Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Summary

Aqui descrevemos um método imunoquímico sensível para mapear a distribuição espacial de derivados de oxidação de 5mC com base no uso de anticorpos secundários conjugados com peroxidase e amplificação de sinal de tiramida.

Abstract

A metilação de bases de citosina (5-metilcitosina, 5mC) que ocorre em genomas de vertebrados é geralmente associada ao silenciamento transcricional. 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina (5fC) e 5-carboxilcitosina (5caC) são as bases de citosina modificadas recentemente descobertas produzidas pela oxidação enzimática de 5mC, cujas funções biológicas permanecem relativamente obscuras. Várias abordagens, desde técnicas bioquímicas até técnicas baseadas em anticorpos, foram empregadas para estudar a distribuição genômica e o conteúdo global dessas modificações em vários sistemas biológicos. Embora algumas dessas abordagens possam ser úteis para a avaliação quantitativa dessas formas modificadas de 5mC, a maioria desses métodos não fornece nenhuma informação espacial sobre a distribuição dessas modificações de DNA em diferentes tipos de células, necessárias para a correta compreensão de seus papéis funcionais. Aqui apresentamos um método altamente sensível para detecção imunoquímica das formas modificadas de citosina. Este método permite a co-detecção dessas marcas epigenéticas com marcadores de linhagem de proteínas e pode ser empregado para estudar sua localização nuclear, contribuindo assim para decifrar seus potenciais papéis biológicos em diferentes contextos experimentais.

Introduction

Metilação de bases de citosina no DNA (5mC) representa uma importante marca epigenética encontrado em vertebrados genomas associadas a transcrição silenciamento ^1. 5mC está a ser introduzido e mantido pela ADN metiltransferases ^2-5, e tem sido demonstrado que desempenham papéis importantes numa série de processos biológicos incluindo imprinting genômico, inactivação do cromossoma X, a diferenciação celular, e desenvolvimento de ^{3, 6.} Em consequência, a interrupção de padrões de 5mC genómicas está associada com um número de doenças ^{7, 8-11.} Apesar dos progressos na compreensão papel 5mC no desenvolvimento e na doença, ainda é permanecem largamente desconhecidos como esta marca está sendo removido no desenvolvimento e tecidos adultos. Vários mecanismos potenciais de desmetilação de ADN foram recentemente propostas incluindo mecanismos ativos e passivos desmetilação ^{12, 13, 14, 15.} Descoberta dos produtos de 5mC oxidação sequencial mediadas por 1011 translocação enzymES (tet1 / 2/3), tais como 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), e 5-carboxylcytosine (5caC) em eucariótica de ADN ^{16, 17, 18, ​​19} solicitado especulações se eles podem servir como intermediários de processos desmetilação de ADN ou marcas epigenéticas agir como estáveis ​​em seu próprio direito ^13. Enquanto a demonstração de que o componente de base de reparo de excisão, glicosilase-DNA timina (TDG) pode ligar e remover tanto 5FC e 5caC de DNA ^{19, 20} sugere um papel para os derivados 5mC modificados numa desmetilação DNA ativo. Evidências recentes mostram que 5FC / 5caC pode modular a taxa de pontos de processabilidade RNA II para o potencial envolvimento destas marcas na regulação da transcrição ^29. Devido a este potencial importância biológica das formas oxidadas de 5mC, uma variedade de técnicas bioquímicas e de anticorpos com base têm sido utilizados para estudar a sua distribuição genómico e conteúdo global ^{16, 19-24.}

Dado que a maioria de Tele vertebrado órgãos consistem em diferentes tipos de células e que a distribuição das bases de citosina modificadas é o tecido e tipo celular específico ^{16-18, 20, 23, 25-27,} determinar a distribuição espacial dos derivados oxidados 5mC em diferentes tecidos torna-se um importante experimental tarefa necessária para revelar as suas funções biológicas. A maioria das abordagens bioquímicas e de anticorpos com base não fornecem qualquer informação espacial em relação à distribuição das formas modificadas de 5mC no tecido diferente e tipos de células. Em contraste, técnicas de imunoquímica base pode proporcionar uma ferramenta para a avaliação rápida da distribuição espacial e localização nuclear de 5mC ²⁸ e os seus derivados oxidados ^20. O que é dito, o relatado muito baixa abundância de 5FC (20 em cada 10 ⁶ citosina) e 5caC (3 em cada 10 ⁶ citosina) no genoma do rato ¹⁸ representa um desafio significativo para imunoquímica padrão.

Aqui,descrevemos um método imunoquímico altamente sensível que proporciona robusta e uma rápida detecção da forma oxidada de citosina no tecido cerebral de mamífero. Com a incorporação de anticorpos secundários conjugados com peroxidase acoplada com um passo de amplificação de sinal, este método evita os desafios de detectar a quantidades muito baixas de 5FC e 5caC. Além disso, esta técnica pode ser utilizada para co-detectar as formas modificadas de citosina com marcadores específicos de linhagem, que complementa eficazmente outras abordagens em elucidar as funções biológicas destas marcas epigenética.

Protocol

Todos os procedimentos envolvidos em animais foram realizados de acordo com o comitê de ética da Universidade de Nottingham de.

1. Seleção de preparação do tecido apropriado para imunocoloração

1. Gerar secção embebidos em parafina de embriões de tipo selvagem de ratinho CD1 e tecidos do cérebro adulto, conforme descrito anteriormente ^25. Usar secções de tecido do cérebro fixadas com formaldeído a 4%, quer (FA) ou paraformaldeído a 4% (PFA) para o método de imunocoloração ^25.
   NOTA: O uso de cortes de tecido embebidos em parafina requer de-depilação antes da marcação de anticorpos. Uma vez que o tratamento com 2-4 M de ácido clorídrico (HCl) empregada no protocolo para a desnaturação do DNA não é compatível com a maioria das estratégias de recuperação antigênica, recomendamos o uso de qualquer seções cryo- ou micrótomo para co-detecção de derivados de oxidação 5mC com proteína marcadores.

2. Desparafinação parafina tecido embebido secções < / P>

1. Em uma cabine de segurança classe running II, lavar a parafina secções de tecido embebidas numa jarra de Coplin cheio com xileno, 2 vezes para 10 minutos cada em temperatura ambiente.
   NOTA: É importante a utilização de xileno fresco como parafina remoção incompleta pode conduzir a padrões de coloração inconsistentes.
2. Depois da-cera, re-hidratar rapidamente as secções de tecido por lavagem consecutivamente em 95, 75, e 50% de etanol durante 10 minutos cada à temperatura ambiente.

3. Fixação e permeabilização de Cryo- e secções do micrótomo

1. Fixar as secções de tecido re-hidratadas, colocando-os em qualquer gelo frio PFA a 4% ou 4% de FA durante 15 min à TA.
2. Remover o excesso de fixador por lavagem das secções em PBS (salina tamponada com fosfato) durante 5 min à TA.
3. Permeabilizar as secções de tecido, colocando num frasco Coplin preenchido com o PBX (0,5% de Triton X-100 em PBS) durante 30 min à TA. Retire o excesso de PBX por lavagem das secções em breve em PBT (0,01% de Tween 20 em PBS).

jove_title "> 4. imunocoloração para oxi-5mC Derivativos

1. Coloque as secções permeabilizadas em HCl 2 N durante 60 min à TA durante despurinação do DNA.
   Nota: Embora as concentrações mais elevadas de HCl (por exemplo, 4 N) conduz a uma desnaturação do DNA mais eficiente, que não são compatíveis para co-detecção de oxi-MCS com DAPI.
2. Coloque as secções em Tris-HCl a 10 (pH 8,5) durante 30 min à temperatura ambiente para neutralizar o HCl. Em alternativa, as secções lavar três vezes durante 5 minutos cada em PBS. Incubam-se as secções em PBT durante 5 min à TA.
3. Remova cuidadosamente o líquido da área circundante a secção de tecido, sem deixar que a secção de tecido secar completamente em qualquer etapa agitando suavemente o slide. Use uma caneta barreira hidrofóbica para cercar a seção sem tocar na seção.
   NOTA: A caneta barreira hidrofóbica reduz o volume de anticorpo necessário para manchar o tecido e pode permitir várias seções de ser marcadas com differenanticorpos t no mesmo slide.
4. Incubar secções em 100 ul de solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 10% em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara húmida.
   NOTA: Ignorar este passo não afetaria a eficiência da coloração das bases de citosina modificadas.
5. Incubam-se as secções de tecido em 100 ul de uma diluição 1: 5000 de anticorpo monoclonal anti-5hmC e uma diluição 1: 1000 de anticorpos primários policlonais de coelho anti-5caC na solução durante 1 h à TA, o bloqueio numa câmara húmida. Alternativamente, realizar a incubação durante a noite a 4 ° C, se necessário.
   NOTA: Secções processados ​​sem anticorpos primários podem servir como controlos negativos adequados para o processo de coloração. As secções de 12,5 dias pós-embrionárias de murídeo enriquecidas em coitum cerebrais 5caC, 5FC e 5hmC ²⁰ pode ser usado como controlo positivo.
6. Remover o excesso de anticorpos por lavagem das secções em um frasco Coplin preenchido com PBT três vezes durante 5 min cada em uma bobinajar lin à temperatura ambiente.
   NOTA: O aumento do volume de soluções de lavagem pode reduzir a coloração de fundo.
7. Remover o excesso de PBT e, se necessário, rodear as secções mais uma vez com a caneta barreira hidrofóbica como PBT conter detergente que pode enfraquecer a barreira hidrofóbica.
8. Fazer uma diluição 1: 400 de anticorpo conjugado com HRP de cabra anti-coelho e uma diluição 1: 400 de anticorpo-555 conjugado de burro anti-rato em solução de bloqueio.
9. Incubam-se as secções de tecido em 100 ul de mistura de anticorpo secundário a partir do passo 4.9 durante 1 hora à temperatura ambiente numa câmara húmida.
10. Lavam-se as secções de tecido em um frasco Coplin preenchido com PBT três vezes durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
11. Coloque as secções de tecido em 100 ul de uma diluição 1: 200 de tiramida no tampão de amplificação de sinal de tiramida durante 2 min à temperatura ambiente.
12. Imediatamente, remover a solução de tiramida excesso por lavagem das lâminas três vezes durante 5 min cada em PBT.
13. carefully remover o excesso de PBT e cobrir imediatamente as seções com uma gota de um meio de montagem (veja Lista de Materiais).
14. Delicadamente, coloque uma lamela sobre os cortes de tecido e selar imediatamente a lamela com unha polonês.
15. Armazenar as secções de tecidos a 4 ° C durante várias horas antes do exame microscópico. Examinar sob um microscópio de fluorescência a 405, 488 e / ou 555 nm (10 - ampliação de 40X).

Results

Para determinar a distribuição de 5hmC em secções de tecido cerebral, foi realizado co-detecção desta modificação epigenética com um marcador para neurónios pós-mitóticos, NeuN, empregando anticorpo-5hmC anti comercial que interage especificamente com esta marca, mas não com outras formas de modificação citosina ^{20, 25.} a análise imuno-histoquímica de distribuições 5hmC e 5caC no cérebro adulto revelou que, enquanto a coloração proeminente 5hmC co-localiza com as células positivas NeuN, células gliais NeuN-negativas possuem níveis mais baixos de 5hmC genómico (Figura 1) ^20.

Recentemente, mostrou que a oxidação 5mC Tet-dependente é operatório durante a especificação das linhagens de células-tronco neurais (NCCC) ^20. Apesar de ser imunoquimicamente indetectável no NSC, 5FC e 5caC exibem imuno proeminente nas primeiras fases de diferenciação NSC no sentido neuronal uma nd linhagens gliais. Ambas as marcas transitoriamente acumular concorrentemente com a aparência de marcadores de diferenciação neuronal e glial precoce ^20. Para determinar a distribuição de 5caC na diferenciação NSC nós realizadas co-coloração deste traço com um marcador glial GFAP sobre as culturas fixadas de NSC aos 3 dias de indução da diferenciação glial. Ao contrário de NSC ou astrócitos maduros (dados não apresentados), observou-se sinal forte em 5caC relativamente grande proporção das células que expressam GFAP nestas culturas (Figura 2) ^20.

Figura 1. Co-imunocoramento 5hmC (verde) com NeuN (vermelho) no tecido adulto Cérebro contrastadas com DAPI (azul). Os canais individuais ea exibição mesclada são mostrados. As barras de escala são de 25 uM.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Co-imunocoramento 5caC com GFAP na cultura do NSC no dia 3 de glial diferenciação. Os canais individuais ea exibição mesclada são mostrados. Barras de escala são 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Embora a baixa abundância relatado de derivados de oxidação 5mC, 5FC e 5caC em alguns tecidos iria apresentar limitações significativas para um protocolo imunoquímica standard, a incorporação de anticorpos secundários conjugados com peroxidase permitiu a detecção dessas modificações citosina em tecidos e células fixas (Figura 2) . No entanto, o tempo de incubação óptimo com a solução tiramida devem ser optimizadas experimentalmente para cada lote individual de tiramida kit de amplificação de sinal em que uma relação linear entre a intensidade do sinal e a duração de amplificação de sinal com base tiramida é observada, para indicações referem-se Almeida et ai 2012 ^26. . Além disso, a relação sinal / fundo pode ser significativamente aumentada através da realização das lavagens em um frasco Coplin para permitir a remoção eficiente do excesso de anticorpos. Após a incubação com uma solução de tiramida, é importante para parar imediatamente a reacção por lavagem em solução de d PBTfundo ecrease coloração. É crítico para não permitir que as secções para secar a qualquer momento durante o procedimento.

A eficiência de despurinação de ADN pode ser melhorada por se realizar a reacção a depurinação a 37 ° C. Enquanto utilizando HCl 4 N em vez de 2 N melhora a coloração das formas modificadas de 5mC utilizando HCl 4 N para a despurinação do DNA não iria permitir a co-coloração com DAPI, à medida que interage exclusivamente com o ADN de cadeia dupla.

Embora esta técnica pode fornecer uma avaliação semi-quantitativa robusta das formas modificadas de bases de citosina onde detectável, ele não pode ser usado para avaliar os níveis absolutos de seus derivados de oxidação ou 5mC. Portanto, recomendamos a utilização de outros complementares, mas quantitativa aproxima ^{16, 19 -24.} Desde a descoberta de derivados de oxidação 5mC em genomas de mamíferos, várias abordagens têm sido desenvolvidas para estudar os seus papéis biológicos ^{16, 19-24.} Embora estes approaches pode ser valiosa na determinação dos níveis absolutos de derivados de oxidação 5mC, eles não fornecem informações relativas à sua distribuição espacial ^{20, 26.} Temos utilizado com sucesso o método descrito aqui para mapear a distribuição espacial e localização de derivados de oxidação 5mC em diferentes tipos de células do desenvolvimento e cérebro adulto ²⁰

Ao revelar sua distribuição espacial ^20, esta técnica pode ser crucial para compreender as implicações biológicas e o destino de derivados oxidados de 5mC em vários contextos biológicos onde estes derivados modificados de 5mC podem ser detectados incluindo diferenciação celular, desenvolvimento e doença. Além disso, o método aqui descrito pode dar avaliação semi-quantitativa dos derivados oxidados de 5mC em diferentes tecidos, avaliando a cinética de reacção de peroxidase (que é proporcional à intensidade de coloração) em diferentes tempos de incubação com tyramide ^26.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Frasco Coplin	Cole-Parmer	UY-48585-30	Feito de vidro
Xileno			Use apenas em cabine de segurança Classe II
Tampão fosfato salino (PBS)	Fisher Scientific	12821680	pH 7.5, filtrado antes
do uso 4% de paraformaldeído (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Uma vez feito pode ser armazenado a -20 ° C em aliquotes por vários meses 4
% formaldeído  (FA)	Sigma Aldrich	F8775	Uma vez feito pode ser armazenado a -20 ° C em aliquotes por vários meses
Etanol, anidro desnaturado, grau histológico	Sigma Aldrich	64-17-5	95, 75, 50% em PBS
0,01% Tween 20 em PBS	Sigma Aldrich	P9416	PBT
0,5% Triton X-100 em PBS	Sigma Aldrich	X100	PBX
2 N HCl	Sigma Aldrich	71826	cuidado extremamente tóxico
100 mM Tris-HCl	Promega	H5121	pH ajustado a 8,5
caneta de barreira hidrofóbica	Abcam	ab2601	para imuno-histoquímica
Câmara de umidade deslizante	Laboratório de dispositivos científicos	197-BL
anticorpo de camundongo anti-5mC	Diagenode	C15200081	anticorpo primário monoclonal
Anticorpo anti-5hmC	Motivo ativo	39791	coelho policlonal anticorpo primário
Anti-5caC Anticorpo	ativo Motivo ativo	61225	anticorpo primário policlonal de coelho
Anti-coelho conjugado com peroxidase Anticorpo secundário	Dako	K1497
555-congjuado anticorpo anti-camundongo de cabra	Sondas moleculares	A-11005	anticorpo secundário
10% BSA	Sigma Aldrich	A9418	Solução de bloqueio
22 x 32 mm Lamínulas de cobertura de vidro	BDH	406/0188/24
Sistema de amplificação de sinal de tiramida	Perkin Elmer	NEL741001KT	Outros anticorpos secundários conjugados com fluorochome podem ser usados para co-detecção de oxi-5mC
Meio de montagem com DAPI	Vector Labs	H-1200
Esmalte
frango policlonal anti-GFAP anticorpo policlonal	Thermo Scientific	PA5-18598	:400 diluição
anti-NeuN anticorpo monoclonal de camundongo	Merck milipore	MAB377B	diluição 1:400