Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.
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Artigo de método
A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Compreender as interações heterotípicos precoces entre células cancerosas e torno estroma não-cancerosas é importante para elucidar os acontecimentos que levaram à activação do estroma e estabelecimento do microambiente do tumor (TME). Vários in vitro e em modelos in vivo de o TME foram desenvolvidos; No entanto, em geral, estes modelos não prontamente permitir o isolamento de populações de células individuais, sob condições não perturbando, para um estudo mais aprofundado. Para contornar esta dificuldade, temos utilizado um modelo TME in vitro utilizando um substrato de crescimento de células que consiste de uma inserção da membrana microporosa permeável que permite a geração simples de populações de células altamente enriquecido crescido intimamente, mas separadamente, em cada lado da membrana da pastilha para co prolongado vezes -Cultura. Através da utilização deste modelo, são capazes de gerar fibroblastos associados ao câncer grandemente enriquecido (CAF) populações de fibroblastos humanos diplóides normais seguinteco-cultura (120 h) com células de carcinoma da mama humano altamente metastáticas, sem o uso de marcação fluorescente e / ou separação de células. Além disso, através da modulação do tamanho de poro da pastilha, que podem controlar o modo de comunicação intercelular (por exemplo, comunicação GAP-junção, factores segregados) entre as duas populações de células heterotípicas, que permite a investigação dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do TME, incluindo o papel da permeabilidade gap-junction. Este modelo serve como uma ferramenta valiosa para melhorar a nossa compreensão dos eventos iniciais que conduzem à iniciação do cancro de estroma, o começo da evolução da TME, e o efeito modulador do estroma das respostas de células de cancro a agentes terapêuticos.
Introdução
O microambiente do tumor (TME) é um sistema altamente complexa composta de células de carcinoma que co-existem e evoluem paralelamente estroma hospedeiro. Este componente do estroma consiste tipicamente em fibroblastos, células endoteliais, miofibroblastos, vários componentes do sistema imunológico, bem como uma matriz extracelular 1. Um componente significativo, muitas vezes a maioria do presente estroma, são fibroblastos activados, frequentemente referido como fibroblastos associados ao cancro ou fibroblastos associada a carcinoma (CAF) 2,3. Ao contrário de fibroblastos normais, não activado, FAC contribuir para a iniciação do tumor, progressã....
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Protocolo
1. Preparação de Meios de Cultura e Células
- Preparar 500 ml de meio de Eagle mínimo essencial, suplementado com 12,5% (vol / vol) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 2 mM de L-alanil-L-glutamina, e 100 unidades de penicilina e 100 ug de estreptomicina por ml.
NOTA: O meio de crescimento e suplemento (s) podem ser facilmente trocados para as necessidades de crescimento de outras estirpes de células ou linhas celulares. - Preparar 70 ul de meio de cultura de células para cada inserto (formato de 6 poços de inserção): meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 50% (vol / vol) de 2 mM de L-alanil-L-glutamina FBS, desactivad....
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Resultados
Aqui nós adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável ao desenvolvimento de um sistema de co-cultura de células heterotípica in vitro que simula o microambiente do tumor in vivo (Figura 1). Este sistema permite a duas diferentes populações de células a serem cultivadas em ambos os lados da membrana porosa da inserção por longos períodos de tempo (até 120 horas, em nosso uso). É importante salientar o sistema é capaz de manter a pureza das po.......
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Discussão
O protocolo aqui descrito é um método simples, adaptável no procedimento in vitro (Figura 1) que utiliza uma inserção de membrana microporosa permeável para gerar populações de células individuais altamente enriquecidas a partir de uma co-cultura de células heterotípicas. Significativamente, o modelo é apropriado para a investigação de vários modos de comunicação intercelular. Os passos críticos incluem seleccionando a inserção de tamanho de poro apropriado para o interesse experimenta.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes ou conflitantes.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por doações da Comissão de Pesquisa do Câncer de Nova Jersey (Bolsa de Pré-Doutorado DFHS13PPCO17), dos Institutos Nacionais de Saúde (CA049062) e da Administração Nacional de Aeronáutica e Espaço (NNX15AD62G).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Para cultura de células | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) fibroblasto diplóide humano | Coriell | 107661 | Passagem 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 linha celular de adenocarcinoma de mama | PerkinElmer | 119261 | Linha parental: linha celular de adenocarcinoma de mama ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Meio essencial mínimo da águia (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Soro Fetal Bovino (FBS), Suplemento Qualificado | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro (200 mM L-alanil-L-glutamina) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Solução de Penicilina Estreptomicina, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Inserção Transwell (ou seja, inserção de membrana microporosa permeável) (0,4 μ m pore) | Inserção Transwell | Costar 3450 | |
| (i.e., inserção de membrana microporosa permeável) (1 μ m pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., inserto de membrana microporosa permeável) (3 μ m pore) | Costar | 3452 | |
| Placa de cultura de 6 poços | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| frasco de cultura de células de 75 cm2 | CellStar | 658 170 | |
| solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | sem cálcio e magnésio |
| 0,25% (vol/vol) Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Tubo de Centrífuga | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Placa de Cultura de Células | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Para Microscopia Imunofluorescente | |||
| Mouse anti-Caveolina 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Imunofluorescência - 1:5.000 |
| Anticorpo secundário anti-IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Imunofluorescência - 1:2.000 |
| Albumina de soro bovino - Fração V | Rockland | BSA-50 | Imunoglobulina e protease livre |
| 16% (wt/vol) Solução de Formaldeído | ThermoFisher Scientific | 28908 | Diluir a 4% com 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagente com DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Para análise de citometria de fluxo | |||
| Calceína, | sondas moleculares | C3100MP | |
| solução salina balanceada de Hanks (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Para análise de Western Blot | |||
| Mouse anti-caveolina 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1.000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Membrana de nitrocelulose (0,2 μ m) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Desoxicolato de sódio monohidratado (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| Solução de acrilamida/bis a 30%, 37,5:1 | BioRad | 161-0158 |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009)....
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Reimpressões e permissões
