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Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

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DOI:

10.3791/54426

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27 de setembro de 2016

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um morbidostato configurável de baixo custo que permite a caracterização da resistência a antibióticos ajustando dinamicamente a concentração do medicamento. O dispositivo pode ser integrado a uma plataforma microfluídica multiplexada. A abordagem pode ser ampliada para estudos laboratoriais de resistência a antibióticos.

Resumo

Descreve-se um baixo custo, morbidostat configurável para a caracterização da via evolutiva da resistência aos antibióticos. O morbidostat é um dispositivo de cultura bacteriana que monitora continuamente o crescimento bacteriano e ajusta dinamicamente a concentração da droga para desafiar constantemente as bactérias à medida que evoluem para adquirir resistência aos medicamentos. O dispositivo dispõe de um volume de trabalho de ~ 10 mL e é totalmente automatizado e equipado com medição de densidade óptica e micro-bombas para médio e entrega de droga. Para validar a plataforma, medimos a aquisição gradual de resistência trimetoprim em Escherichia coli MG 1655, e integrada com o dispositivo de microfluidos de uma plataforma multiplexado para investigar a morfologia das células e sensibilidade aos antibióticos. A abordagem pode ser up-dimensionado para estudos laboratoriais de resistência aos medicamentos antibióticos, e é extensível para adaptativa evolução de melhorias de tensão em engenharia metabólica e outros experimentos de cultura bacteriana.

Introdução

Desde a introdução da primeira penicilina antibiótico, a resistência aos antibióticos microbiana tornou-se um problema de saúde global 1. Embora a aquisição de resistência a antibióticos pode ser retrospectivamente estudados in vivo, as condições destas experiências muitas vezes não são controlados ao longo de toda a evolução 2. Alternativamente, evolução adaptativa laboratório pode revelar a evolução molecular de uma determinada espécie microbiana sob stresses ambientais ou pressão de seleção de um medicamento antibiótico 3. Recentemente, muitas experiências evolutivas bem controlados de resistência aos medicamentos antibióticos elucidaram o surgimento de resistência aos medicamentos antibióticos. Por exemplo, o grupo de Austin demonstrado surgimento rápido num ambiente compartimentado microfluidos adequadamente manipulado 4. O morbidostat recentemente desenvolvido induz a mutações sistemáticas sob droga pressão de seleção 5,6. O morbidostat, uma selec microbianação dispositivo que ajusta continuamente a concentração de antibiótico para manter uma população praticamente constante, é um grande avanço a partir do teste de flutuação utilizado em microbiologia 7,8. No teste de flutuação, uma droga antibiótica é injectada a alta concentração, e os sobreviventes mutantes são rastreadas e contadas. Em vez disso, os micróbios em um morbidostat são constantemente desafiados e adquirir múltiplas mutações.

O morbidostat opera de forma semelhante ao quimiostato, cultura de um dispositivo inventado por Novick e Szliard em 1950 que mantém uma população constante através do fornecimento de nutrientes continuamente enquanto que a diluição da população microbiana 9. Desde a sua introdução, o quemostato tem sido avançado e melhorado. quimiostatos microfluídicos em curso alcançaram capacidades nanolitros e de uma única célula. No entanto, estes dispositivos não são adequados para experiências evolução adaptativa, que necessitam de uma população de células grandes com muitos eventos de mutação 10,11. Recentemente, mini-quimiostatos com volumes de trabalho de ~ 10 ml também foram desenvolvidos para preencher a lacuna entre biorreatores em escala litro eo microfluídico quemostato 12,13.

Aqui apresentamos a concepção e utilização de um baixo custo, morbidostat automatizado para um estudo de resistência aos medicamentos antibióticos. O módulo proposto pode ser empregue num incubador agitador de laboratório com microbiologia requisito mínimo de hardware. O firmware open-source também é facilmente adaptado para aplicações específicas de evolução adaptativa, tais como engenharia metabólica 3. Finalmente, o morbidostat é integrado em uma plataforma microfluídica multiplexado para testes de sensibilidade aos antibióticos 14.

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Protocolo

1. Montagem e pré-teste do dispositivo Morbidostat

  1. Assembleia da Morbidostat
    1. Soco 3 furos na tampa do frasco de cultura com uma agulha de seringa 18 G. Corte três peças de tubagem de polietileno ~ 7 cm de comprimento. Inserir essas três pedaços de tubos de polietileno na tampa.
    2. Use fita para envolver a borda da tampa para servir como o elenco para a mistura de polidimetilsiloxano (PDMS). Dissolvem-se 5 g de componente A e 0,5 g de componente B de o PDMS em um recipiente de plástico de 150 ml por agitação manualmente com um palito. Carregar a mistura em uma seringa de 10 ml.
      1. Despeje a mistura de PDMS na tampa com a seringa. Asse toda a tampa para curar o PDMS durante 8 horas na estufa a 70 ° C.
    3. Soldar o ânodo LED com o fio de calibre 24 e catodo LED com o resistor de carbono com um ferro de solda. Solde um resistor de 680 Ω de carbono com um fio de 24 g. Isolar a ligação do fio usando fita isolante.
    4. assimlder no colector do fotodetector com o G fio 24 e o emissor da célula fotoeléctrica com uma resistência de 100 kQ carbono. Isolar a ligação do fio usando fita isolante.
    5. Coloque o diodo emissor de luz no suporte de cultura do frasco. Seguindo o esquema de circuitos na Suplementar Figura 2, conecte o diodo emissor de luz e ligá-lo com uma fonte de alimentação de 5 V. Verifique se o LED funciona usando uma câmera digital que pode detectar IR (por exemplo, uma câmera de telefone celular).
    6. Colocar o fotodetector no suporte do frasco de cultura. Seguindo o esquema de circuitos na Suplementar Figura 2, conecte o fotodetector e ligá-lo com uma fonte de alimentação de 5 V. Ligue o fio de ambos os lados das resistências de fotodetectores para medir a tensão através da placa de controle eletrônico.
    7. Cole um íman sobre o veio da ventoinha de arrefecimento, o qual serve como unidade de agitador magnético. Note-se que o alignmENT do eixo do ventilador para o frasco de cultura, e o espaçamento entre o frasco de cultura e o íman é muito crítica para a função adequada da unidade de agitação magnética.
    8. Ligue cada pedaço de tubo de polietileno do frasco de cultura para a parte correspondente de tubo de silicone para os micro-bombas, garrafas médias e frasco de resíduos. Ligar a bomba durante 1 hora e medir o volume total a ser bombeado a partir da garrafa de forma para o frasco de cultura para determinar a taxa de bombagem. Note-se que a taxa de bombeamento típico deve ser ~ 4 ml / h, o que corresponde à taxa de diluição de D = 0,33 h -1 para a 12 ml de volume do frasco de cultura de trabalho.
    9. Coloque todo o conjunto em uma incubadora shaker médio porte (34 cm x 34 cm x 43,5 cm).
  2. O pré-teste do Morbidostat
    1. Set tensão de alimentação do ventilador de fresco a 5 V para iniciar o seu motor para testar a barra de agitação magnética. Note-se que a ação de agitação pode ser inspeccionados visualmente. A tensão que conduzirs o motor do ventilador de arrefecimento é precisamente controlado por modulação de largura de pulso (PWM).
    2. Preparar uma série de tipo selvagem E. Amostras de E. coli com as densidades ópticas a 600 nm, tipicamente variando 0,07-0,3 para a calibração. Coloque um teste E. amostra coli no frasco de cultura e registar a tensão fotodetector.
      1. Ponto ~ 100 uL da mesma amostra no leitor de placas e gravar a densidade óptica. Use a tensão fotodetector em função dos dados de densidade óptica para traçar a curva de calibração. Note-se que tipicamente, uma unidade de variação na densidade óptica corresponde a 7,6 V ~ mudança no fotodetector com o esquema de polarização utilizado aqui.

2. A execução do Morbidostat

  1. Preparação Antes de começar a experiência diária
    1. Prepara-se o frasco de cultura com três ultra-resistentes a substâncias químicas tubos Tygon com diâmetro interior de 1/32 polegadas e diâmetro externo de 3/32 de polegada para entradas para formar o dispositivo como na secção1.1 e na Figura Suplementar 1.
    2. Preparar o meio M9 mínimo (0,2% de glicose) e trimetoprim (TMP) de drogas contendo meio. Esteriliza-se o meio, o meio de garrafa, a garrafa forma de droga, o frasco de resíduos, e o frasco de cultura num autoclave a 121 ° C.
      NOTA: O TMP é uma solução de reserva que é utilizado para alcançar as concentrações mais tarde no Quadro 1 e a droga TMP contendo meio não é autoclavado.
  2. Executando o Morbidostat
    1. No primeiro dia do experimento, descongelar 1 ml de tipo selvagem congelado E. coli MG1655 durante 5 min à temperatura ambiente e a transferência de 120 ul das células para o frasco de cultura contendo ~ 12 mL de meio de crescimento M9. Após o primeiro dia, descongelar 1 ml de E. congelado coli células a partir do dia anterior durante 5 min e transferência de 120 uL de células para um novo frasco de cultura contendo ~ 12 mL de meio de crescimento M9.
    2. Ligue a incubadora shaker e definir a tempe ratura de 30 ° C sem agitação.
    3. Inicie a operação morbidostat girando sobre o micro-bomba, a unidade de agitação magnética, e a medição da densidade óptica.
      Nota: Durante a operação, um algoritmo de limiar de realimentação é utilizado para controlar a injecção de drogas. Quando a densidade óptica medida exceder um limite pré-definido, a bomba de injecção de drogas seria ligado e a bomba médio seria desligado. Caso contrário, a bomba de injecção de drogas permanece desligado ea bomba médio está ligado.
    4. Monitorar a tensão ao longo do tempo para assegurar que não é o crescimento microbiano.
      Nota: Devido à congelação e descongelação ciclo, E. coli células apresentam um atraso de ~ 4 horas durante o crescimento de cada dia.
    5. Depois de ~ 23 h, parar a micro-bomba desligando a tensão de alimentação e retire o frasco de cultura. Adiciona-se 15% de glicerol no frasco de cultura e congelar a amostra a -80 ° C durante o armazenamento.
    6. Repita os passos 2.2.1 a 2.2.5.
le "> 3. Antibiótico Susceptibilidade Medição em 96 Bem Format

NOTA: Executar a medição da taxa de crescimento em um leitor de placas com um formato de 96 poços para determinar o nível de resistência a antibióticos.

  1. Descongelar a amostra congelada diária à temperatura ambiente durante 5 min e transferir 15 ul da célula para o frasco de cultura contendo ~ 15 mL de meio M9. Permitir-lhes crescer até a densidade óptica a 600 nm atingir ~ 0,1. Dividir as 15 ml em frascos de 1 ml e adicionar o fármaco TMP nesta etapa para se obter as concentrações de droga desejadas, como mostrado na Tabela 1.
  2. Tome 200 ul da amostra a partir do passo 3.1 e local para cada poço na placa de leitor e permitir-lhes crescer durante 12 horas 5. A densidade óptica no comprimento de onda de 600 nm é registado automaticamente durante a medição.
    NOTA: Para cada ponto de dados, as medições triplicadas são registrados e em média para garantir a consistência dos dados. Os dados sobre a densidade óptica em função do tempo pode be utilizado para obter a taxa de crescimento.
  3. Plotar os dados da taxa de crescimento em comparação com a concentração da droga para obter IC50. Note-se que IC50 é definido como a concentração de fármaco à qual a taxa de crescimento é de cinquenta por cento da taxa de crescimento máxima 5.

4. única célula Morfologia e Antibiótico Susceptibilidade Medição em microcanais

  1. Realizar a fabricação dos dispositivos microfluídicos via litografia macia multicamadas de PDMS conforme já descrito 15.
    1. Use fotolitografia para fazer o molde fotorresistente para os níveis de controlo e de fluxo. Note-se que para a camada de controlo, utilizar fotorresistente negativa (~ 15? M de altura) e fotorresistente positivo (~ 8 uM altura) para produzir um molde sobre uma bolacha de silício nu.
    2. Preparar misturas de PDMS com rácios de reticulação de 5: 1 e 20: 1 para a camada de controlo e camada de fluxo, respectivamente. Coloque as misturas em um exsicador sob vácuo para remover quaisquer bolhas, Durante 1 h.
    3. Exponha o controlo moldes camada fotossensível em bolacha de silício para trimetilclorosilano vapor (TMCS). Adicione a camada de espessura ~ 6 milímetros de controlo, lançando-se a mistura de PDMS (com razão de reticulação 5: 1) sobre a bolacha de silício sobre o molde de controle camada foto-resistente. Cozer a camada de controlo durante 40 minutos a 80 ° C durante 1 hora no forno.
    4. Adicione a camada de fluxo de rotação por revestimento de uma mistura de PDMS (com reticulação proporção de 20: 1, velocidade de rotação 3000 rpm durante 60 seg) em um molde fotorresistente camada de escoamento. Cozer a camada de fluxo durante 30 min a 80 ° C durante 1 hora no forno.
    5. Use uma lâmina de barbear para cortar a camada de controle para o tamanho do chip desejado (tipicamente 3 cm x 2 cm) e manualmente retire a camada de controle. Coloque a camada de controlo no topo da camada de escoamento e alinhá-los sob um estereomicroscópio. Curar a montagem alinhada a 80 ° C na noite forno. Em seguida, mergulhe o conjunto em 250 ml de água deionizada em um recipiente de plástico durante 5 horas para dissolver o TMCS residual.
    6. Subsequentemente, perfurar os orifícios de entrada com 20 g de agulhas e ligar todo o elastómero a uma lâmina de vidro revestida com uma camada de PDMS em branco (PDMS reticulação proporção de 5: 1, velocidade de rotação 2000 rpm durante 30 seg) por tratamento com plasma de ar de 40 seg a 1,2 Torr de pressão de ar.
    7. Realizar ampla cozimento durante 36 h a 80 ° C para reduzir os efeitos citotóxicos de PDMS. Note-se que esta fase de cozedura é crítica para minimizar a toxicidade para as células bacterianas.
  2. No Experimento Crescimento Chip
    1. Antes de carregar no dispositivo de microfluidos, lavá-la com água desionizada durante 1 hora e meio M9 durante 1 h.
    2. Descongelar a amostra congelada diária à temperatura ambiente durante 5 min e inocular um novo tubo de ensaio com meio fresco M9. Colocar a amostra num incubador com agitação a 37 ° C durante a noite.
    3. Diluir o microbiana amostra de 10 vezes com meio M9 e carregá-lo para dentro do dispositivo microfluídico pressionando o recipiente da amostra microbiana a 5 psi. Em seguida, carregar a droga TMPmédio no chip pressionando o recipiente do meio de droga em 5 psi. Executar a mistura entre o micróbio e fármaco por actuação da válvula de micromecânica entre as duas câmaras no chip de microfluidos durante 15 min.
    4. Colocar o chip de microfluidos na incubadora microscópio montado no microscópio invertido. Adquirem a imagem de células na câmara de crescimento a cada HR durante 8 horas com a câmara CCD montada sobre o microscópio invertido.
    5. Use o script programa personalizado para calcular o número de células por meio de um algoritmo de limite sobre os dados de imagem de células 18. Note-se que os dados do número de células são calculados normalmente mais de três câmaras microfluídicos.

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Resultados

O morbidostat acima descrito está esquematizado na Figura 1. As operações morbidostat comuns, incluindo a evolução experimental, teste de susceptibilidade aos antibióticos e a morfologia das células de controlo, foram validados em uma E. coli MG1655 cultura exposta ao trimetoprim (TMP), um fármaco antibiótico comumente utilizado 5,6. TMP induz aumentos graduais muito distintas em resistência aos medicamentos, e as mutações são agrupados em torno do ge...

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Discussão

Um dispositivo morbidostat baixa pegada de componentes de baixo custo é demonstrada. Os aumentos no nível de resistência a drogas registadas pelo dispositivo são consistentes com os dos relatórios anteriores 5. Concebido para estudos evolutivos de resistência a drogas, o dispositivo é potencialmente aplicável a muitas outras experiências. Primeiro, um banco de dados abrangente de mutações induzidas pela droga pode ser estabelecido para um grande conjunto de antibióticos clinicamente relevantes. Por exemplo, a...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Sze-Bi Hsu e à Sra. Zhenzhen pelas discussões úteis e ajuda na análise teórica e simulação numérica. Y. T. Y. gostaria de agradecer o apoio financeiro do Ministério da Ciência e Tecnologia sob os números de concessão MOST 103-2220-E-007-026 e MOST 104-2220-E-007-011, e da Universidade Nacional Tsing Hua sob os números de concessão 103N2042E1, 104N2042E1 e 105N518CE1.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Incubadora de agitador ambientalBioSanES-20
Arduino Leonardo placaArduinoLeonardo
680 Ohm Resistor de carbonoDigikeyBias resistor para LED
100k Ohm Resistor de carbonoDigikeyBias resistor para fototransistor
940 nm diodo emissor de luzLED brilhante eletrônicoBIR-BM13E4G-2Medição de densidade óptica
940 nm fototransistorKodenshi ST-2L2BMedição de densidade óptica
Darlington par IC ToshibaMouserULN2803APGeste IC aciona microbombas e unidade de agitação magnética
Ventilador sem escova de 5 V DCADDAAD0405LX-G70spec: tensão de alimentação de 5 V e 80  mamã; disponível www.jameco.com
Microbomba piezoelétricaCurieJetPS15I-FT-5L> de pressão 3  kPa; Taxa de fluxo >5 ml/min
Tygon 3350 TuningSaint GobainABW00001ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
Barra de Agitação MagnéticaCOWIEforma cônica dim: 10  mm x 4 mm
Frasco de cintilação de vidro de 20 mlDGSVidro Pyrex 28 mm (diâmetro) x 61 mm (altura)
Suportepara frasco de cultura Feito sob medida de Poliformaldeído 
SiliconeDow CorningSylgald 184usado para selar o frasco de vidro
Frasco médioVWR66022-065
Difco M9 sal mínimo 5xBD
CadaminoácidoBDGlicose média
Sigma
Oxóidebateriológicopara placa
de ágarLuria Bertani microscópio médio
invertidoLeica MicrosystemsLeica DMI-LEDusado para medição microfluídica Use objetiva 40X NA = 0,55
Incubadora de MicroscópioInstrumento de Célula Viva-109usado para medição microfluídica
Válvulas solenoidaisPneumadyneS10MM-31-12-3Normalmente aberto 1,3 Watt 12 Vdc
Placa de interface USBMódulo de I/O Digital USBIO24-RHobby Engineeringpara medição microfluídica
Compressor de arRocker ScientificROCKER 440Fonte de pressão para microfluidos; Pressão Máxima 80 psi
Conexões luer-lock macho para ValuePlastics.com de 1/8"MTLL230-1usadas para controle microfluídico
/8" de barb para porta roscada 10-32ValuePlastics.comB-1usadas para controle microfluídico
Conexões luer-lock fêmeas para portaroscada 10-32ValuePlastics.comKFTL-1usado para controle microfluídico
NPN darlington transistor 500 mA, 40  V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-NDusado para controle microfluídico
10 kOhm, resistor de filme de carbono, 0,25 WDigiKey.comP10KBACT-NDusado para controle microfluídico
Capacitor de tântalo, 10  μ F, 25 V, 10%DigiKey.com478-1841-NDusado para controle microfluídico
Andor câmera CCDAndorZyla 4.2 Plus SCMOSusado para imagem microfluídica em chip
Leitor
de dois componentes Silicone MomentiveRTV 615usado para fabricação de chips microfluídicos
SU-8 fotorresistenteMicrchemSU8 2015usado para fabricação de chips microfluídicos
AZ4620 fotorresistenteClariantAZ 4620usado para fabricação de chips microfluídicos
Limpador de plasmaHarrick PlasmaPDC 32Gusado para fabricação de chips microfluídicos
Agulha de seringa de calibre20 BDusado para fabricação de chips microfluídicos
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
DNA polimeraseToyoboKDO PlusAmplificação de PCR
TrimetoprimSigma
Plate readerBiotekSynergy H1 hybrid Medição de resistência a antibióticos
Médio Agar da 1de placa ELISA

Referências

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