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Artigo de método

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

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DOI:

10.3791/54421

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18 de setembro de 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

Neste artigo

Resumo

Neste modelo de colite dirigida por antígeno, as células T OT-II CD4+ que expressam uma proteína fluorescente vermelha foram transferidas adotivamente para camundongos RAG-/- que expressam uma proteína fluorescente verde em fagócitos mononucleares (MPs). Os hospedeiros foram desafiados com Escherichia coli (E.coli) expressando a proteína ovalbumina (OVA) fundida a uma proteína fluorescente ciano (CFP).

Resumo

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma inflamação crônica que afeta o trato gastrointestinal (TGI). Uma das melhores maneiras de estudar os mecanismos imunológicos envolvidos durante a doença é o modelo de transferência de células T da colite. Neste modelo, camundongos imunodeficientes (receptores RAG-/-) são reconstituídos com células T CD4+ virgens de hospedeiros saudáveis do tipo selvagem.

Este modelo permite o exame dos primeiros eventos imunológicos que levam à doença e inflamação crônica, quando a inflamação intestinal se perpetua, mas não depende de um antígeno definido. Para estudar o papel potencial das células apresentadoras de antígenos (APCs) no processo da doença, é útil ter um modelo de doença orientado por antígeno, no qual um antígeno derivado de comensal definido leva à colite. Um modelo de colite conduzida por antígeno foi, portanto, desenvolvido. Neste modelo, as células T OT-II CD4 +, que podem reconhecer apenas epítopos específicos na proteína OVA, são transferidas para hospedeiros RAG-/- desafiados com E. coli que expressa CFP-OVA. Este modelo permite o exame das interações entre APCs e células T na lâmina própria.

Introdução

O intestino é a maior superfície do corpo que é exposta ao ambiente externo. Vastas matrizes de micróbios residentes colonizar o intestino humano para formar a microbiota intestinal (ou microflora). Este é estimado para consistir de até 100 trilhões de células microbianas e constitui um dos habitats bacterianas mais densamente povoadas conhecidos na biologia 1-3. No GIT bactérias colonizar um nicho intestinal onde eles sobreviver e se multiplicar 4. Em troca, a microbiota dota o anfitrião com características funcionais adicionais não codificados em seu genoma 1. Por exemplo a microbiota estimula a proliferação de células epiteliais, produz vitaminas que hospeda não pode produzir por si mesmas, regula o metabolismo e protege contra agentes patogénicos 4-6. Dada esta relação benéfica, alguns autores têm sugerido que os seres humanos são "super-organismos" ou "holobionts", que são uma mistura de genes de bactérias e humanos 7,8. Dado o impacto benéfico da microbiota do hospedeiro (humano), o sistema imunitário do intestino necessita de tolerar micróbios comensais para permitir a sua existência no lúmen, mas também matar os patogénios que invadem a partir do lado luminal 9-11. O sistema imunológico intestinal tem desenvolvido mecanismos para distinguir entre os micróbios luminais inofensivos e potencialmente prejudiciais; No entanto, estes mecanismos ainda não são bem compreendidos 12. Manter a integridade intestinal requer uma homeostase imune fortemente regulada para manter o equilíbrio entre tolerância e imunidade 13. Um desequilíbrio na homeostase imune contribui para a indução de doenças intestinais, tais como doença inflamatória do intestino (IBD) 3,14.

Existem dois principais tipos de DII: doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC). Os pacientes com estas doenças geralmente sofrem de sangramento retal, diarréia severa e dor abdominal 15,16. A única causa da DII ainda édesconhecida, mas uma combinação de fatores genéticos, influências ambientais e respostas imunes desreguladas pode ser o evento chave para o desenvolvimento da doença 15.

Modelos animais para IBD têm sido utilizados por mais de 50 anos. Nas últimas décadas foram desenvolvidos novos sistemas modelo IBD para testar as várias hipóteses relativas à patogénese da DII 17,18. O modelo melhor caracterizado de colite crónica é o modelo de transferência de células T que induz perturbações da homeostase de células T 19,20. Este modelo envolve a transferência de células T naive a partir de ratinhos imunocompetentes em hospedeiros que não têm T e as células B (tais como RAG - / - e ratinhos SCID) 16,21. O desenvolvimento da doença neste modelo é monitorizada durante 3-10 semanas por avaliação da presença de diarreia, a redução da actividade física, e perda de peso corporal. Este é assim chamado a síndrome de caquexia 16. Em comparação com os ratos saudáveis ​​do tecido do cólon dos exércitos transplantados é thickeR, mais curtos e mais pesado 16. Utilizando o modelo de transferência de células T, é possível compreender como as diferentes populações de células T pode contribuir para a patogénese do IBD 22. O modelo de transferência de células T não analisar as interacções entre as APCs e as células T no processo da doença de uma forma específica para o antigénio. Demonstrou-se que uma interacção entre as células mielóides e células linfóides pode ser responsável pelo desenvolvimento de inflamação intestinal 23. Embora muitos aspectos de DII foram clarificados, os eventos iniciais que conduzem ao desenvolvimento da doença têm ainda de ser claramente entendido.

Foi demonstrado que na ausência da colite transferência microbiota não pode ser estabelecida 24. Recentemente, várias teorias que sugerem IBD pode ser um resultado de uma resposta imunitária contra bactérias comensais 25. Os autores propuseram também que as bactérias comensais são essenciais para induzir a inflamação no intestino distal26. Em livre de germes (GF) os animais o sistema imunitário do intestino é geralmente deficientes 27,28, mas uma colonização destes ratos com uma mistura de-específica isentos de agentes patogénicos bactérias resulta no desenvolvimento do sistema imunitário intestinal totalmente competente 29. Assim, a microbiota parece ser um elemento chave na patogénese do IBD, ou como um mecanismo que predispõe para ou protege contra o desenvolvimento de inflamação intestinal 30,31. As teorias atuais sugerem que IBD é um resultado de desequilíbrio microbiano, chamado disbiose, em pacientes geneticamente predispostos 32, mas ainda não está claro se a disbiose é a causa ou a consequência da doença 12. Considerando o papel de microorganismos no desenvolvimento de DII, em experiências in vitro mostraram que as células T CD4 + podem ser activadas por APCs pulsadas com bactérias intestinais 33,34.

Além disso, demonstrou-se que os antigénios deespécies bacterianas diferentes comensais, tais como E. coli, Bacteroides, Eubacterium e Proteus, é capaz de activar células T CD4 + 35. Isto indica que a apresentação de antigénios bacterianos de células T é de importância para o desenvolvimento de IBD. Para reduzir a complexidade de múltiplos antigénios derivados pela microflora no processo da doença, de uma estirpe de E. coli foi criada que produz o antigénio OVA. Transferência colite foi induzida por injecção de células T específicas de OVA em RAG - / - de animais colonizado com E. expressam OVA coli.

Este modelo baseia-se em evidências recentes sugerindo que CX 3 CR1 + MPs, um grande subconjunto de células na lâmina do cólon (CLP) 36, estão interagindo com células T CD4 + durante a transferência de colite 37. MPs provar o lúmen intestinal para antígeno particulado, tais como bactérias, usando suas dendrites 36, 38,39. Estudos anterioresdemonstrou que MPs também pode levar até antigénios solúveis, tais como óvulos, introduzidos na intestinal lúmen 40,41. Dada a abundância de CX 3 CR1 + MPs no CLP, é possível que essas células podem provar bactérias luminais e interagir com células T CD4. De imagem confocal de murganhos transplantados com células específicas de OVA T CD4 + colonizadas com E. coli PCP-OVA, mostram que CX 3 CR1 + MPs estão em contacto com células AT-II T CD4 + durante o desenvolvimento de colite conduzido pelo antigénio. Este modelo permite o estudo do processo de apresentação de antigénio entre as APCs e as células intestinais T específicas apenas para determinadas bactérias que expressam os antigénios no lúmen do intestino.

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Protocolo

Os ratos foram criados e mantidos sob (SPF) condições específicas isentos de agentes patogénicos no biotério da Universidade de Ulm (Ulm, Alemanha). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do uso de animais local e comitê de cuidados e da Lei Nacional do Bem-Estar Animal.

1. Construção do plasmídeo de OVA pCFP

  1. Amplificar o gene de tamanho completo de OVA utilizando os iniciadores Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') e Ova_ClaI_rev (3'-GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 utilizando o plasmídeo pCI-OVA (resistente à ampicilina) 42 como um modelo. Clonar o produto de PCR (isto é, a sequência de codificação de OVA) em um fago mid-vector comercialmente disponível utilizando SpeI e ClaI restrições locais dos iniciadores e o vector para produzir o plasmídeo de OVA-específica.
  2. Amplificar o gene codificante da PCP em conjunto com o promotor constitutivo forte hiper P usando um plasmídeo pAD -cCFP (cloranfenicol resistente) 43 como um molde e os iniciadores CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') e CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Clonar o gene que codifica para PCP-OVA-plasmídeo específico (resistente à ampicilina), utilizando os locais de restrição Spel e SacI do vector e os iniciadores 37. Isto introduz um espaçador de 6 resíduos de glicina entre o PCP-codificação a partir da sequência de OVA-codificante.

2. Construção de E. coli pCFP-OVA

  1. Crescer E. coli estirpe DH10B em 100 ml de meio Luria Bertani (LB) aerobicamente a 37 ° C num agitador rotativo durante a noite.
  2. Misturar 800 mL de cultura bacteriana com 200 ul de glicerol para criar stock de glicerol e armazenar a -80 ° C.
  3. Adicionar 50? L de E. coli estirpe DH10B de stock de glicerol em 5 ml de meio LB e fazê-los crescer em condições aeróbias a 37 ° C num agitador rotativo overnight.
  4. Transferir a cultura num balão de Erlenmeyer de 1 L confundido com 250 ml de meio LB a 37 ° C em uma agitação rotativa.
  5. Crescer as bactérias a uma densidade óptica a 600 nm (OD 600) de 0,5 e, em seguida, arrefecer a cultura em gelo durante 30 min. Centrifugar as bactérias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  6. Ressuspender as bactérias com 100 mL de H 2 O esterilizada gelado e centrifugação as bactérias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Ressuspender as bactérias com 100 mL de gelo frio de 10% de glicerol e centrifugar as bactérias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este último passo duas vezes.
  7. Após o passo final de lavagem, ressuspender as bactérias em 700 ul de 10% de glicerol. Congelar 50 mL alíquotas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C.
  8. Descongelar uma alíquota de 50 ul em gelo e transferência para uma cuvete de electroporação de pré-gelada (2 mm distância entre os eléctrodos).
  9. Adicionam-se 5 ul de DNA de plasmídeo (100 ng) com 50 ul de E. aliquo colits. Execute eletroporação com um único pulso a 25 uF, 200 ohms (Ω) e 2,5 kV.
  10. bactérias Ressuspender em 1 ml de pré-aquecido meio SOC (5 g / l de extracto de levedura, 2 g / L de triptona, cloreto de sódio 10 mM, cloreto de potássio 2,5 mM, cloreto de magnésio 10 mM, sulfato de magnésio 10 mM) e incuba-se a 37 ° C aerobicamente durante 1 h.
  11. bactérias placa em placas de LB-agar suplementado com ampicilina a 100 ug / ml (adicionar 100 ul de um estoque de 100 mg de ampicilina / ml a 100 ml de LB-agar) e incubar durante a noite em condições aeróbias a 37 ° C.
  12. Escolha colónias individuais e re-raia-los em placas de LB-agar suplementado com ampicilina a 100 ug / ml. Incubar durante a noite em condições aeróbias a 37 ° C.
  13. Escolha colónias individuais e crescê-las durante a noite em 10 ml de meio LB suplementado com ampicilina a 100 ug / ml para isolamento de plasmídeos. Use disponível comercialmente mini-kit de preparação de plasmídeo e elui-se ADN de plasmídeo com 30 uL de dH 2 O (água destilada) de acordo com o fabricante '; S de protocolo. Verifique plasmídeos por análise de restrição e 37,42,43 de sequenciamento de DNA.
  14. Configurar uma cultura de clones positivos de E. coli pCFP-OVA em 100 ml de meio LB suplementado com ampicilina a 100 ug / ml. Crescem aerobicamente a 37 ° C num agitador rotativo durante a noite.
  15. Misturar 800 mL de cultura bacteriana com 200 ul de glicerol puro e armazenar a -80 ° C.
  16. Centrifuga-se o resto da cultura durante a noite a 5000 xg durante 10 min à temperatura ambiente (TA) e ressuspender o pellet em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Coloque 10 ml de suspensão em lâmina de vidro e cubra com uma lamela.
  17. Observar as amostras numa microscopia de fluorescência padrão para confirmar a expressão de fluorescência PCP-OVA (PCP excitação a 450 nm, emissão a 480 nm). Analisar as bactérias começam com aumento de 400X.
  18. Centrifugar 1 ml de bactérias a partir de culturas durante a noite a 5000 xg durante 10 min, TA. Ressuspender o sedimento em 40 ul dePBS e ferver a 95 ° C durante 10 min.
  19. Centrifugar as amostras a 30.000 xg durante 10 min e utilizar-se os sobrenadantes para análise de Western blot 37. Usar o anticorpo policlonal anti-OVA levantou-coelho diluída a 1: 400.

3. Geração de OT-II / Ratos Vermelho

  1. Cruzar um rato macho / fêmea OT-II com um rato fêmea / macho expressar a proteína fluorescente vermelha (ambas as estirpes disponíveis comercialmente), a fim de gerar ratinhos OT-II / Vermelho 37.

4. Isolamento celular Baço

  1. Eutanásia dos ratinhos OT-II / vermelho por deslocamento cervical depois de anestesia por inalação de éter qualquer halogenado (de até 5% por indução) comercialmente disponível.
  2. Use a tesoura para cortar a parte abdominal superiores esquerdo do mouse. Sob esta parte abdominal há o baço (forma oval com uma cor vermelho-escuro). Use tesouras e pinças para removê-lo.
    1. Extrair o baço dos ratinhos OT-II / vermelho e passá-la através de um 100coador de células uM posicionado sobre um tubo de 50 ml utilizando o êmbolo de uma seringa de 1 ml, a fim de se obter uma suspensão de célula única. Lavar o filtro duas vezes com 10 ml de PBS suplementado com 1% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS).
  3. Centrifugar a suspensão de células a 390 xg durante 5 min à TA. Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão pré-aquecido a lise (144 mM de NH4Cl, Tris 17 mM, pH = 7,2) para lisar as células vermelhas do sangue. Incubar 10 min a 37 ° C.
  4. Lava-se a amostra com 25 ml de PBS suplementado com 1% de FBS. Centrifugar a 390 xg durante 5 min à TA. Ressuspender o sedimento em 10 ml de PBS suplementado com 1% de FBS.
  5. Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Misturar 10 mL da suspensão de células com 10 uL de uma solução de Azul de Tripano a 0,4%. Incubar por 1-2 min.
    1. Encha a câmara de hemocitômetro com 10 ml de células coradas. Contagem de células ao microscópio em quatro 1 x 1 milímetro 2 quadrados de uma câmara e determinum e o número médio de células por metro quadrado. As células viáveis ​​aparecem glóbulos brancos, mortas aparecem em azul. Para determinar o número de células / ml multiplicar o número de células pelo factor de diluição. Se 2-4 quadrantes estão sendo contados, dividir pelo número de quadrantes.

5. CD4 + CD62 + T L Enriquecimento celular

  1. Enriqueça células do baço para células CD4 + CD62L + T via kit de isolamento magnético utilizando os princípios da selecção negativa ou positiva. Aqui, usar selecção negativa para isolar as células T CD4 + e usar selecção positiva para enriquecer ainda mais para o CD62L + população dentro do conjunto de células T CD4 +.
    NOTA: No processo de selecção negativa, as células, as quais não serão isolados (aqui: Todas as células negativas CD4) são rotulados com anticorpos específicos, juntamente com micro-esferas magnéticas. Durante a lavagem da coluna passos as células T CD4 +, vai passar através da coluna de modo que eles podem ser easily recolhidos. Nas células de procedimento de selecção positiva para ser isolados são marcados com o anticorpo apropriado acoplado com microesferas magnéticas. Durante a lavagem da coluna passos as células marcadas vão ficar na coluna e que pode ser recolhida através da remoção da coluna do campo magnético e lavagem com o tampão.
  2. Para o processo de selecção negativa, ressuspender 10 7 células de baço no total em 40 uL de PBS frio suplementado com albumina de soro bovino 0,5% (BSA). Adicionar 10 ul de anticorpo marcado com biotina cocktail fornecido com o kit de isolamento magnético (anticorpos específicos de ligação de células não-T CD4 +) e incubar 15 minutos em gelo.
    1. Adicionar 30 ul de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA e 20 ul de microesferas anti-biotina. Incubar 20 minutos em gelo.
    2. Adicionar à amostra 10 ml de PBS suplementado com 0,5% de BSA e centrifugar a 390 xg durante 5 min. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender as células em 1 ml de PBS frio suplementado com 0,5% de BSUMA.
    3. Colocar a coluna específico para o processo de selecção negativa no campo magnético e lavar com 3 ml de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA para a coluna. Adicionar a suspensão de células na coluna e lava-se 3 vezes com 3 ml de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA.
    4. Centrifugar as células do efluente a 390 xg durante 5 min. Efluentes passagem através da coluna contém células T CD4 + não marcados. Ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS suplementado com BSA a 0,5% e contar as células.
    5. Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Misturar 10 mL da suspensão de células com 10 uL de uma solução de Azul de Tripano a 0,4%. Incubar por 1-2 min.
      1. Encha a câmara de hemocitômetro com 10 ml de células coradas. Contar as células ao microscópio em quatro 1 x 1mm quadrados 2 de uma câmara e determinar o número médio de células por quadrado. As células viáveis ​​aparecem glóbulos brancos, mortas aparecem em azul. Para determinar o número de células / ml multiplicar cell número pelo fator de diluição. Se 2-4 quadrantes estão sendo contados, dividir pelo número de quadrantes.
  3. Para o procedimento de selecção positiva, adicionar 10 ul de microesferas de CD62L por 10 7 fracção enriquecida de células pré-T CD4 +. Incubar 15 minutos em gelo.
    1. Adicionar à amostra 10 ml de PBS suplementado com 0,5% de BSA e centrifugar a 390 xg durante 5 min. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender em 500 ul de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA.
    2. Colocar a coluna específico para o processo de selecção negativa no campo magnético e lavar com 500 ul de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA para a coluna. Adicionar a suspensão de células na coluna e lava-se 3 vezes com 500 ul de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA.
    3. Remova a coluna do campo magnético e colocá-lo em um tubo de recolha adequado. Adicionar 1 ml de PBS suplementado com 0,5% de BSA para a coluna e expulsar células CD4 + CD62L + Ts retidos na coluna, empurrando firmemente o êmbolo na coluna.
      NOTA: agora As células CD4 + CD62L + T isolados estão prontos para aplicações a jusante, tais como experimentos in vivo. De acordo com as instruções do fabricante do kit de isolamento de células T CD4 + CD62L + T, as microesferas não são tóxicos. Devido ao pequeno tamanho (cerca de 50 nm), que não activam as células e que não vai saturar os epítopos de superfície celular. Por conseguinte, as células isoladas podem ser transferidos para ratinhos imunodeficientes para induzir a colite 37,44,45.
    4. Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Misturar 10 mL da suspensão de células com 10 uL de uma solução de Azul de Tripano a 0,4%. Incubar por 1-2 min.
      1. Encha a câmara de hemocitômetro com 10 ml de células coradas. Contar as células ao microscópio em quatro 1 x 1mm quadrados 2 de uma câmara e determinar o número médio de células por quadrado. As células viáveis ​​appear glóbulos brancos, mortas aparecem em azul. Para determinar o número de células / ml multiplicar o número de células pelo factor de diluição. Se 2 - 4 quadrantes estão sendo contados, dividir pelo número de quadrantes.

6. indução da colite Antigen-driven

  1. Injectar por via intraperitoneal 3 x 10 5 células OT-II / Red CD4 + CD62L + T em CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratos. Para a indução da colite específica de antigénio, administrar E. coli pCFP-OVA a cada segundo dia, numa dose de 1 x 10 8 unidades formadoras de colónias (CFU) em 100 ul de PBS por animal por gavagem oral, instilação ou por trás dos incisivos.
  2. Monitorar duas vezes semanalmente o peso corporal de ratinhos transplantados e a sua condição clínica (presença de sangue nas fezes, a consistência das fezes e da actividade de ratos).

7. As amostras de tecido para exame histopatológico

  1. Tome amostras de tecido de the intestino grosso de murganhos, fixar em formalina neutra tamponada (10%) e embutida em parafina, como descrito anteriormente 36,46.
  2. Seção amostras de parafina em um micrótomo, montar em slides, e realizar a H & E mancha 47,48.
  3. Categorizar a histologia do intestino grosso, tal como publicado anteriormente 47,48: normal (escore 0); colite leve (escore 1), colite moderada (pontuação 2) e colite grave (escore 3).

8. Isolamento de células do cólon lâmina própria

  1. Eutanásia ratinhos transplantados por deslocamento cervical depois de anestesia por inalação de éter qualquer halogenado (de até 5% por indução) disponível comercialmente.
  2. Colocar o animal para baixo com a barriga virada para cima. Use uma pinça para agarrar a pele anteriormente à abertura da uretra. Use a tesoura para cortar a pele ao longo da linha média ventral desde a virilha até o peito. Puxar a pele volta sobre os lados.
  3. Corte através da parede muscular peritoneal transparente eabertura da cavidade do corpo. Identificar o cólon que vai desde o ânus do ceco 49. Corte as 2 extremidades e liberar o tecido de qualquer gordura.
  4. Abra o cólon longitudinalmente utilizando uma dissecção tesoura. Usar uma pinça para apertar o tecido do cólon numa placa de Petri contendo 25 ml de PBS suplementado com 1% de FBS para remover detritos e mucosa. Cortar os dois pontos em 5 - 8 pedaços mm.
  5. Colocar os segmentos de cólon em um tubo de 50 ml contendo 20 ml de tampão de lavagem. O tampão de lavagem contém 500 ml de DPBS, Hepes 10 mM e 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
  6. Vortex o tubo durante 30 segundos na velocidade máxima.
  7. Incubar o tubo com os segmentos de cólon em um banho de água a 37 ° C com agitação 200 rpm durante 10 min.
  8. Após a incubação, vortex o tubo durante 30 segundos à velocidade máxima.
  9. Descartar o sobrenadante e colocar as amostras de tecido em um novo tubo de 50 ml contendo 20 ml de tampão de lavagem. Repita os passos 6-9 três vezes
  10. Descartar as supernatants e colocar as amostras de tecido numa placa de Petri contendo 25 ml de PBS. Use uma pinça para agitar suavemente as amostras de tecido na placa de Petri por alguns segundos para remover as células epiteliais residuais. Repita este passo três vezes.
  11. Cortar tecidos do cólon em 2 x 2 mm 2 pedaços e digeri-los por incubação em 10 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) forma com 0,5 mg / mL de colagenase tipo VIII, a partir de Clostridium histolyticum e 10 U / ml de ADNasel.
  12. Vortex o tubo durante 30 segundos na velocidade máxima.
  13. Incubar os fragmentos de cólon em um banho de água a 37 ° C com agitação 200 rpm durante 35 min e agitar com vortex o tubo durante 30 segundos a velocidade máxima a cada 5 min.
  14. No final da incubação do tubo vortex durante 30 segundos a velocidade máxima.
  15. Recolher os fragmentos digeridos fazendo-as passar através de um filtro celular de 70 uM posicionado sobre um novo tubo de 50 ml.
  16. Lava-se a amostra por adição de 20 ml de DPBS e centrifugar a 400 g durante 5 min. Em seguida, ressuspender tele células em 1 mL de DPBS.
  17. Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Misturar 10 mL da suspensão de células com 10 uL de uma solução de Azul de Tripano a 0,4%. Incubar por 1-2 min.
    1. Encha a câmara de hemocitômetro com 10 ml de células coradas. Contar as células ao microscópio em quatro 1 x 1mm quadrados 2 de uma câmara e determinar o número médio de células por quadrado. As células viáveis ​​aparecem glóbulos brancos, mortas aparecem em azul. Para determinar o número de células / ml multiplicar o número de células pelo factor de diluição. Se 2-4 quadrantes estão sendo contados, dividir pelo número de quadrantes.

9. Coloração extracelular de Análise FCM

  1. Centrífuga o CLP células 5 min a 390 x g. Ressuspender as células em 1 ml de FACS A (PBS suplementado com 1% de BSA e 0,1% de azida de sódio)
    NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico. Ela pode causar hipotensão, hipotermia, convulsões ou dor de cabeça morte. As soluções diluídas de azida de sódio (00,1-1,0%) geralmente não apresentam perigos extraordinários para o usuário, mas eles são irritantes para os olhos e pele. Portanto, use azida de sódio somente no capô química, enquanto vestindo uma bata de laboratório e um par duplo de luvas de borracha nitrílica descartáveis.
  2. Incubam-se as células durante 15 min a TA com o anticorpo monoclonal (mAb) dirigido contra a 2.4G2 FcyRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ug de mAb / 10 6 células) diluído em FACS A.
  3. Adicionar 200 ul de FACS A para as células e centrifugar 5 min a 390 x g. Repita esta etapa duas vezes. Incubam-se as células com 0,5 ng / 10 6 células do mAb relevante durante 20 min a 4 ° C. Dilui-se a anticorpos em FACS A.
  4. Adicionar 200 ul de FACS A para as células e centrifugar 5 min a 390 x g. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender as amostras em 100 ul de FACS A.
  5. Analise as células T a partir CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratos reconstituídos com OT-II / células CD4 Red T no citômetro de fluxo 37.
  6. Analise os dados usando software disponível comercialmente.

Análise 10. Microscopia Confocal

  1. Analisar o cólon de CX 3 CR1 GFP ratos / + reconstituídos ou não com OT-II / célula vermelha CD4 + CD62L + T e alimentado por via oral a cada segundo dia com 1 x 10 8 UFC de E. coli estirpe DH10B pCFP-OVA.
  2. Remover o cólon dos camundongos, usando tesouras e pinças. Abri-la longitudinalmente utilizando uma dissecção tesoura.
  3. Corte um pedaço 5-8 mm de amostra de cólon usando uma tesoura, coloque em lâminas de vidro e cubra com lamelas.
  4. Analisar as amostras de cólon com um microscópio confocal com uma ampliação de 40 / 1,30.
  5. Detectar o CX 3 CR1 + MPs, marcado com fluoresceína proteína verde (GFP), utilizando um conjunto de filtros com excitação a 488 nm e emissão a 509 nm.
  6. Detectar a células T CD4 + que expressam a proteína vermelho utilizando um conjunto de filtros com excitação a 554 nm e emissão a 586 nm.
  7. Detectar E. coli pCFP-OVA utilizando um conjunto de filtros com excitação a 450 nm e emissão a 480 nm.
  8. Definir uma área de interesse e gerar diagramas de dispersão como anteriormente descrito 50 para realizar a análise de co-localização. Use 2 fórmulas diferentes: a sobreposição Coeficiente de acordo com Manders e Coeficiente de Pearson.

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Resultados

Para estabelecer um modelo de colite-driven antígeno um E. coli Foi construído um plasmídeo que contém na qual o gene para a PCP é fundido à sequência de codificação para a proteína de ovalbumina de galinha e a construção de fusão é expressa sob o controlo do promotor forte constitutivo hiper P (Figura 1A). Microscopia de fluorescência demonstra que a E. recombinante coli pCFP-OVA, mas não a de E. parenta...

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Discussão

Tal como acontece com todos os outros modelos, o modelo de colite-driven antigénio descrito acima pode apresentar alguns problemas que o investigador realização da técnica deve estar ciente. Ao injetar o OT-II / Vermelho + CD4 + T CD62L + células nos hospedeiros, o investigador deve ser muito gentil e cuidadosa para inserir a agulha para dentro da cavidade peritoneal. Não fazer isso pode resultar na ruptura do intestino do rato que pode levar à morte ou a administração subcutânea de célu...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

JHN é apoiado pela Fundação Nacional Suíça (SNSF 310030_146290).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Agitação RotativaReiss Laborbedarf e. K.Modelo 3020 GFL
2 mm gap couvettes Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicilinaSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
Kit de isolamento de plasmídeo de alta purezaRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Ácido acético glacialSigma-Aldrich537020 
Câmara de gel PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Corante de CarregamentoThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder Thermo FisherSM0312
Solução de brometo de etídioCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Sistema de documentação fotográficaDecon Science Tech GmbHDeVision G 
Sequenciamento de DNA MWG-Biotech GmbH
com tampão fosfato (PBS)BiochromL182-50
ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Escada de Proteína Prestada Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Reino Unido
Membrana de nitroceluloseMacherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Eletro-mata-borrão Biometra GmbH846-015-600
Albuminas de Soro Bovino (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anti-Ovalbumina anticorpo Abcamab181688
Anti-coelho IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Substrato de Blotting Western Pierce ECL PlusPierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Filtros de Células FalconFischer Scientific 08-771-2
Cloreto de amônioSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ Kit de isolamento T Miltenyi Biotec130-093-227 
Colunas MACS LS Colunas Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Miltenyi Biotec130-042-201
Separador MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Separador MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Agulha de alimentação 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Solução de formalina, neutra tamponado, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParafinaSigma-Aldrich1496904
HematoxilinaSigma-AldrichH9627
Eosina YSigma-Aldrich230251 
DitiotreitolSigma-AldrichD9779
Colagenase tipo VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mediumAppliChemA2044, 9050
Azida de sódioSigma-Aldrich438456
Mouse BD Fc BlockBD Pharmingen553141
Ligação mAb conjugada com FITC Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
mAb conjugada com APC CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur Software BD Biosciences
FCS Express V3DeNovo
Microscópio confocal de varredura Meta ZeissLSM 710
Estação de trabalho ZeissZeissLSM 7
Software Zeiss ZEM Zeissv4.2.0.121
Maxisorp NUNC, Roskilde442404
Estreptavidin fosfatase alcalina conjugadaJackson Immuno Research016-050-084
Substrato de fosfatase alcalina 4-Nitrofenil fosfato dissódico sal hexahidratadoSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN microplaca-ELISATecan
EasyWin softwareTecan
DNase I 4536282001
Microscópio fluorescente ligação de Placas imunológicas leitor recombinante

Referências

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