondii: p30 recombinante (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antígeno acoplado a 25 µ g |
| Campylobacter jejuni: células inteiras mortas pelo calor | KPL | 50-92-93 | Antígeno acoplado a 50 µ g |
| Anticorpos primários | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Usado para confirmação de acoplamento |
| Camundongo anti-hepatite A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Usado para confirmação de acoplamento |
| Camundongo anti-hepatite A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Usado para confirmação de acoplamento |
| Anticorpo purificado BacTraceAffinity para Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Usado para confirmação de acoplamento |
| PAb de cabra para Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Usado para confirmação de acoplamento |
| BacTrace Cabra anti-Campylobacter espécie | KPL | 01-92-93 | Usado para confirmação |
| de acoplamentoSecundário Anticorpos | |||
| Biotin-SP-Conjugado AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Usado para confirmação de acoplamento |
| Coelho biotinilado anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Usado para confirmação de acoplamento |
| Cabra biotinilada anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Usado para confirmação |
| de acoplamentoAfinidade Purificada Anticorpo Biotina Rotulado Cabra anti-Coelho IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | Usado para confirmação de acoplamento |
| Consumíveis | |||
| tubos de microcentrífuga de copolímero de 1,5 ml | USA Scientific | 1415-2500 | Usado como tubos de microcentrífuga de baixa ligação |
| 10 µ l recargas de ponteira de pipeta | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µ l recargas de ponteira de pipeta | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 µ l recargas de ponta de pipeta | BioVentures | 5130140C | |
| Folha de alumínio | Vários fornecedores | Usado manter as contas no escuro durante as incubações | |
| Placas de poços profundos | VWR | 40002-009 | Usado para diluir amostras de saliva |
| Placas de filtro multitela | Millipore | MABVN1250 | Usado para executar ensaios |
| Sistema de coleta de saliva Oracol | Malvern Medical Desenvolvimentos Limitados | Usado para coleta | |
| de salivaReagentes | |||
| Microesferas carboxiladas (grânulos) | Luminex Corporation | Dependente do conjunto de grânulos | antígenos são acoplados às microesferas |
| EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida) | Pierce | 77149 ou 22980 | Usado na ativação |
| do grânuloSulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) | Pierce | 24510 | Usado na ativação do grânulo |
| Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml) | Sondas Moleculares | S-866 | Usado como repórter |
| MES (ácido 2-[N-Morpholino]etanossulfônico) | Sigma | M-2933 | Usado para acoplamento |
| Tween-20 (monolaurato de polioxietilenoorbitano) | Sigma | P-9416 | Usado no tampão de lavagem para remover tampões de <> ligação não específicos |
| < / forte > | |||
| < forte > PBS-TBN Buffer de bloqueio / armazenamento (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azida, pH 7,4) < / forte > ** | Filtro Esterilize e armazene a 4 ° C | ||
| PBS, pH 7,4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0,1% (p/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0,2% (v/v) |
| Azida de sódio (0,05% azida)** | Sigma | S-8032 | **Cuidado: A azida de sódio é agudamente tóxica. Evite o contato com a pele e os olhos. Use EPIs apropriados. Descarte de acordo com as leis aplicáveis. |
| MES/Tampão de acoplamento (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ácido etanossulfônico) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Tampão de ensaio (PBS, 1% BSA, pH 7.4) < / forte > | Filtro Esterilize e armazene a 4 graus; C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7,4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2) < / forte > | Filtro Esterilize e armazene a 4 ° C | ||
| NaH2PO4 (fosfato de sódio, anidro monobásico) | Sigma | S-3139 | 0,1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4) | Filter Esterilize e armazene a 4 ° C | ||
| PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN |
Referências
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al.
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Reimpressões e permissões
