Este trabalho apresenta um método simples e visual para detectar polimorfismos multi-nucleotídeos em uma plataforma de manipulação gota pneumático. Com o método proposto, toda a experiência, incluindo gota de manipulação e de detecção de polimorfismos de vários nucleótidos, pode ser realizada próximo de 23 ° C, sem o auxílio de instrumentos avançados.
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Artigo de método
A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um método simples e visual para detectar polimorfismo de multi-nucleótido (MNP) foi realizada sobre uma plataforma de manipulação gota pneumática sobre uma superfície aberta. Esta abordagem para a detecção de ADN foi colorimétrico baseado no crescimento mediada por hibridação de sondas de nanopartulas de ouro (sondas AUNP). O tamanho e a configuração do crescimento do AUNP são dominadas pelo número de amostras de DNA hibridaram com as sondas. Com base nas propriedades ópticas e SIZE- dependente da forma específica das nanopartículas, o número de desemparelhamentos de um fragmento de ADN da amostra com as sondas é capaz de ser discriminado. Os testes foram realizados através de gotículas contendo os reagentes e as amostras de ADN, respectivamente, e foram transportadas e misturado na plataforma pneumática com a sucção pneumática controlada da membrana hidrofóbicas à base de PDMS flexíveis. Gotículas podem ser entregues simultaneamente e, precisamente, numa superfície aberta na plataforma pneumática proposta que é altamente biocompatível sem FEP ladoect de amostras de ADN no interior das gotas. A combinação dos dois métodos propostos, o polimorfismo de multi-nucleótido pode ser detectada à vista sobre a plataforma de manipulação gota pneumático; nenhum instrumento adicional é necessária. O procedimento de instalação das gotas na plataforma para o resultado final leva menos de cinco minutos, muito menos do que os métodos existentes. Além disso, esta abordagem combinada de detecção MNP exige um volume de amostra de apenas 10 ul em cada operação, o que é notavelmente menos do que a de um sistema de macro.
Introdução
-polimorfismo de um único nucleótido (SNP), que é uma única diferença de par de bases numa sequência de ADN, é uma das variações genéticas mais comuns. Estudos atuais relatam que SNPs estão associados com o risco de doença, a eficácia da droga e os efeitos colaterais dos indivíduos por afetar a função do gene. 1,2 Estudos recentes também revelou que as mutações de dois ou multi-ponto (polimorfismo multi-nucleotídeo) causam doenças específicas e individuais diferenças nos efeitos da doença 3,4 A detecção de polimorfismo de nucleotídeo. é, portanto, imperativo prescreening doença. Métodos simples e eficientes para a detecção rápida de oligonucleot....
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Protocolo
1. Método para Detectar MNP
Nota: Esta secção descreve o procedimento para detectar a MNP com base no crescimento mediada por hibridação de nanopartículas de ouro.
- Prepara-se o ADN da sonda (5'-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') solução a uma concentração de 100 uM.
- Prepare o partículas AUNP sonda de DNA modificado (sonda AUNP). 21
Nota: O volume utilizado aqui depende da exigência de AUNP sonda de DNA modificado (sonda AUNP) partículas. É, por conseguinte, dependente do número de experiências para ser realizado. Nós normalmente preparar partículas da sonda AUNP excesso como peças de reposição. O volume utilizado nes....
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Resultados
Neste trabalho, três amostras de DNA foram testadas utilizando um método simples e inovador de detecção através do crescimento de DNA mediada por hibridação das sondas AUNP. As sequências de DNA sonda e amostras de DNA de três tipos, especificamente, o cDNA (totalmente complementar à sonda de DNA), TMDNA (três pares de bases de DNA incompatíveis) e SixMDNA (seis pares de bases de DNA incompatíveis) estão listados no Protocolo etapa 1. os desemparelhamentos para a sonda de ADN das amostra.......
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Discussão
Neste protocolo, um método colorimétrico simples para detectar MNP pode ser implementado em concentrações que variam de 0.11-0.50 uM em tubos de microcentrífuga. Além disso, o método de detecção MNP proposto é conduzida sobre uma plataforma de manipulação gota pneumático que tem um elevado potencial para o rastreio de ADN e outras aplicações biomédicas. Na prática, o intervalo da concentração detectável de ADN da amostra depende da eficiência de mistura dos plataformas operacionais. Para assegurar que a gota de coalesce.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan forneceu apoio financeiro a esta pesquisa sob os contratos MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| gravadores de bancada | Roland DG | EGX-400 | |
| máquina de corte a laser | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Sistema de tratamento de plasma de oxigênio | Femto Science Inc. Coréia | CUTE-MPR | |
| válvula | bomba de vácuo construída em casa | ||
| ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | ||
| 13-nm AuNP solução | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (com tiol marcado com 5'-end) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| solução salina tamponada com fosfato (PBS) | UniRegion Biotecnologia,. Taiwan | PBS001-1L | |
| dodecil sulfato de sódio (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Solução de hidroxilamina (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Ácido cloroáurico (HAuCl4) | Misturador | ||
| Digisystem Instrumentos de Laboratório Inc. | Centrífuga VM-2000 | ||
| Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
Referências
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al.
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Reimpressões e permissões
