Induzir um bloqueio de replicação de site específico no E. coli Usando um sistema fluorescente repressor de operador

Summary

Descrevemos aqui um sistema que utiliza um bloco de proteína in vivo reversível e específico do local para parar e colapsar garfos de replicação em Escherichia coli. O estabelecimento do bloco de replicação é avaliado por microscopia de fluorescência e eletroforese em gel de agarose bidimensional neutro-neutro é usada para visualizar intermediários de replicação.

Abstract

Obstáculos presentes no DNA, incluindo proteínas firmemente ligados e várias lesões, pode inibir seriamente a progressão da maquinaria de replicação da célula. O retardamento de um replissoma pode levar a sua dissociação do cromossoma, em parte ou a sua totalidade, levando ao colapso do garfo de replicação. A recuperação a partir deste colapso é uma necessidade para que a célula completa com precisão a duplicação cromossómica e subsequentemente se dividem. diversos mecanismos Portanto, quando ocorre o colapso, a célula tem evoluído que tomam lugar para restabelecer a forquilha de ADN e permitir a replicação para ser preenchido com alta fidelidade. Anteriormente, estas vias de reparação de replicação em bactérias, foram estudados utilizando os danos UV, o que tem a desvantagem de não ser localizada a um local conhecido. Este manuscrito descreve um sistema que utiliza um sistema de fluorescência repressor Operator (FROS) para criar um bloco de proteína específica do local que podem induzir a estagnação e colapso da replicação forks em Escherichia coli. Protocolos detalhe como o estado de replicação podem ser visualizados em células vivas individuais usando microscopia de fluorescência e de replicação de ADN intermediários podem ser analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 2-dimensional. Temperatura mutantes sensíveis de componentes réplisome (por exemplo DnaBts) pode ser incorporada no sistema para induzir um colapso síncrona dos garfos de replicação. Além disso, as funções das proteínas de recombinação e helicases que estão envolvidas nestes processos podem ser estudados utilizando knockouts genéticas dentro deste sistema.

Introduction

Durante a replicação do DNA, o replisome enfrenta obstáculos no DNA que prejudicar a sua progressão. Danos no ADN incluindo lesões e as lacunas assim como estruturas aberrantes pode impedir a replissoma de prosseguir ^1. Recentemente, verificou-se que as proteínas ligadas ao ADN são a fonte mais comum de impedimento à replicação progressão forquilha ^2. O conhecimento dos eventos após o encontro do replissoma com um bloco de nucleoproteína foi previamente limitada pela incapacidade de induzir uma tal bloco no cromossoma de uma célula viva no local conhecido. Análise in vitro aumentou a nossa compreensão do comportamento cinético de um rep....

Protocol

1. Bloqueio de replicação com FROS

1. Induzindo a replicação de bloqueio
   1. Dilui-se uma cultura durante a noite fresca de uma E. coli estirpe transportando uma matriz tetO e pKM1 ¹⁸ a OD _600nm = 0,01 em um meio complexo diluído (0,1% de triptona, 0,05% de extracto de levedura, 0,1% de NaCl, 0,17 M _de KH ₂ PO _4, 0,72 MK ₂ HPO _4), com antibióticos conforme requerido para selecção.
      Nota: Não adicione tetraciclina para a seleção, uma vez que não é compatível com este sistema. Completar o volume de cultura equivalente a 10 ml por amostra necessário. Por exemp....

Results

O FROS é um bloco de nucleoproteína induzível, específica do local que permite intermediários de replicação para ser visualizado em células vivas ^12,18. Um projeto experimental geral para células de amostragem é ilustrada na Figura 1. O momento da amostragem e variações no fundo genético tornar este um sistema versátil para estudar o reparo de um tal bloco. O esquema ilustra como mutantes sensíveis à temperatura, tais como TS e TS dnaB dnaC q.......

Discussion

Durante a duplicação cromossômica, o maquinário de replicação encontrará vários impedimentos que impedem seu progresso. Para garantir que todo o cromossomo de origem única seja replicado, as bactérias têm vários caminhos para o reparo do DNA que permite que o replissoma seja recarregado^20,21. Lesões, quebras de fita simples, quebras de fita dupla e proteínas fortemente ligadas ao DNA podem ser tratadas usando uma via dedicada, embora seja provável que haja sobreposição significativa nessas vias. O impedimento .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triptona	Sigma-Aldrich	16922	Componente do meio de crescimento
Cloreto de sódio	VWR	27810.364	Componente do meio de crescimento
Extrato de levedura	Sigma-Aldrich	92144	Componente do meio de crescimento
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P9791	Componente do meio de crescimento; Componente tampão de potássio
Fosfato de potássio dibásico	Sigma-Aldrich	P3786	Componente de meio de crescimento; Componente tampão de potássio
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	Para indução da produção de TetR-YFP
Cloridrato de anidrotetraciclina	Sigma-Aldrich	37919	Liberação de bloackage de replicação
Axioskop 2 Microscópio de fluorescência	Zeiss	452310	Visualização de células
conjunto de filtros eYFP	Chroma Technology	41028	Visualização da câmera CCD YFP
	Hamamatsu	Orca-AG	Visualização de células
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Versão 7.8.0.0 usado na preparação deste manuscrito
Agarose	Bioline	BIO-41025	Para plugues de agarose e eletroforese
em gel Repelente de água de vidro original (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	Para fabricação de plugues de agarose
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, componente
tampão TBEÁcido etileno diaminetetracético	Ajax Finechem	AJA180	0,5 M EDTA solução de sal dissódico ajustada para pH 8,0 com NaOH.
Azida sódica	Sigma-Aldrich	S2002	Agente bacteriostático
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	258148	componente tampão TE
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	D6750	Componente tampão de lise celular
N-Lauroilsarcosina sal de sódio (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Lise celular e componente tampão ESP
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Componente tampão de lise celular
Lisozima	Amresco	6300	Componente tampão de lise celular
Proteinase K	Amresco	AM0706	Componente tampão ESP
Modelo de subcélula 192 Célula	BioRad	1704507	Sistema de eletroforese
Transiluminador UV 2000	BioRad	1708110	Visualização do DNA
Brometo de Etídio	BioRad	1610433	Visualização do DNA
Ácido bórico	VWR	PROL20185.360	TBE componente
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) também pode ser usado
Papel de cromatografia 3MM Whatman	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Reticulação de DNA e hibridização
Ácido desoxirribonucléico de esperma de salmão	Sigma-Aldrich	31149	Componente tampão de hibridização
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S5881	Componente tampão de desnaturação
Citrato trissódico di-hidratado	VWR	PROL27833.363	Tampão de transferência
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Amresco	227	Componente tampão de lavagem
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A7906	Componente tampão de hibridização
Primers hexâmeros aleatórios	Bioline	BIO-38028
Fragmento de Klenow	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosina 5'-trifosfato-< sup>32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Tela de Armazenamento	de Fósforo GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multiuso padrão 35 cm x 43 cm tela
Tufão FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualização do borrão
Frasco de hibridização	UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm