Artigo de método

Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas

DOI:

10.3791/54460

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13 de setembro de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A avaliação precisa dos efeitos anti-inflamatórios é de extrema importância para a avaliação de novos medicamentos potenciais para o tratamento da doença inflamatória intestinal. A microscopia holográfica digital fornece avaliação da inflamação em amostras de tecido colônico murino e humano, bem como avaliação multimodal automatizada da cicatrização de feridas epiteliais in vitro.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A incidência de doença inflamatória intestinal, ou seja, doença de Crohn e colite ulcerosa, aumentou significativamente ao longo da última década. A etiologia de IBD permanece desconhecida e estratégias terapêuticos actuais baseiam-se na supressão não específica do sistema imunitário. O desenvolvimento de tratamentos que visam especificamente a inflamação intestinal e a cicatrização de feridas epiteliais poderia melhorar significativamente a gestão da DII, no entanto, isto exige uma detecção precisa das alterações inflamatórias. Actualmente, os potenciais candidatos a fármacos são geralmente avaliada utilizando modelos animais in vivo ou com técnicas baseadas cultura de células in vitro. O exame histológico geralmente requer as células ou tecidos de interesse a serem manchadas, que podem alterar as características da amostra e, além disso, a interpretação dos resultados podem variar de acordo com especialização investigador. microscopia holográfica digital (DHM), com base na detecção de atraso comprimento do percurso óptico, permitemancha-livre imagem de contraste de fase quantitativa. Isso permite que os resultados sejam directamente correlacionada com parâmetros biofísicos absolutos. Demonstramos como a medição das mudanças na densidade do tecido com DHM, com base na medição do índice de refração, pode quantificar alterações inflamatórias, sem coloração, em diferentes camadas de amostras de tecido do cólon de ratos e seres humanos com colite. Além disso, demonstramos monitoramento livre-label multimodal contínuo de cicatrização de feridas epiteliais in vitro, possível usando DHM através da determinação automatizado simples da área ferida e determinação simultânea de parâmetros morfológicos, tais como a massa seca e espessura da camada de células que migram. Em conclusão, DHM representa um valioso, novos e ferramenta quantitativa para a avaliação da inflamação intestinal com valores absolutos de parâmetros possíveis, quantificação simplificado de cicatrização de feridas epiteliais, in vitro e, por conseguinte, tem um elevado potencial para o retorno de diagnóstico translacionalSE.

Introdução

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Doença inflamatória do intestino (IBD), isto é, a colite ulcerosa (UC) e doença de Crohn (CD) são desordens inflamatórias idiopáticas do tracto gastrointestinal 1. A investigação sobre a fisiopatologia subjacente de IBD ea avaliação de potenciais novos medicamentos ou novas abordagens de diagnóstico é particularmente importante. Tanto na pesquisa básica e o manejo clínico de pacientes com DII, a mucosa intestinal tornou-se um foco de atenção 2,3. A mucosa representa um contorno anatómico, em que a interacção entre as bactérias comensais, células epiteliais e os vários componentes celulares do sistema imune do intestino intestino orquestrar homeostase 4,5. No entanto, em pacientes com DII, inflamação intestinal descontrolada e persistente conduz a danos da mucosa, detectável como ulcerações ou estenose, o que pode finalmente culminam na degradação da função de barreira epitelial, que se agrava a inflamação local 6.

epitelial cicatrização de feridas é, portanto, crucial para a regeneração epitelial seguinte inflamação, mas também é um requisito fundamental para a cura de úlceras gastrointestinais ou deiscência de anastomose após a cirurgia gastrointestinal 7. Epitelial a cicatrização de feridas pode ser simulada in vitro Os ensaios de cura de feridas e em modelos de murídeo de inflamação intestinal 8,9. Tanto in vitro como in vivo abordagens apresentam desvantagens, o que limita a precisão da avaliação experimental. Os ensaios in vitro, como ensaios clássicos de raspar, requerem procedimentos de coloração prolongadas ou transfecção com cromóforos fluorescentes. Eles são, muitas vezes limitada pela sua monitorização descontínua da proliferação e migração celular, que não pode ser automatizado 10. Modelos in vivo, tais como o sulfato de dextrano de sio (DSS) de colite induzida, carecem frequentemente robustos read-outs, em parte devido à variação significativa observada em marcadores laboratoriais, marei tais marcadores inadequados para avaliar a gravidade da colite 11,12. A análise histológica da mucosa inflamada ainda está a abordagem mais válida para determinar a gravidade da colite, mas isso, como ensaios in vitro de cicatrização de feridas epiteliais, requer coloração e depende de perícia do investigador 13.

Microscopia holográfica recentemente digitais (DHM), uma variante de microscopia de fase quantitativa 14, foi identificada como uma ferramenta útil para a avaliação da cicatrização do epitélio da ferida in vitro e in vivo 15. DHM permite a avaliação da densidade do tecido através da medição de atraso comprimento do trajecto óptico (OPD) , cujo diagnóstico perspectivas romance câncer de 16-18 e quantificação de inflamação relacionada alterações teciduais 19. Além disso, DHM permite o monitoramento da dinâmica da morfologia celular por determinar a espessura das células, células coberta área de superfície e intracelular (proteína) a quantidade de conteúdo 15,20. Em ensaios in vitro, DHM também permite a análise de processos fisiológicos, por exemplo, permeabilidade à água celular por avaliar alterações no volume celular e espessura 21,22. Além disso, as medições DHM pode ser automatizado que evita viés de amostra associada ao investigador.

Aqui, demonstramos a utilização de DHM em um modelo murino de inflamação intestinal, e também se aplicam DHM para análise de amostras de tecidos humanos para monitorização quantitativa de cicatrização de feridas como um ensaio in vitro isento de etiqueta. Em primeiro lugar, avaliar as alterações inflamatórias de diferentes parede camadas do cólon em camundongos col�icos e cortes de tecidos de seres humanos com IBD. Depois de descrever o procedimento de imagiologia quantitativa fase DHM, que fornecem instruções detalhadas para a utilização dos componentes de microscópio, a preparação de secções de tecido e também descrevem a avaliação das imagens de fase quantitativa adquiridos.

Em seguida, mostramos que DHM pode ser utilizado para a monitoração contínua de multimodal epitelial cicatrização de feridas in vitro, e descrever a análise das características celulares como a espessura da camada de células, massa seca e volume celular dar dicas sobre as alterações induzidas por drogas e celulares fisiológico.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comité regional de ética (o Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Alemanha) de acordo com a Lei de Protecção dos Animais alemã. O comitê de ética local da Universidade de Münster aprovou o uso de tecidos humanos para análise histológica e microscópio.

1. Os animais e Materiais

  1. Use mulher ou ratos machos da estirpe DSS-suscetíveis exigia que pesam de 20 a 25 g, e casa de acordo com a legislação local cuidados com os animais. Forneça ração especial para roedores e autoclavado beber água ad libitum.
  2. Induzir a colite DSS aguda por administração de 3% w / v de sulfato de dextrano de sio (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) em água da torneira tratada em autoclave durante 5 dias.
    NOTA: A potência de DSS é altamente variável dependendo do fabricante e lote. Teste o seu DSS fornecidos pelo fornecedor primeira para a indução da atividade da doença, para a qual daily peso corporal é um indicador confiável e objetiva.
  3. Para a avaliação histológica de amostras de tecido do cólon, eutanásia ratos por insuflação de CO 2 (ou, conforme especificado pelas normas nacionais e institucionais) no final da experiência.

2. Configuração experimental para DSS-colite e In-vitro Wound Healing 'Ensaios

  1. Cultura de células e ensaio de estabelecimento de cicatrização de feridas.
    1. Crescer as células Caco-2 em uma humidade relativa de 95% e 5% de CO 2 ambiente a 37 ° C. Use meio RPMI com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Semente células Caco-2 a uma densidade de 4 x 10 5 células / cm2 em 35 mm pratos Petri com alta-cultura de inserção (ver Figura 4A).
      NOTA: O inserto gera duas áreas de células cobertas que são separados por um espaço livre de células definida que representa a área de ferida a ser analisado.
    3. Alterar meio de dois dias após seeding. Realizar por aspiração primeiro meio residual com restos de células, usando uma pipeta automática, lave com 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicionar meio fresco ou meio RPMI privadas de soro.
    4. células de cultura durante 24 horas em meio privado de soro (0,1% FBS) suplementado com 20 ng de EGF / ml de soro ou 2 mg de mitomicina c / ml de soro para detectar alterações no comportamento cicatrização das feridas. Adicionar meio normal RPMI com células de controlo, durante 24 h.
    5. Após 24 h de cultura, remover e descartar inserções de cultura tal como descrito no passo 3.4 e executar DHM.
  2. A indução de colite DSS aguda
    1. Dissolve-se 3 g de DSS em 100 ml de água autoclavada para obter um 3% (w / v) de solução de DSS. Fornecer esta solução no lugar de água potável para ratos ad libitum durante 7 dias. Calcule 5 ml de DSS-solução por rato / dia. Fornecer água autoclavada sem DSS para os ratos de controlo ad libitum.
  3. Preparação de secções de criostato de murino e humano do cólon
    1. Eutanásia ratos por insuflação de CO 2 no final da experiência.
    2. Dissecar abdómen dos animais, de laparotomia 23. Remover todo o cólon cuidadosamente usando uma pinça e cortar o final ileal e rectal utilizando uma tesoura cirúrgica. Cortar o cólon com uma tesoura longitudinalmente a partir do ceco ao fim rectal e abrir o cólon. Remover todas as fezes a partir do espécime usando uma pinça seguido de lavagem com PBS 24.
    3. Prepare rolos suíços rolando acima de todo o cólon com um cotonete longitudinalmente a partir do ceco até o fim rectal com a mucosa curvado para dentro. Incorporar amostras de cólon em temperatura de corte óptima composto (OCT) e manter-se congeladas a -80 ° C até à sua utilização.
    4. Incorporar tecido do cólon humano da peça cirúrgica, em corte temperatura outubro composto ideal e manter congeladas a -80 ° C até à sua utilização.
    5. Os cortes histológicos de 7 um de espessura dos espécimes embebidos em OCT-compostos com a ajuda de um cryoto-me apenas antes do exame.
      NOTA: A espessura da amostra óptima depende da persistência e as propriedades de dispersão do tipo de tecido sob investigação. Para os experimentos descritos utilizando tecido do cólon, espessura de corte> 10 mm causa aumento significativo de ruído devido à dispersão da luz em imagens quantitativos de contraste de fase DHM, enquanto as amostras de espessura <5 mm mostrar um maior risco de danos induzidos artefatos do processo de corte de crio.
    6. Transferir seções para um slide transportadora objeto de vidro.

3. Equipamento Técnico, Software e Procedimentos de Aquisição e Avaliação de hologramas digitais

  1. microscópio holográfico digital para celular quantitativa e tecidual
    1. Usar um sistema de microscopia de fora do eixo de Mach-Zehnder, holográfico digitais para imagens de células vivas 25, como mostrado na Figura 1. Assegurar que o microscópio é equipado com uma10X lente do microscópio, um estágio de microscópio com um suporte para slides transportador de objectos de vidro e placas de Petri com um diâmetro de 35 mm, com uma câmara de aquecimento para preservar temperatura fisiológica a 37 ° C e software para imagiologia quantitativa de fase 25.
      NOTA: Por exemplo, tal como descrito em Kemper et al 26 e 27 de Langehanenberg et ai...
      NOTA: Como alternativa, use um sistema semelhante, que é capaz de realizar microscopia de campo brilhante e imagiologia fase quantitativa de células vivas e lâminas de tecidos dissecados.
    2. Lente de microscópio limpa e condensador com papel de limpeza de lentes e um agente de limpeza (por exemplo, etanol), como recomendado pelo fabricante do microscópio para remover a poeira ou outras contaminações.
    3. Inicie o software de aquisição de imagem do microscópio DHM, selecione o modo "brilhante campo" imaging and switch "on" iluminação de luz branca. Certifique-se de Köhler-iluminção da amostra, tal como recomendado pelo fabricante microscópio, enquanto observando a amostra na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagem (em alternativa, um software de aquisição de imagem padrão pode ser utilizado neste passo).
      NOTA: A intensidade da imagem devem ser homogeneamente distribuído no campo de visão e a posição da amostra não devem mover-se durante a reorientação óptico com a unidade de focagem do microscópio.
    4. Selecione o modo "DHM" imaging, vire "off" iluminação de luz branca e interruptor "on" a luz do laser. Verificar que a iluminação com luz laser é homogénea (isto é, que a intensidade da luz é homogeneamente distribuída na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagens do microscópio DHM) e observa-se que o transportador padrão de interferência franja fora do eixo aparece com contraste adequado na imagens capturadas (hologramas digitais).
  2. Preparação de secções de criostato para imagiologiacom DHM
    1. Aqui o (secção criostato num transportador objeto de vidro, espessura: 7 ^ M, tal como descrito em 2.3) da amostra para fora do congelador. Descongelar a amostra para cerca de 5 min a RT e atmosfera normal.
    2. Adicionar 50 - 100 ul de fosfato salina tamponada (PBS) como meio para incorporação da secção de tecido, utilizando uma pipeta até que esteja completamente coberto com tampão. Cobrir a amostra com uma lamela de vidro limpo (espessura de vidro de 170 mm).
      NOTA: Over-secagem pode induzir alterações significativas do índice de refracção e propriedades dispersivas da amostra.
    3. Certifique-se de que a parte inferior do suporte de vidro e a lamela de cobertura são limpos da poeira e outros contaminantes, que podem induzir a dispersão de luz. A amostra está pronta para a investigação com microscopia de campo brilhante e DHM.
  3. imaging fase quantitativa das secções de tecido com DHM
    1. Ligue o microscópio holográfico digitais, escolha a lente do microscópio 10X para a imagem latente. Inicie o isoftware de aquisição de mago do microscópio DHM e selecione o modo de imagem de arquivo brilhante.
    2. Coloque o slide tecido como descrito em 2) no suporte da lâmina de microscópio, com a lâmina de cobertura de frente para a objetiva do microscópio.
    3. Interruptor "on" a iluminação brilhante campo do microscópio DHM. Posicionar a amostra com o microscópio de fase e assegurar que a área de tecido de interesse é visível na janela de monitorização em directo. Melhorar a nitidez da imagem usando a unidade foco do microscópio.
      NOTA: Como bem como a área de interesse, uma área de corrediça sem tecido também deve estar presente no campo de visão.
    4. Capturar uma imagem de campo claro da amostra nitidamente focadas utilizando o software de aquisição de imagem.
    5. Selecione o modo "DHM" imaging, vire "off" a iluminação de luz branca e vire "on" a iluminação de luz laser. Selecione o "tempo de exposição" para a gravação holograma abaixo de 3 ms, observamos que holographic fora do eixo franjas de interferência aparecem com contraste adequado na janela de imagem ao vivo do programa de aquisição de imagens e capturar um holograma digital.
    6. Repita os passos 3.3.3 - 3.3.5 até que um número suficiente de imagens de campo brilhante e hologramas digitais de diferentes áreas de amostra foram registrados. aquisição holograma está concluída.
  4. Preparação de ensaios de cicatrização de feridas para imagiologia DHM
    1. Ligar a câmara de aquecimento placa de Petri com o microscópio sobre DHM 1-3 h antes do início da experiência para assegurar condições de temperatura estáveis ​​durante as medições DHM.
    2. Prepare bancada com o equipamento necessário (placa de Petri para o ensaio de cicatrização da ferida é descrito em 2.3): pipetas, pinças, tampa de vidro para uma placa de Petri, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) tamponada com meio de cultura de células com soro fisiológico temperatura (37 ° C) durante a preparação da amostra em ambiente estéril.
      NOTA: de NaHCO3.
    3. Remover a tampa de plástico a partir da placa de Petri e remover o meio de cultura de células com uma pipeta. Remova a inserção da parte inferior placa de Petri, usando uma pinça.
    4. Lava-se a amostra com 1 - 2 vezes com 1 ml de tampão HEPES meio de cultura celular, a fim de remover as células mortas e as restantes componentes celulares (por exemplo, soro) na área da ferida. Adicione 2 ml de HEPES meio de cultura celular tamponado e tampar a placa de Petri com a tampa de vidro.
    5. Certifique-se de que a tampa de vidro e parte inferior placa de Petri foram limpos de poeira e outra contaminação. A amostra está pronto para observação de lapso de tempo com DHM.
  5. Monitorização contínua multimodal de cicatrização de feridas in vitro com DHM
    1. Ligar a câmara de aquecimento placa de Petri com o microscópio sobre DHM 1-3 h antespara o início da experiência para assegurar condições de temperatura estáveis ​​durante as medições DHM.
    2. Interruptor "on" o microscópio holográfico digital, seleccione a lente 10X microscópio para a imagem latente. Inicie o software de aquisição de imagem do microscópio DHM e selecione o modo de imagem "brilhante campo". Assegure-se que a câmara de aquecimento para a placa de Petri está a funcionar a uma temperatura fisiológica (37 ° C).
    3. Colocar a placa de Petri com o ensaio de cicatrização da ferida, preparado como descrito em 4), na câmara de aquecimento do microscópio DHM.
    4. Selecione o modo de imagem de campo claro e posicionar a amostra com o estágio do microscópio, observando-lo na janela de monitoramento ao vivo do software de aquisição de imagem do microscópio DHM. Observa-se que a área desejada da amostra aparece focalizada nitidamente sob iluminação de luz branca.
    5. Capturar imagens brilhantes de campo de diferentes áreas da amostra do (área ferida e áreas circundantes com células confluentes) sob brancoiluminação de luz com o software de aquisição de imagem e o aspecto do documento, a densidade celular e a homogeneidade.
    6. Selecione o modo de imagem "brilhante campo" do microscópio DHM. Escolha uma área ferida adequado sob iluminação de luz branca na janela de monitoramento ao vivo com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM. Verifique se a área da ferida está livre de células mortas e sem restos de soro, e garantir que ambos os lados incluem uma camada de células homogénea única, de preferência com bordas retas.
    7. Capturar uma imagem de luz branca da área da ferida inicial no modo de imagem de campo claro com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM.
    8. Turn "off" iluminação de luz branca, selecione o modo "DHM" e interruptor "on" iluminação laser. Escolha um tempo de exposição de abaixo de 3 ms para gravar holograma (observar que fora do eixo holográfica franjas de interferência aparecem com contraste adequado na janela de imagem ao vivo do software de aquisição de imagens de tele DHM microscópio) e capturar um holograma digital.
    9. Capturar um holograma exemplo em modo DHM com o software de aquisição de imagem e reconstruir uma imagem quantitativa fase com o software de reconstrução do microscópio DHM, a fim de verificar a qualidade da imagem.
    10. Seleccionar um intervalo de tempo adequado (por exemplo, 3-5 minutos) para aquisição holograma lapso de tempo com o software de aquisição de imagem do microscópio DHM.
    11. Selecione o modo de aquisição de lapso de tempo do software de aquisição de imagem em que a amostra só é iluminado com luz laser durante a aquisição de holograma.
    12. Comece a observação DHM lapso de tempo do ensaio a cicatrização de feridas.
    13. Parar a aquisição de lapso de tempo após o tempo pretendido, seleccionar o modo de imagem de campo claro e documentar a aparência final da amostra em imagens de luz branca.
  6. Reconstruir hologramas digitais de tecidos dissecados e determinar o índice de refracção médio como um parâmetro para a quantificaçãodensidade do tecido
    1. Reconstruir imagens fase quantitativa dos hologramas digitais de tecidos dissecados com o software do microscópio DHM, por exemplo, como descrito em Kemper et al. 26 e Langehanenberg et ai. 27.
    2. Determinar o contraste média fase Δφ em diferentes camadas de tecidos (epitélio, submucosa, estroma) em regiões adequadamente escolhidos de interesse (ROI) 19.
    3. Determinação do índice de refracção do meio de fixação por meio de um refractómetro ou, em alternativa, utilizando um valor adequado a partir da literatura. (valores de índice de refracção para a incorporação típica meios: água = 1,334 N 28, N tampão fosfato salino (PBS) 1,337 = 29, n = meio de cultura celular 1,337-1,339 29,30).
    4. Calcular os índices de refração de diferentes camadas de tecido a partir do contraste de fase média de valores 19
      figure-protocol-1 NOTA: Na Eq. 1 λ é o comprimento de onda da luz do laser (aqui: λ = 532 nm), d a espessura dos tecidos dissecados (aqui: 7 pm) e n forma é o índice de refracção do meio de fixação (aqui: N PBS médio = N = 1.337, determinado por um Abbe-Refractometer).
  7. Reconstruir e avaliar hologramas digitais do lapso de tempo de cicatrização de feridas observação série
    1. Reconstruir imagens fase quantitativa da série lapso holograma tempo obtido durante a observação cicatrização de feridas com o software microscópio DHM 26,27.
    2. Normalizar cada série de imagens fase quantitativa da imagem com contraste de fase máxima.
    3. Determinar a área S c que é coberta pelas células nas imagens quantitativos fase DHM por segmentação da imagem, que pode ser porformada utilizando o profiler celular software livre (www.cellprofiler.org 31).
    4. Calcula-se a média de contraste de fase de células a célula Δφ na área S C.
    5. Recuperar o DM massa seca celular da célula Δφ contraste de fase média na área S c 15
      figure-protocol-2 (2)
      NOTA: Na Equação 2 DM indica a massa seca celular, S c apresenta a área que está ocupada pelas células e α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Determinar o integral de refracção celular índice n celular e o índice de refracção do meio de cultura de células médio n. Determinar celular n separadamente experimentalmente a partir de células em suspensão, como descrito no 30 e medir meio de n com um refratômetro. Alternavamente usar os valores da literatura para a célula n 30 e n média 29,30.
    7. Calcula-se a média de espessura d de células a partir de células λ, Δφ célula, célula N e n forma 26,32
      figure-protocol-3 (3)
      NOTA: Na Eq. 3 a célula parâmetro d é a espessura média das células, λ denota o comprimento de onda de luz da luz laser, de células Δφ indica o contraste de fase média, e n celular e n forma são o índice de refracção celular integral e o índice de refracção do meio circundante.

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Resultados

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Configuração típica para DHM Imaging for Digital Holographic Microscopy (DHM)

Para realizar imagem de campo brilhante e as imagens de contraste de fase quantitativa DHM, aplicou-se um microscópio invertido, como representado na Figura 1 B. O sistema foi modificado por fixação de um módulo de DHM, conforme descrito anteriormente 25. Hologramas digita...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós demonstramos que DHM fornece uma avaliação precisa dos danos histológico em modelos de colite murina e amostras de tecido do cólon humanos ex vivo. Além disso, temos mostrado DHM pode monitorar continuamente a cicatrização de feridas epiteliais e proporcionar simultaneamente informação multimodal sobre alterações celulares. Em DHM, a reconstrução de hologramas captadas digitalmente é realizada numericamente 32. Portanto, em comparação com a microscopia de campo claro, contraste de fase Zernike e ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Faekah Gohar pela revisão do manuscrito. Agradecemos a Sonja Dufentester e Elke Weber pela assistência técnica especializada.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes
Azoximetano (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaFrasco de cultura celular A5486
Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha658170
Costar StripetteCorning Inc., Nova York, EUA4488
Sulfato de dextrano de sódio (DSS)TdB Consulta, Uppsala, SuéciaDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - ÁustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaSPR3196
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Bélgica352070
Isopentano (2-metilbutano)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaM32631-1L
Azul de metilenoMerck, Darmstadt, Alemanha1159430025
Mitomicina CSigma - Aldrich, Deisenhofen, AlemanhaM4287
Lâminas de microscópioG. Menzel, Braunschweig, AlemanhaJ1800AMNZ
Composto O.C.T. Tissue Tek                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Holanda4583
Pen/Strep/Anfotericina BLonza, Verviers, Bélgica1558
Solução salina tamponada com fosfato, PBSLonza, Verviers, Bélgica4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Bélgica3626
Cloreto de sódio 0,9%Braun, Melsungen, Alemanha5/12211095/0411
Dieta padrãoAltromin, Lage, Alemanha1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Holanda4566
Tripsina EDTALonza, Verviers, Bélgica7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Alemanha04-0002 
  µ-Prato 35 mm com inserto de cultura, highibidi GmbH, Munique, Alemanha81176
DIC Tampa para µ-pratos, com inserto de vidroibidi GmbH, Munique, Alemanha80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, EUA46320
Microscópio holográfico digital
ComponenteModeloEmpresa
Microscópio invertidoiMICTill Photonics, Graefelfing, Alemanha
Bússola a laser 315MCoherent GmbH, Luebeck, Alemanha
Lente de microscópioZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Goettingen, Alemanha
Câmera CCDDMK 41BF02The Imaging Source, Bremen, Alemanha

Referências

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  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
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  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144(2011).
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