Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.
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Artigo de método
Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa
Neste artigo
Resumo
Resumo
A única terapia definitiva para insuficiência cardíaca em estágio terminal é o transplante cardíaco ortotópico. A cada ano, estima-se que mais de 100.000 corações de doadores sejam necessários para procedimentos de transplante cardíaco nos Estados Unidos1-2. Devido ao número limitado de doadores, apenas aproximadamente 2.400 transplantes são realizados a cada ano nos EUA2. Inúmeras abordagens, desde estudos de terapia celular até a implantação de dispositivos de assistência mecânica, foram realizadas, isoladamente ou em combinação, na tentativa de persuadir o coração a se reparar ou descansar o coração com insuficiência3. Apesar desses esforços, os dispositivos de assistência ventricular ainda são amplamente utilizados com o objetivo de fazer a ponte para o transplante e a utilidade das terapias celulares, embora tenham alguma promessa curativa, ainda é limitada a ensaios clínicos. Além disso, o xenotransplante direto foi tentado, mas o sucesso foi limitado devido à rejeição imunológica. Claramente, outra estratégia é necessária para produzir órgãos adicionais para transplante e, idealmente, esses órgãos seriam autólogos para evitar as complicações associadas à rejeição e imunossupressão ao longo da vida. A descelularização é um processo de remoção de células residentes dos tecidos para expor a matriz extracelular nativa (MEC) ou andaime. A descelularização por perfusão oferece preservação completa da estrutura tridimensional do tecido, deixando intacta a maior parte das propriedades mecânicas do tecido4. Esses andaimes podem ser utilizados para repovoamento com células saudáveis para gerar modelos de pesquisa e, possivelmente, órgãos muito necessários para transplante. Expusemos os andaimes de camundongos neonatais (P3), conhecidos por reter notáveis capacidades regenerativas cardíacas,5-8 à descelularização mediada por detergente e repovoamos esses andaimes com células cardíacas murinas. Esses estudos apóiam a viabilidade de projetar uma construção de coração neonatal. Eles ainda permitem a investigação sobre se a MEC de corações pós-natais precoces pode abrigar pistas que resultarão em melhores estratégias de recelularização.
Introdução
A insuficiência cardíaca é comum e mortal. É uma doença progressiva que resulta na diminuição da contractilidade do coração, o que prejudica o fluxo sanguíneo para os órgãos e deixa as necessidades metabólicas do corpo não satisfeitas. Estima-se que 5,7 milhões de americanos têm insuficiência cardíaca e é a principal causa de hospitalização nos Estados Unidos 9. O custo coletivo de tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca nos Estados Unidos ultrapassa os US $ 300 bilhões de dólares por ano 9-10. O único tratamento definitivo para a insuficiência cardíaca em fase terminal é o transplante cardíaco ortotópico. Cada ano, estima-se que mais....
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Protocolo
Todas as experiências de rato foram realizados de acordo com o Animal Welfare Act dos EUA e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Minnesota.
1. Método para coração mouse Isolamento
- Euthanize um rato neonatal por decapitação com uma única lâmina de uso.
- Pincelar o tórax com 70% de etanol.
- Dissecar a pele do peito, cortando-o afastado da parede torácica com uma tesoura padrão enquanto puxa a pele lateralmente com um par de # 5 fórceps.
- Perfurar o abdômen logo abaixo do esterno com a tesoura de corte através da parede abdominal. Agarrando o processo xifóide com # 5 fórceps, r....
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Resultados
decelularização
Em média, o tempo para a descelularização de um coração P3 utilizando este protocolo é de aproximadamente 14 horas. dado um peso médio do coração de 23 mg para o recém-nascido P3.
acelularidade
Figura 3a mostra um coração neonatal P3 totalmente intacto (conjunto de montagem). Figura 3b mostra o mesmo coração seguinte descelularização. As F.......
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Discussão
A dependência desta técnica em perfusões repetidas do coração faz a prevenção de uma embolia um componente crítico de um bom resultado. A partir do cateterismo do coração inicial nos Passos 2,2-2,6, para as mudanças de solução entre as etapas 2.8-2.14, existem manipulações que podem permitir a introdução de bolhas de ar que comprometem o fluxo de perfusato no miocárdio. Devido ao tamanho diminuto do coração neonatal, mesmo minúsculas bolhas na vasculatura pode causar um enfarte técnica, tornando assim a descelularização.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Sra. Cynthia DeKay pela preparação das figuras.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1. Materiais para isolamento do coração de camundongos | |||
| camundongos strong>P1 (conforme mostrado; B6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | ou equivalente |
| 60 mm Placa de cultura | BD Falcon | 353004 | ou equivalente |
| Tampão fosfato solução salina pH 7,4 (estéril) | Hyclone | SH30256.01 | ou equivalente |
| Lâmina de uso único | Stanley | 28-510 | ou equivalente |
| Tesoura padrão | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | ou equivalente |
| Tesoura de mola 10 cm | Ferramentas de ciência fina | 15024-10 | ou equivalente |
| Tesoura de mola Vannas - Ferramentas de ciência fina de ponta de 3 mm | 15000-00 | ou equivalente | |
| # 5 Fórceps | Dumnot (Ferramentas de ciência fina) | 11295-00 | ou equivalente |
| 2. Materiais para descelularização | |||
| Adaptador de entrada | Chemglass | CG-1013 | autoclavável |
| Septo | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavável |
| 1/8 pol. ID x 3/8 OD C-Flex tubulação | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavável |
| Macho luer para adaptador de barb de mangueira de 1/8" | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavável |
| Female luer para adaptador de barb de mangueira de 1/8" | McMaster-Carr | 51525K26 | sutura |
| cirúrgica autoclavável Prolene 7-0 | Ethicon | 8648G | ou suporte de |
| anel | Fisher Scientific | S47807 | ou |
| equivalente Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | ou suporte |
| regular de clamp | Fisher Scientific | 05-754Q | ou |
| equivalente 60 cc seringa barrel | Coviden | 1186000777T | ou equivalente |
| Beaker | Kimble | 14000250 | ou equivalente |
| 22 G x 1 Seringa Agulha | BD | 305155 ou equivalente | |
| Seringa de 12 cc | Coviden | 8881512878 | ou |
| equivalente Torneira de parada de 3 vias | Smith Medical | MX5311L | ou |
| equivalente Tubo PE50 | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Deve ser moldável pelo calor. Polietileno recomendado. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Grau ultrapuro recomendado. Prepare a solução fresca e esterilize com filtro antes de usar. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Prepare a solução fresca a partir de um estoque de 10% e filtre esterilize antes de usar. |
| Água purificada estéril dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Ou sistema MilliQ. |
| 1x Caneta/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | ou equivalente |
| 3. Materiais para quantificação de DNA | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg atividade |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | ou |
| equivalente MgCl2· 6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | ou equivalente |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | ou |
| equivalente Tris base/cloridrato | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | ou |
| equivalente Pico-Green kit de ensaio dsDNA | Technologies | P7589 | requer fluorímetro para ler |
| 4. Método de fixação e secção de tecido | |||
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | ou Gelatina equivalente |
| Tipo A de pele suína | Sigma-Aldrich | G2500 | deve ter 300 flores ou mais |
| 5. Método para histologia tecidual | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | ou equivalente |
| Cryostat | Hacker/ | Bright Model OTF | ou |
| equivalente Lâminas de microscópio 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | ou equivalente |
| Hematoxilina 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | ou equivalente |
| Etanol | Decon Laboratories | 2701 | ou equivalente |
| Definir | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | ou |
| equivalente Buffer azul | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | ou equivalente |
| Alcoólico Eosina Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | ou |
| equivalente Fórmula 83 Substituto do xileno | CBG Biotech | CH0104B | ou equivalente |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | ou equivalente |
| Anticorpo de colágeno IV | Rockland | 600-401-106.1 | ou equivalente |
| &alfa;-Actinina | Anticorpo Abcam | AB9465 | ou equivalente |
| anticorpo mCherry | Abcam | AB205402 | ou equivalente |
| NKX2.5 Anticorpo Santa | Cruz Biotechnology | SC-8697 | ou equivalente |
| Burro anti-rato AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | ou equivalente |
| Anticorpo Anti-frango Donkey AF594 | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | ou equivalente |
| Anticorpo anti-cabra CY5 para burros | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | ou equivalente |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | ou equivalente |
| Prolong Gold Antifade Mountant com DAPI | ThermoFisher | P36930 | ou equivalente |
| 6. Isolamento de cardiomiócitos ventriculares neonatais usando pré-plaqueamento | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | ou equivalente |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | ou equivalente |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | ou |
| equivalente tubo de 50 ml | BD Falcon | 352070 | ou equivalente |
| Primeria 100 mm placas | Corning | 353803 | superfície Primeria melhora a fixação de fibroblastos promovendo uma maior pureza de miócitos |
| Tripsina | Difco | 215240 | ou equivalente |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | ou equivalente |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | ou equivalente |
| Vitamina B12 | com Fibronectina Sigma-Aldrich | V6629 | ou |
| equivalente | BD Bioscience | 354501 | ou equivalente |
| Soro fetal bovino | Hyclone | SH30910.03 | ou equivalente |
| Vidraria biorreator cardíaco | Tecnologia de vidro Radnoti | 120101BEZ | Deve ser esterilizável por autoclavagem ou gás. |
Referências
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al.
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Reimpressões e permissões
