Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.

Abstract

A evolução natural envolve diversidade genética, como mudanças ambientais e uma seleção entre pequenas populações. A evolução laboratorial adaptativa (ALE) refere-se à situação experimental em que a evolução é observada usando organismos vivos sob condições e estressores controlados; Os organismos são, portanto, artificialmente forçados a fazer mudanças evolutivas. Os microrganismos estão sujeitos a uma variedade de estressores no ambiente e são capazes de regular certas proteínas induzíveis por estresse para aumentar suas chances de sobrevivência. Mutações espontâneas que ocorrem naturalmente provocam mudanças no genoma de um microrganismo que afetam suas chances de sobrevivência. A exposição prolongada à cultura de quimiotato provoca um acúmulo de mutações espontâneas e torna dominante a cepa mais adaptável. Em comparação com os métodos de transferência de colônias e transferência serial, a cultura de quimiostato envolve o maior número de divisões celulares e, portanto, o maior número de populações diversas. Embora a cultura de quimiostato para ALE exija dispositivos de cultura mais complicados, ela é menos trabalhosa quando a operação começa. Análises genômicas e transcriptômicas comparativas da cepa adaptada fornecem pistas evolutivas sobre como os estressores contribuem para mutações que superam o estresse. O objetivo do presente artigo é trazer a evolução acelerada de microrganismos sob condições controladas de laboratório.

Introduction

Os microrganismos podem sobreviver e se adaptar a diversos ambientes. Sob forte estresse, a adaptação pode ocorrer por meio de aquisição de fenótipos benéficos por mutações genómicas aleatórias e posterior selecção positiva ^1-3. Portanto, as células microbianas podem se adaptar mudando metabólica ou redes de regulação para o crescimento ideal, que é chamado de "evolução adaptativa". tendências microbianas importantes recentes, como surtos de superbactérias e a ocorrência de cepas microbianas robustos, estão intimamente relacionadas com adaptativa evolução sob condições estressantes. Em condições de laboratório definidos, somos capazes de estudar os mecanismos de evolução molecular e até mesmo controlar a direção da evolução microbiana para várias aplicações. Ao contrário de organismos multicelulares, organismos unicelulares estão bem adaptados à evolução laboratório adaptativo (ALE), pelas seguintes razões: eles regeneram rapidamente, eles manter grandes populações, e é fácil de criar e manter homambientes ogeneous. Combinado com os recentes avanços em técnicas de sequenciação de ADN e tecnologias de alto rendimento, ALE permite a observação direta de alterações genômicas que levam a mudanças regulatórias sistémicos. dinâmica de mutação e uma diversidade da população também são observáveis. Estratégias de engenharia genética pode ser determinado a partir da análise de estirpes de AEA ^4,5.

Cultura em quimiostato é um método usado para obter as células em estado estacionário e aumentar a produtividade em processos de fermentação ^6. Adiciona- se meio fresco e caldo de cultura é colhida durante o processo (este último inclui médio e de biomassa). Quimiostato cultura de longo prazo, no entanto, muda a produtividade de estado estacionário da cultura e provoca a acumulação de mutações espontâneas e selecção durante a cultura (Figura 1a). Sob várias pressões de seleção (estressores), o acúmulo de mutações é reforçada. Um aumento gradual de estresse em um longo prazo quimiostato prevê uma selecção contínua de mutações que trabalham contra os factores de stress dadas, tais como temperatura, pH, pressão osmótica, inanição nutriente, oxidação, produtos finais tóxicos, etc. Colony transferência a partir de um meio sólido e de transferência em série de um meio líquido (repetido cultura lote) também permitirá aos investigadores obter microorganismos evoluídos (Figura 1B e 1C). Embora a cultura em quimiostato requer métodos complicados, a piscina de diversidade (número de repetições, e o tamanho da população) é maior do que a obtida por técnicas de transferência em série de transferência de colónia e. A exposição ao estresse estável para células individuais e diminuição da variação no estado celular durante a cultura em quimiostato (estado estacionário) são outros benefícios do ALE em comparação com técnicas baseadas em culturas de diluição. ALE induzida pelo estresse de Escherichia coli submetida a altas condições succinato é introduzido neste artigo.

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Figura 1: Métodos de laboratório evolução adaptativa (A) quimiostato;. (B) a transferência de série; (C) a transferência de colónia. As figuras de topo ilustrar o conceito dos métodos para ALE, e as figuras de fundo ilustrar o número de células que cresceram durante a ALE. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Preparação Equipamento

1. Obter um frasco quimiostato (150-250 ml) ou num balão de Erlenmeyer (250 ml) contendo uma abertura de entrada e uma porta de saída. Ligue as portas com tubo de silicone que permite taxas de fluxo de 10-100 ml / hr. Opcionalmente, usar um respiradouro de ar, uma porta de saída de ar, e portas de entrada e saída de água de temperatura controlada.
2. Obter um dispositivo adequado para o frasco quimiostato que fornece para agitação e controlo da temperatura (ou usar um incubador com agitação rotativa).
3. Obter duas bombas peristálticas de modo a fornecer meio fresco e recolher a cultura.
4. Obter um frasco reservatório (10-20 L) contendo um orifício de saída médio e uma porta de entrada de ar.
5. Obter tubo de silicone adequado para a taxa de diluição (isto é, identificação de 0,8 milímetros, a gama de fluxo 0,06-36 mL / min; L / S 13 tubos).

2. Médio Preparação e Esterilização

1. meio inicial
   1. Dissolve-se 0,3 g de glucose, 0,08 g _de NH ₄Cl, 0,05 g de NaCl, 0,75 g de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, e 0,3 g _de KH ₂ PO ₄ em 90 ml de água destilada (DW) em um frasco de quimiostato.
   2. Selar o frasco quemostato junto com a tubulação usando grampos. Não selar a abertura de ar.
   3. Esteriliza-se o frasco quimiostato numa autoclave a 121 ° C durante 15 min. Após a esterilização, armazenar o frasco quimiostato à temperatura ambiente.
   4. Dissolve-se 0,02 g de MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0,01 g _{de CaCl2,} e 0,1 mg de tiamina em 10 ml de DW (solução A).
   5. Filtrar a solução A, utilizando uma seringa e um filtro de seringa pré-esterilizados (um filtro de 0,45 um de poro).
   6. Adicionar a solução A filtrados para o frasco quemostato.
2. Média Tensão
   1. Dissolve-se 30 g de glucose, 8 g _de NH ₄ Cl, 5 g de NaCl, 75 g de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 30 g _de KH ₂ PO _4, e 300 g de succinato dissódico hexa-hidratado (Na ₂ · · succinato 6H _{2 O; o estressor utilizado neste experimento) em 9,9 L DW em um frasco reservatório.}
   2. Selar o frasco reservatório junto com a tubulação usando grampos. Não selar a abertura de ar.
   3. Esteriliza-se o frasco reservatório em autoclave a 121 ° C durante 15 min. Após a esterilização, armazenar o frasco à temperatura ambiente.
   4. Dissolve-se 2 g de MgSO ₄ 7H ₂ O ·, 1 g _{de CaCl2,} e 10 mg de tiamina em 100 ml de DW (solução A).
   5. Filtrar a solução A com uma seringa e um filtro de seringa pré-esterilizados (um filtro de 0,45 um de poro).
   6. Adicionar a solução A filtrados para o frasco reservatório.
   7. Assepticamente conectar o tubo de silicone esterilizados para o frasco reservatório e anexar as bombas peristálticas.
3. Médio-Alto estresse
   1. Prepare o meio como na secção 2.2, mas com uma maior concentração de estressor (ou seja, 3-5 g / L maior na adaptação succinato).
      Nota: Este protocolo é para adaptação a um estresse thno pode ser entregue através do meio. No caso de factores de stress físicos, tais como a temperatura, agitação, ou iluminação, o cultivo deve ser concebido em conformidade.

3. cultivo inicial

1. Inocular uma única colônia de tipo selvagem E. coli em um tubo de ensaio de 15 mL contendo 4 mL de meio inicial.
2. Incubar o tubo de ensaio num incubador com agitação durante 12 h a 37 ° C e 220 rpm.
3. Transfira assepticamente 1 ml de pré-cultura para o frasco quemostato.
4. Incubar o frasco quimiostato, fornecendo para arejamento (ar de 50 ml / min) e agitação (200 rpm), a 37 ° C durante 6 h.

Adaptação 4. Estresse

1. Assepticamente ligue a extremidade do tubo de silicone das bombas para o frasco quemostato.
2. Inicie a bomba de saída (10 ml / h ou superior) e recolher a cultura.
   Nota: A cultura deve estar na fase exponencial, tipicamente 4-8 horas após o cultivo inicial.
3. CHeck a densidade óptica (600 nm) da cultura a partir do tubo de saída.
4. Iniciar a bomba de entrada (10 ml / h, correspondendo a uma taxa de diluição de 0,1 hr ^-1).
5. Verifique a densidade óptica da cultura a 600 nm da tomada da tubagem a cada 24 h.
6. Operar o quimiostato durante 96 horas (volume 9,6 vezes) ou mais. Se a densidade óptica é estável, trocar o reservatório que contém o meio de alta tensão. Se a densidade óptica é inferior a 0,2, parar a bomba de entrada alimenta durante 6 h. Reinicie a bomba de entrada e verifique se a densidade óptica é superior a 0,2.
7. Aumentar gradualmente a concentração do estressor alterando a um reservatório que contém uma concentração mais elevada estressor.
8. Retirar amostras da cultura adaptada quando ela atinge um marco (por exemplo, uma estirpe adaptada a 100 g / L de stress succinato), e armazenamento para posterior análise genómica.
9. Para o armazenamento da amostra, misturar a amostra de cultura (0,5 ml) com um soluti esterilizado glicerol 80%na (0,5 ml) e armazená-lo a -80 ° C.
   Nota: Se o microorganismo adquire a capacidade de degradar o estressor durante o processo de ALE, a concentração estressor no frasco de fermentação não é a mesma que no reservatório fresco.

5.-colônia Único isolamento da estirpe adaptada-Stress

1. Preparar o meio da placa de agar (1,6% de agar) contendo a mesma estressor e na mesma concentração do meio.
2. Placa da cultura de saída (0,1 ml) a partir do quimiostato, e incuba-se a 37 ° C durante 16 horas.
3. Escolha colónias isoladas da placa utilizando um palito esterilizado e inocular-los em 15 ml de tubos de ensaio que contêm o mesmo estressor e na mesma concentração forma como no quimiostato, e incuba-se durante 6 h.
4. Transferir 1 ml do caldo de cultura num balão de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio. Colheita de 0,5 ml do caldo de cultura a cada um de RH, e medir a DO a 600 nm. Compare a taxa de crescimento do strai adaptadaN ao da estirpe de tipo selvagem dado o estressor.

Results

Para adaptação ao estresse de alta succinato, o tipo selvagem E. coli W3110 estirpe foi cultivada num quimiostato em D = 0,1 h ^-1 durante 270 dias (Figura 2).

Figura 2: adaptação ao estresse de alta succinato de E. coli W3110 usando cultura quemostato. setas finas indicam os tempos em que a concentração de estressor foi aumentada,...

Discussion

Os microrganismos são capazes de se adaptar a quase todos os ambientes, devido à sua rápida taxa de crescimento e diversidade genética. evolução laboratório adaptável permite microorganismos a evoluir em condições destinadas, que fornece uma maneira de selecionar organismos individuais que abrigam mutações espontâneas que são benéficos nas condições dadas.

A técnica quimiostato é mais robusto para a realização evolução de forma artificial do que as técnicas de transferência, pelas seguintes ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fermentador de mini-quimiostato	Biotron Inc.	-	fabricado por encomenda especial
tubo de silício	Cole-Parmer	Masterflex L / S 13	tamanho da tubulação pode ser variado dependendo da taxa de diluição e do tamanho do frasco do fermentador.
frasco reservatório	Bellco	Garrafa de armazenamento de mídia	20 L
produtos químicos	Sigma-Aldrich-grau
reagente glicose	Sigma-Aldrich	G5767	Reagente ACS
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	para biologia molecular, adequado para cultura de células, ≥ 99,5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	reagente ACS, ≥ 99%
Na2HPO4· 2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98,5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	reagente ACS, etc; 99%
MgSO4· 7H2O	Sigma-Aldrich	230391	reagente ACS, ≥ 98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	reagente ACS, ≥ 96%
tiamina· HCl	Sigma-Aldrich	T4625	grau de reagente, ≥ 99%
Na2· succinato· 6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥ 99% de sucesso