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Artigo de método

Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

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⸱

DOI:

10.3791/54459

⸱

5 de novembro de 2016

 ,  , 
1Lillehei Heart Institute, University of Minnesota

Neste artigo

Resumo

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

Resumo

A única terapia definitiva para insuficiência cardíaca em estágio terminal é o transplante cardíaco ortotópico. A cada ano, estima-se que mais de 100.000 corações de doadores sejam necessários para procedimentos de transplante cardíaco nos Estados Unidos1-2. Devido ao número limitado de doadores, apenas aproximadamente 2.400 transplantes são realizados a cada ano nos EUA2. Inúmeras abordagens, desde estudos de terapia celular até a implantação de dispositivos de assistência mecânica, foram realizadas, isoladamente ou em combinação, na tentativa de persuadir o coração a se reparar ou descansar o coração com insuficiência3. Apesar desses esforços, os dispositivos de assistência ventricular ainda são amplamente utilizados com o objetivo de fazer a ponte para o transplante e a utilidade das terapias celulares, embora tenham alguma promessa curativa, ainda é limitada a ensaios clínicos. Além disso, o xenotransplante direto foi tentado, mas o sucesso foi limitado devido à rejeição imunológica. Claramente, outra estratégia é necessária para produzir órgãos adicionais para transplante e, idealmente, esses órgãos seriam autólogos para evitar as complicações associadas à rejeição e imunossupressão ao longo da vida. A descelularização é um processo de remoção de células residentes dos tecidos para expor a matriz extracelular nativa (MEC) ou andaime. A descelularização por perfusão oferece preservação completa da estrutura tridimensional do tecido, deixando intacta a maior parte das propriedades mecânicas do tecido4. Esses andaimes podem ser utilizados para repovoamento com células saudáveis para gerar modelos de pesquisa e, possivelmente, órgãos muito necessários para transplante. Expusemos os andaimes de camundongos neonatais (P3), conhecidos por reter notáveis capacidades regenerativas cardíacas,5-8 à descelularização mediada por detergente e repovoamos esses andaimes com células cardíacas murinas. Esses estudos apóiam a viabilidade de projetar uma construção de coração neonatal. Eles ainda permitem a investigação sobre se a MEC de corações pós-natais precoces pode abrigar pistas que resultarão em melhores estratégias de recelularização.

Introdução

A insuficiência cardíaca é comum e mortal. É uma doença progressiva que resulta na diminuição da contractilidade do coração, o que prejudica o fluxo sanguíneo para os órgãos e deixa as necessidades metabólicas do corpo não satisfeitas. Estima-se que 5,7 milhões de americanos têm insuficiência cardíaca e é a principal causa de hospitalização nos Estados Unidos 9. O custo coletivo de tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca nos Estados Unidos ultrapassa os US $ 300 bilhões de dólares por ano 9-10. O único tratamento definitivo para a insuficiência cardíaca em fase terminal é o transplante cardíaco ortotópico. Cada ano, estima-se que mais de 100.000 corações transplantados são necessários para os procedimentos de transplante cardíaco nos Estados Unidos 1-2. Devido ao número limitado de doadores, apenas cerca de 2.400 transplantes são realizados a cada ano em os EUA 2. Claramente, esta escassez de órgãos precisa ser tratada como outras estratégias são necessários para produzir órgãos adicionais para transplantação e, idealmente, estes órgãos seriam autóloga, de modo a evitar as complicações associadas com a rejeição e imunossupressão vida.

Cardiomiócitos adultos mamíferos demonstrar uma capacidade de regeneração limitada após lesão, mas evidências recentes sugerem que os corações neonatais mamíferos manter uma notável capacidade de regeneração após lesão 5-8. Especificamente, após a ressecção cirúrgica parcial, uma janela de regeneração foi descoberto entre o dia do nascimento e pós-natal 7. Este período de regeneração é caracterizada por uma falta de cicatriz fibrótica, formação de neo vascularização, libertação de factores angiogénicos a partir do epicárdio, e proliferação de cardiomiócitos 8/5 , 11. Esta janela de tempo regenerativa fornece o potencial para a utilização do coração neonatal como uma nova fonte de material para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

A matriz extracelular é conhecida por fornecer pistas importantes para promover cardiomyocyte a proliferação e crescimento. Diferenças distintas na disponibilidade de moléculas nas matrizes neonatais e adultos de 12 e sua capacidade para promover a regeneração foram exploradas 13. matrizes adultos descelularizados têm sido utilizados em vários estudos para fornecer um andaime ECM para repovoamento celular e a geração de um coração bioartificial. Embora esses estudos, e novas descobertas em tecnologias de células-tronco, estão avançando rapidamente, vários obstáculos ainda precisam ser cumpridos. Por exemplo, as limitações em preservando a estrutura nativa da matriz, a integração celular na parede da matriz, e capacidade para suportar a proliferação e crescimento de todos os limites do sucesso desta abordagem. Enquanto atributos regenerativos superiores têm sido atribuídas ao coração neonatal, os aspectos práticos da utilização de um tecido tal têm limitado a sua exploração.

Com base na capacidade regenerativa demonstrada do coração neonatal, desenvolvemos novas matrizes através do desenvolvimento de umtécnica de descelularização para o coração do rato P3. O coração P3 foi escolhido para estes estudos, uma vez que está dentro da janela de regeneração cardíaca como anteriormente determinada 6 mas o coração é suficientemente grande para colheita, decellularize e recellularize. O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da criação de uma matriz de um coração neonatal mouse. Os nossos estudos fornecem evidência para a viabilidade de um minuto descelularizante, coração neonatal, mantendo a integridade estrutural e proteinácea do ECM. Nós também demonstrar a capacidade de recellularize este ECM cardíaca com mCherry cardiomiócitos expressam e examinamos esses cardiomiócitos para a expressão de vários marcadores cardíacos seguintes recelularização. Esta tecnologia permitirá que para o ensaio da superioridade de uma matriz neonatal para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

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Protocolo

Todas as experiências de rato foram realizados de acordo com o Animal Welfare Act dos EUA e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Minnesota.

1. Método para coração mouse Isolamento

  1. Euthanize um rato neonatal por decapitação com uma única lâmina de uso.
  2. Pincelar o tórax com 70% de etanol.
  3. Dissecar a pele do peito, cortando-o afastado da parede torácica com uma tesoura padrão enquanto puxa a pele lateralmente com um par de # 5 fórceps.
  4. Perfurar o abdômen logo abaixo do esterno com a tesoura de corte através da parede abdominal. Agarrando o processo xifóide com # 5 fórceps, retrair o esterno rostral a partir do corpo durante o corte que as nervuras de ambos os lados da caixa com a tesoura. A caixa torácica é refletida superiormente com a pinça para revelar o coração.
  5. Sem rodeios dissecar os dois principais lóbulos do timo puxando lateralmente com # 5 fórceps, expondoo arco da aorta, bem como as veias cavas e pulmonares.
  6. Transecto as principais artérias do arco aórtico e da própria aorta, com a tesoura primavera 10 cm. Reter a aorta entre a base do coração e a artéria inominada. Segure as extremidades dos vasos rompidos com o # 5 fórceps para refletir o coração para a frente, separando-a da traquéia e esôfago.
  7. Transecto a vasculatura pulmonar e outras veias principais, através do corte entre os pulmões e o coração em ambos os lados do coração com a tesoura de mola 10 cm. As veias permanecer aberta para fornecer drenagem.
  8. Tiraram o coração do mediastino com o # 5 fórceps, segurando as extremidades cortadas dos grandes vasos. Colocar o coração num prato de cultura de 60 mm contendo solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para a cateterização.

2. Método para Decelularização por Langendorff Perfusão

  1. Prepare o conjunto de cateter com antecedência. Desenhar uma secção 4 centímetrosde PE 50 tubos em uma pequena chama de álcool para criar um cateter menores, mais finos. Aparar as extremidades com uma lâmina para satisfazer as dimensões (aprox. OD 300 mm de diâmetro exterior com uma flange de aprox. OD 500 mm) mostrado na Figura 1. Isto irá proporcionar dois cateteres simétricos de ambos os lados do puxar.
  2. O ponto final do corte do tubo para dentro da chama brevemente, para derreter uma flange para a abertura na extremidade mais fina.
  3. Encher a seringa de 12 ml com PBS e montar o cateter, colocando uma torneira de passagem de 3 vias em a seringa. Adicionar um 22 G x 1 agulha para a torneira e conduzir a agulha através do septo. Deslize o tubo do cateter PE arrastado para cima da agulha (fig. 1).
  4. Lavar as peças montadas com PBS, assegurando que todas as bolhas de ar foram removidas.
  5. Insira o cateter, preparado como descrito acima, para a aorta do coração isolado, não se estendendo para além da válvula aórtica e ligar com um empate de 7-0 sutura. Coloque o flange de tele cateter proximal contra o empate, fazendo um selo apertado e impedindo o coração de saindo do cateter.
  6. Observe o cateterismo sob ampliação, enquanto suavemente perfusão do coração utilizando a seringa contendo PBS. Certifique-se de que não há vazamentos no sistema e o tecido homogeneamente empalidece como sangue latente é removido.
  7. Colocar o septo para dentro do gargalo do adaptador para entrada e selá-lo, dobrando os lados sobre o vidro.
  8. Anexar o reservatório cheio com 60 ml de sulfato de dodecilo de sódio a 1% (SDS) em água destilada (dH2O) através de uma linha de comprimento suficiente para produzir uma coluna que gera 20 mmHg de pressão, como mostrado na Fig. 1. Calcula-se a pressão da altura da coluna de líquido com base na relação de 1 mm Hg é igual a 1,3595 centímetros H 2 O.
    Cuidado: SDS é um pó altamente flocculent com propriedades irritantes. O contacto deve ser evitado. Lidar com o pó usando vestuário de protecção adequado.
  9. Perfundir o coração com 1% SDS, durante 14 horas. O coração será translúcido na aparência sem tecido restante observável.
  10. Lave o sistema até a torneira da solução SDS restante e substituí-lo com 10 ml dH 2 O. Perfundir o coração com 10 ml de 1% de Triton X-100 (diluídos em água destilada), seguido de 10 ml de dH 2 O, seguido por 60 ml de PBS contendo 1x penicilina estreptomicina (Pen-Strep).
  11. Armazenar o coração em PBS 1x com Pen-Strep a 4 ° C. Se a aplicação de pós descelularização destina a perfusão requer, então, deve ser mantido o cateter na aorta, de outra forma reduzir o laço de sutura e o remover do cateter.

Determinação 3. DNA

  1. Prepara-se uma digestão de ECM o coração ou o controlo descelularizado utilizando 200 ug / ml de proteinase K em KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, 0,45% de Tween 20 em 10 mM de Tris (pH 8,3).
  2. Incubar o tecido a 55 ° C com agitação até que o tecido é dissolvido,tipicamente 4-5 h.
  3. Quantificar o teor de ADN do homogeneizado com um ADN de ensaio de ligação de 4,11.

4. Fixação e secção de tecido

  1. Fix descelularizados, corações repovoados ou P3 controlo em paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
  2. Lavar o tecido 3x em PBS.
  3. Colocar o tecido numa solução de 7,5% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M a 4 ° C até que se afunda.
  4. Mudar a solução a 15% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M a 4 ° C, novamente, até que se afunda.
  5. Aquecer o tecido a 37 ° C, substituir metade do volume com solução de gelatina em 15% de sacarose e tampão de fosfato 0,1 M e equilibrar durante a noite. Concentrações de gelatina são aumentadas por passos através de 1%, 2,5%, 5% e, finalmente, 7,5%, duas vezes.
  6. Coloque as amostras em cryomolds usando fresco gelatina 7,5%. Para restaurar o formato das amostras descelularizados, gelatina líquido pode ser perfundida para dentro das câmaras como tele corações são moldados. Congelar, flutuando os cryomolds em nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C.
  7. Cut (10 mm de espessura) seções com um criostato. Trazer o slide perto da superfície da seção e observe a seção de se mover para fora da faca na superfície devido à carga nos slides eletrostaticamente tratados. Secam-se as lâminas durante a noite e armazenar a -80 ° C para análise futura.
  8. Retirar as lâminas do congelador, equilibrar à temperatura ambiente e, em seguida, colocar num frasco Coplin contendo PBS durante 20 min a 37 ° C para dissolver a gelatina.
  9. Manchar as seções de corte a partir do Passo 4.7 com Hematoxilina e Eosina. Colocar as lâminas em um frasco Coplin. Expor as lâminas hidratados no passo 4.8 a hematoxilina durante 45 segundos, a água da torneira durante 1,5 min, tampão durante 3 min, a água da torneira durante 1 min, agente anil durante 1,5 min, 80% de etanol durante 1 min, alcoólica eosina Y durante 8 segundos, etanol a 80% durante 1 minuto, 100% de etanol durante 1 min 2x, agente de compensação (substituto de xileno) 3x durante 1 min, a lamela com resinameio de montagem com base. Examine os slides microscopicamente.
  10. Para confirmar a retenção de reactividade proteína da MEC do ECM coração, mancha para proteínas estruturais de ECM tais como colagénio IV, colocando os diapositivos hidratadas numa câmara humidif içada e trata-se com 10% de soro de burro normal (NDS) em salino tamponado com fosfato com 0,1% de Triton -X100 (PBST) durante 1 h à temperatura ambiente (TA). Utilizar um volume suficiente para cobrir as secções de tecido.
  11. Substituir a solução com o anticorpo primário de escolha para uma diluição determinada empiricamente em 5% NDS / PBST. Por exemplo, o anticorpo do colagénio IV foi diluído a 1: 150. Incubar durante a noite a 4 ° C.
  12. Lavam-se as lâminas com PBST 3x e aplicar um anticorpo secundário de escolha conjugado com um corante fluorescente. Dilui-se o anticorpo por uma quantidade determinada empiricamente. Incubar durante 1 h à TA. Lavar 3x com PBS.
  13. Corar as lâminas com um corante de ligação a ADN, tais como DAPI para verificar a ausência de núcleos celulares usando uma mounti contendo DAPIng médio quando a tampa deslizando os slides.
  14. Examinar as lâminas com um microscópio de fluorescência a 50 a 400x.

5. P1 Neonatal Murino Ventricular Cardiomyocytes para Recellularization

  1. Spray de cada filhote com 70% de etanol e decapitar com uma única lâmina de uso.
  2. Segure cada filhote entre o polegar eo indicador, enquanto o tórax é dividido na linha média com pequenas tesouras estéreis para expor a cavidade torácica. Aplicar pressão para permitir que o coração se projetam livremente do peito, enquanto ele é cortado livre dos grandes vasos e os átrios deixando apenas o tecido ventricular.
  3. Colocar cada coração directamente para um tubo de 50 ml contendo 20 ml de cálcio arrefecido com gelo, solução salina tamponada de Hank livre de bicarbonato com 4- (2-hidroxietil) 20 mM -1-piperazinoetanossulfónico (CBFHH) até que todos os corações são recolhidos.
  4. Aspirar o CBFHH e adicionar 10-15 ml de CBFHH fresca (gelada) para o tubo. Lavar o tecido por agitação do tecido em tele tubo várias vezes.
  5. Decantar a solução contendo os corações em um 60 milímetros de plástico de Petri.
  6. Dissecar qualquer tecido atrial latente dos corações sob ampliação no gelo aparando-lo longe dos corações com a tesoura primavera. Picar-se os ventrículos em pedaços pequenos tamanho homogéneo. Remover qualquer tecido não-ventricular separado do prato com # 5 fórceps.
  7. Pipetar tanto da solução CBFHH como é necessário para transferir os fragmentos de tecido em um pequeno frasco esterilizado que contém uma barra de agitação micro estéril.
  8. Permitir que o tecido para sedimentar para o fundo do frasco e remover a solução CBFHH.
  9. Perfaz-se 50 ml de uma solução de enzima de 1,75 mg / ml de tripsina, 20 ug / ml de DNase II em CBFHH. Pipetar 5 ml desta solução de enzimas e adicioná-lo para um tubo contendo o tecido ventricular e picada lugar num agitador magnético. Agita-se a uma taxa constante (340 rpm) à temperatura ambiente durante 8 min.
    NOTA: A ação agitação deve ser suave e ainda permitirpara a suspensão da pasta.
  10. Retirar o frasco da placa de agitação e permitir que a pasta fluida a sedimentar durante 3 min. Pipeta e descartar o sobrenadante inicial digerir, pois ele contém principalmente células do sangue e restos de tecido.
  11. Pipetar uma segunda alíquota de 5 ml da solução de enzima e adicioná-lo ao ventrículo digestão. Agita-se durante 8 minutos e permitir que a sedimentar durante mais 3 min. Antes de iniciar as digestões, preparar dois tubos de 50 mL (rotulados 1 e 2), cada um contendo 12 ml de soro fetal de bovino gelada (FBS). Coloque um filtro de células 40 mm no topo de cada tubo. Pipet esse sobrenadante para o filtro no tubo 1.
  12. Repetir o processo de digestão um adicional de 8 vezes, alternando-se a colocação do sobrenadante Digest entre os dois tubos contendo FBS. Dividir o último sobrenadante igualmente entre tubos 1 e 2 para garantir volumes iguais em cada tubo.
    NOTA: Cada tubo de recolha de agora irá conter 32,5 ml volume total de suspensão de células.
  13. Centrifugar os tubos contêmção do sobrenadante a 150 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
  14. Durante a recolha das alíquotas de digestão, preparar cinco placas de cultura de tecidos de 100 mm com 6 ml de meio (de Eagle Modificado por Dulbecco meios (DMEM) com 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamina) por placa. Incubar estas alíquotas a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 minutos para equilibrar os meios de comunicação.
  15. Aspirar a mistura de enzimas CBFHH e ressuspender as células em 30 ml de meio de cultura preparado acima, combinando as células de ambos os tubos de recolha.
  16. Retorno de 6 ml de suspensão celular a cada uma das placas de 100 mm e incubar durante 45 min a 37 ° C.
  17. No final da incubação, transferir as células não aderentes a 5 novos pratos e re-incubar durante 45 minutos (a fracção de fibroblastos terá começado a aderir aos pratos e podem ser cultivadas separadamente, se desejado).
  18. No final da segunda rodada de pré-chapeamento, recolher os meios de comunicação e as células não aderentes de pratos e girar os meios de comunicação em 150xg durante 6 min.
  19. Colhem-se o excesso de meios para levar as células à concentração desejada aproximada, (4,0 x 10 5 células por construto em 100 ul de perfusato). Retirar uma alíquota para contagem e ou a viabilidade de testes 14.

6. biorreator Recellularization de P3 coração Matrix

  1. Pretreat a matriz de coração isolado com meios de cultura (ver Passo 5,15) durante a noite antes de adicionar as células.
  2. Montar os elementos de um sistema de Langendorff, como mostrado na Fig. 2. Autoclave as peças de vidro e óxido de etileno esterilizar as peças de plástico para garantir a esterilidade. Vários sub-unidades do sistema pode ser montado numa câmara de fluxo laminar antes de ser montado no cavalete de suporte. Circulating banho de água e trajecto de escoamento de água aquecida foi omitida para maior clareza.
  3. Encha o sistema montado com 120 ml de meio de cultura de tecidos (ver passo 5.15).
  4. Colocar a matriz de coração cateterizada do Passo 2,14 em um cul 60 milímetrostura Prato sob ampliação e ligar uma seringa de 1 mL com 22 L x 1 agulha carregada com suspensão de células a partir do Passo 5,20 para o cateter. Certifique-se de que esta montagem é livre de bolhas de ar para evitar embolizante o coração.
  5. Suavemente perfundir os 100 ul de suspensão de células no interior da matriz do coração através das artérias coronárias. Depois de concluído, retire a combinação seringa / agulha.
    NOTA: A perfusão lenta de aprox. 20? L por min é necessária para impedir que as células se escoe para fora das veias, que transitam pelo coração.
  6. Com um topo romba 22g fixada ao encaixe de Luer sobre o lado de baixo da tampa frasco de biorreactor coração, empurrar o cateter para o topo.
  7. Iniciar a bomba peristáltica e observa-se que o fluxo procede conforme descrito na Figura 2. Rendimentos fluir a partir do reservatório através da bomba através do borbulhador para o cateter colocado na aorta no Passo 2.5 (vermelho caminho na Fig. 2). Observar o fluxo da circulação cardíaca fora da veias e gotejamento a partir do vértice, para recirculação do reservatório meios.
    NOTA: A taxa de fluxo de perfusão é dependente de factores individuais, tais como a resistência vascular da construção, e o tamanho do coração, mas uma taxa de 50 a 100 ul / min é um bom ponto de partida. Em pontos de tempo intermédios, avaliação funcional pode ser executado. A escala de tamanho do coração repovoados neonatal limita as avaliações, o que pode ser realizado, mas nós determinamos que os sistemas baseados opticamente pode ser utilizado para quantificar a bater comportamento do mesmo modo que foram usadas em corações de ratos adultos. 4 A construção pode ser perfundido para estendida períodos de tempo (até 23 h).

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Resultados

decelularização
Em média, o tempo para a descelularização de um coração P3 utilizando este protocolo é de aproximadamente 14 horas. dado um peso médio do coração de 23 mg para o recém-nascido P3.

acelularidade
Figura 3a mostra um coração neonatal P3 totalmente intacto (conjunto de montagem). Figura 3b mostra o mesmo coração seguinte descelularização. As F...

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Discussão

A dependência desta técnica em perfusões repetidas do coração faz a prevenção de uma embolia um componente crítico de um bom resultado. A partir do cateterismo do coração inicial nos Passos 2,2-2,6, para as mudanças de solução entre as etapas 2.8-2.14, existem manipulações que podem permitir a introdução de bolhas de ar que comprometem o fluxo de perfusato no miocárdio. Devido ao tamanho diminuto do coração neonatal, mesmo minúsculas bolhas na vasculatura pode causar um enfarte técnica, tornando assim a descelularização...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Sra. Cynthia DeKay pela preparação das figuras.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1. Materiais para isolamento do coração de camundongos
camundongos strong>P1 (conforme mostrado; B6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)Jackson Laboratories21577ou equivalente
60 mm Placa de culturaBD Falcon353004ou equivalente
Tampão fosfato solução salina pH 7,4 (estéril)HycloneSH30256.01ou equivalente
Lâmina de uso únicoStanley28-510ou equivalente
Tesoura padrãoMoria Bonn (Fine Science Tools)14381-43ou equivalente
Tesoura de mola 10 cmFerramentas de ciência fina15024-10ou equivalente
Tesoura de mola Vannas - Ferramentas de ciência fina de ponta de 3 mm15000-00ou equivalente
# 5 FórcepsDumnot (Ferramentas de ciência fina)11295-00ou equivalente
2. Materiais para descelularização
Adaptador de entradaChemglassCG-1013autoclavável
SeptoChemglassCG-3022-99autoclavável
1/8 pol. ID x 3/8 OD C-Flex tubulaçãoCole-ParmerEW-06422-10autoclavável
Macho luer para adaptador de barb de mangueira de 1/8"McMaster-Carr51525K33autoclavável
Female luer para adaptador de barb de mangueira de 1/8"McMaster-Carr51525K26sutura
cirúrgica autoclavável Prolene 7-0 Ethicon8648Gou suporte de
anelFisher ScientificS47807ou
equivalente ClampFisher Scientific05-769-6Qou suporte
regular de clampFisher Scientific05-754Qou
equivalente 60 cc seringa barrel Coviden1186000777Tou equivalente
BeakerKimble14000250ou equivalente
22 G x 1 Seringa AgulhaBD305155 ou equivalente
Seringa de 12 ccCoviden8881512878ou
equivalente Torneira de parada de 3 viasSmith MedicalMX5311Lou
equivalente Tubo PE50BD Clay Adams Intramedic427411Deve ser moldável pelo calor. Polietileno recomendado.
1% SDSInvitrogen15525-017Grau ultrapuro recomendado. Prepare a solução fresca e esterilize com filtro antes de usar.
1% Triton X-100Sigma-AldrichT8787Prepare a solução fresca a partir de um estoque de 10% e filtre esterilize antes de usar. 
Água purificada estéril dH2OHycloneSH30538.02Ou sistema MilliQ.
1x Caneta/StrepCorning CellGro30-001-Clou equivalente
 
3. Materiais para quantificação de DNA
Proteinase KFisherBP1700>30 U/mg atividade
KClSigma-AldrichP9333ou
equivalente MgCl2· 6H2OMallinckrodt5958-04ou equivalente
Tween 20 Sigma-AldrichP1379ou
equivalente Tris base/cloridratoSigma-AldrichT1503/T5941ou
equivalente Pico-Green kit de ensaio dsDNATechnologies P7589requer fluorímetro para ler
4. Método de fixação e secção de tecido
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148ou Gelatina equivalente
Tipo A de pele suínaSigma-AldrichG2500deve ter 300 flores ou mais
5. Método para histologia tecidual
Cryomolds 10 x 10 x 5 mmTissue-Tek4565ou equivalente
CryostatHacker/Bright Model OTFou
equivalente Lâminas de microscópio  25 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-19ou equivalente
Hematoxilina 560 Surgipath/Leica Selectech 3801570ou equivalente
EtanolDecon Laboratories2701ou equivalente
DefinirSurgipath/Leica Selectech 3803590ou
equivalente Buffer azul Surgipath/Leica Selectech 3802915ou equivalente
Alcoólico Eosina Y 515 Surgipath/Leica Selectech 3801615ou
equivalente Fórmula 83 Substituto do xileno CBG Biotech CH0104Bou equivalente
Permount Mounting Medium Fisher Chemical SP15-500ou equivalente
Anticorpo de colágeno IVRockland600-401-106.1ou equivalente
&alfa;-ActininaAnticorpo AbcamAB9465ou equivalente
anticorpo mCherryAbcamAB205402ou equivalente
NKX2.5 Anticorpo SantaCruz BiotechnologySC-8697ou equivalente
Burro anti-rato AF488 AntibodyLife TechnologyA21202ou equivalente
Anticorpo Anti-frango Donkey AF594Jackson Immunoresearch703-585-155 ou equivalente
Anticorpo anti-cabra CY5 para burrosJackson Immunoresearch 705-175-147ou equivalente
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594Jackson Immunoresearch111-587-003ou equivalente
Prolong Gold Antifade Mountant com DAPIThermoFisherP36930ou equivalente
6. Isolamento de cardiomiócitos ventriculares neonatais usando pré-plaqueamento
HBSS (Ca, Mg Free)HycloneSH30031.02ou equivalente
HEPES (1 M)Corning CellGro25-060-Clou equivalente
Cell StrainerBD Falcon352340ou
equivalente tubo de 50 mlBD Falcon352070ou equivalente
Primeria 100 mm placasCorning353803superfície Primeria melhora a fixação de fibroblastos promovendo uma maior pureza de miócitos
TripsinaDifco215240ou equivalente
DNase IISigma-AldrichD8764ou equivalente
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)HycloneSH30022.01ou equivalente
Vitamina B12 com Fibronectina Sigma-AldrichV6629ou
equivalente BD Bioscience354501ou equivalente
Soro fetal bovinoHycloneSH30910.03ou equivalente
Vidraria biorreator cardíacoTecnologia de vidro Radnoti120101BEZDeve ser esterilizável por autoclavagem ou gás.
equivalente equivalente Life Placas revestidas

Referências

  1. Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
  2. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
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