Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Summary

Neste modelo de colite dirigida por antígeno, as células T OT-II CD4⁺ que expressam uma proteína fluorescente vermelha foram transferidas adotivamente para camundongos RAG^-/- que expressam uma proteína fluorescente verde em fagócitos mononucleares (MPs). Os hospedeiros foram desafiados com Escherichia coli (E.coli) expressando a proteína ovalbumina (OVA) fundida a uma proteína fluorescente ciano (CFP).

Abstract

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma inflamação crônica que afeta o trato gastrointestinal (TGI). Uma das melhores maneiras de estudar os mecanismos imunológicos envolvidos durante a doença é o modelo de transferência de células T da colite. Neste modelo, camundongos imunodeficientes (receptores RAG^-/-) são reconstituídos com células T CD4⁺ virgens de hospedeiros saudáveis do tipo selvagem.

Este modelo permite o exame dos primeiros eventos imunológicos que levam à doença e inflamação crônica, quando a inflamação intestinal se perpetua, mas não depende de um antígeno definido. Para estudar o papel potencial das células apresentadoras de antígenos (APCs) no processo da doença, é útil ter um modelo de doença orientado por antígeno, no qual um antígeno derivado de comensal definido leva à colite. Um modelo de colite conduzida por antígeno foi, portanto, desenvolvido. Neste modelo, as células T OT-II CD4 ⁺, que podem reconhecer apenas epítopos específicos na proteína OVA, são transferidas para hospedeiros RAG^-/- desafiados com E. coli que expressa CFP-OVA. Este modelo permite o exame das interações entre APCs e células T na lâmina própria.

Introduction

O intestino é a maior superfície do corpo que é exposta ao ambiente externo. Vastas matrizes de micróbios residentes colonizar o intestino humano para formar a microbiota intestinal (ou microflora). Este é estimado para consistir de até 100 trilhões de células microbianas e constitui um dos habitats bacterianas mais densamente povoadas conhecidos na biologia ^1-3. No GIT bactérias colonizar um nicho intestinal onde eles sobreviver e se multiplicar ^4. Em troca, a microbiota dota o anfitrião com características funcionais adicionais não codificados em seu genoma ^1. Por exemplo a microbiota estimula a proliferação de células epiteliais, p....

Protocol

Os ratos foram criados e mantidos sob (SPF) condições específicas isentos de agentes patogénicos no biotério da Universidade de Ulm (Ulm, Alemanha). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do uso de animais local e comitê de cuidados e da Lei Nacional do Bem-Estar Animal.

1. Construção do plasmídeo de OVA pCFP

1. Amplificar o gene de tamanho completo de OVA utilizando os iniciadores Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') e Ova_ClaI_rev (3'-GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') ³⁷ utilizando o plasmídeo pCI-OVA (resistente à ampicilina) ^....

Results

Para estabelecer um modelo de colite-driven antígeno um E. coli Foi construído um plasmídeo que contém na qual o gene para a PCP é fundido à sequência de codificação para a proteína de ovalbumina de galinha e a construção de fusão é expressa sob o controlo do promotor forte constitutivo _hiper P (Figura 1A). Microscopia de fluorescência demonstra que a E. recombinante coli pCFP-OVA, mas não a de E. parenta.......

Discussion

Tal como acontece com todos os outros modelos, o modelo de colite-driven antigénio descrito acima pode apresentar alguns problemas que o investigador realização da técnica deve estar ciente. Ao injetar o OT-II / Vermelho ⁺ CD4 ⁺ T CD62L ⁺ células nos hospedeiros, o investigador deve ser muito gentil e cuidadosa para inserir a agulha para dentro da cavidade peritoneal. Não fazer isso pode resultar na ruptura do intestino do rato que pode levar à morte ou a administração subcutânea de célu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	244620
Agitação Rotativa	Reiss Laborbedarf e. K.	Modelo 3020 GFL
2 mm gap couvettes	Peqlab Biotechnologie GmbH	71-2020
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system	BioRad Laboratories GmbH	1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Difco	244510
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A9393-5G
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797-100ML
Kit de isolamento de plasmídeo de alta pureza	Roche	11754777001
Agarose	Carl Roth GmbH & Co	3810.1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Ácido acético glacial	Sigma-Aldrich	537020
Câmara de gel	PEQLAB Biotechnology GmbH	40-0708
Corante de Carregamento	Thermo Fisher	R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher	SM0312
Solução de brometo de etídio	Carl Roth GmbH & Co. KG	2218.3
Sistema de documentação fotográfica	Decon Science Tech GmbH	DeVision G
Sequenciamento de DNA	MWG-Biotech GmbH
com tampão fosfato (PBS)	Biochrom	L182-50
	Zeiss	HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System	Bio-Rad Laboratories GmbH	1658005
PageRuler Escada de Proteína Prestada	Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha
IstanBlue Solution	Expedeon, Cambridgeshire, Reino Unido
Membrana de nitrocelulose	Macherey-Nagel GmbH & Co. KG	741280
Eletro-mata-borrão	Biometra GmbH	846-015-600
Albuminas de Soro Bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003-25G
Anti-Ovalbumina anticorpo	Abcam	ab181688
Anti-coelho IgG  HRP	Sigma-Aldrich	A0545
Substrato de Blotting Western Pierce ECL Plus	Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc	32132
Forene	Abbott	2594.00.00
FBS	Invitrogen	10500-064
Filtros de Células Falcon	Fischer Scientific	08-771-2
Cloreto de amônio	Sigma-Aldrich	254134-5G
Tris Base	Sigma-Aldrich	10708976001
CD4+ CD62 L+ Kit de isolamento T	Miltenyi Biotec	130-093-227
Colunas MACS LS	Colunas Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MS	Miltenyi Biotec	130-042-201
Separador MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Separador MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Agulha de alimentação 20G	SouthPointe Surgical Supply, Inc	FN-7903
Solução de formalina, neutra tamponado, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Parafina	Sigma-Aldrich	1496904
Hematoxilina	Sigma-Aldrich	H9627
Eosina Y	Sigma-Aldrich	230251
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	D9779
Colagenase tipo VIII	Sigma-Aldrich	C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium	AppliChem	A2044, 9050
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	438456
Mouse BD Fc Block	BD Pharmingen	553141
Ligação mAb conjugada com FITC Vß 5.1, 5.2	BD Pharmingen	553189
mAb conjugada com APC CD4 GK1.5	eBioscience	17-0041-83
FACS Calibur	Software BD Biosciences
FCS Express V3	DeNovo
Microscópio confocal de varredura Meta	Zeiss	LSM 710
Estação de trabalho Zeiss	Zeiss	LSM 7
Software Zeiss ZEM	Zeiss	v4.2.0.121
Maxisorp	NUNC, Roskilde	442404
Estreptavidin fosfatase alcalina conjugada	Jackson Immuno Research	016-050-084
Substrato de fosfatase alcalina 4-Nitrofenil fosfato dissódico sal hexahidratado	Sigma-Aldrich	71768-5G
mAb R4-6A2	BD Biosciences	551216
mAb XMG1.2	BD Biosciences	554410
TECAN microplaca-ELISA	Tecan
EasyWin software	Tecan
DNase I 4536282001