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Artigo de método

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

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DOI:

10.3791/54467

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30 de setembro de 2016

 , 
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology, 2Department of Biomolecular Sciences, Weizmann Institute of Science

Neste artigo

Resumo

as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Resumo

As proteínas de ligação ao RNA (RBPs) desempenham papéis importantes em todos os aspectos do metabolismo e regulação do RNA. Sua identificação é um grande desafio na biologia moderna. Apenas alguns métodos in vitro e in vivo permitem a identificação de RBPs associados a um mRNA alvo específico. No entanto, suas principais limitações são a identificação de RBPs em ambiente não celular (in vitro) ou o isolamento de baixa eficiência do RNA de interesse (in vivo). Uma metodologia de purificação e identificação de proteínas de ligação a RNA (RaPID) foi projetada para superar essas limitações em leveduras e permitir o isolamento eficiente de proteínas associadas in vivo. Para conseguir isso, o RNA de interesse é marcado com alças MS2 e co-expresso com uma proteína de fusão de uma proteína de ligação a MS2 e uma proteína de ligação à estreptavidina (SBP). As células são então submetidas a reticulação e lisadas, e os complexos são isolados através de grânulos de estreptavidina. As proteínas que co-purificam com o RNA marcado podem então ser determinadas por espectrometria de massa. Recentemente, usamos este protocolo para identificar novas proteínas associadas ao mRNA PMP1 associado ao ER. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado do RaPID e discutimos algumas de suas limitações e vantagens.

Introdução

Proteínas de ligação a ARN (RBPs) representar cerca de 10% de S. proteínas cerevisiae 1,2 e cerca de 15% de proteínas de mamífero 3-5. Eles estão envolvidos em muitos processos celulares, tais como processamento de mRNA pós-transcricional e regulação, tradução, biogênese do ribossomo, tRNA aminoacila�o e modificação, a remodelação da cromatina, e muito mais. Um subgrupo importante de RBPs é as proteínas de ligação ao ARNm (mRNPs) 6,7. No decurso da maturação do mRNA, diferentes RBPs ligar a transcrição e mediar a transformação nuclear, exportação para fora do núcleo, a localização celular, tradução e degradação 6-8. Assim, o conjunto distinto de RBPs ligados a um transcrito particular, a qualquer ponto de tempo determina o seu processamento e em última análise o seu destino.

A identificação de RBPs associados a um mRNA poderia melhorar significativamente a nossa compreensão dos processos subjacentes à sua regulação pós-transcricional. Diverse genética, Métodos microscópicos, bioquímicos e de bioinformática têm sido utilizados para identificar proteínas envolvidas na regulação do ARNm (revisto em 9-11). No entanto, apenas alguns desses métodos permitem a identificação de proteínas associadas a um ARNm alvo particular. Digno de nota é o sistema híbrido de levedura Três (Y3H), que utiliza o mRNA de interesse como isca para pesquisar uma biblioteca de expressão em células de levedura. Os clones positivos são observados geralmente através de uma selecção de crescimento ou repórter expressão 12-14. A principal vantagem deste método é o grande número de proteínas que podem ser digitalizados num ambiente celular e a capacidade para medir a força da interacção RNA-proteína. Desvantagens incluem o número relativamente grande de resultados falsos positivos devido à ligação não específica, eo alto potencial de resultados falsos negativos devido, em parte, a misfolding da presa proteína de fusão ou o RNA isca.

Uma alternativa à abordagem genética é purifi afinidadecatião de ARN com as suas proteínas associadas. Poli A contendo ARNm pode ser isolado através da utilização de colunas de oligo dT, e as suas proteínas associadas são detectados por espectrometria de massa. A interacção RNA-proteína é conservado no seu contexto celular por reticulação, o que faz com que as ligações covalentes de curto alcance. A utilização da coluna de oligo dT proporciona uma visão global de todo o proteoma que está associado com qualquer poli A de mRNA contendo 3,5,15. No entanto, este não fornece uma lista de proteínas que estão associadas com um ARNm específico. Muito poucos métodos estão disponíveis para realizar uma tal identificação. O método implica a transfecção PAR de ácido nucleico com complementaridade com o mRNA alvo 16,17. O ácido nucleico está também ligado a um péptido, o que permite a reticulação de RBPs em estreita proximidade ao local de interacção. Após a reticulação, o ácido nucleico RBP-péptido pode ser isolado e submetido a análise proteómica. Recentemente, uma metodologia baseada na aptâmero eraaplicado com sucesso a extractos de linhas de células de mamíferos 18. Um aptâmero de ARN com afinidade melhorada para estreptavidina e foi desenvolvido fundido com uma sequência de interesse (elemento ricos em AU (ARE), neste caso). O ARN aptâmero-ARE foi ligado a esferas de estreptavidina e misturados com o lisado celular. As proteínas associadas a que a sequência são foram purificados e identificados por espectrometria de massa (MS). Embora este método detectado associações que ocorrem fora das definições celulares (isto é, in vitro), é susceptível de ser modificado no futuro, de modo a introduzir os aptâmeros no genoma e, assim, permitir o isolamento de proteínas associadas com o ARNm enquanto que na meio celular (isto é, in vivo). Em leveduras, onde manipulações genéticas estão bem estabelecidos, o método rápido (desenvolvido no laboratório do Prof. Jeff Gerst) fornece uma visão in vivo associações 19. Rápida combina o específico e forte ligação da proteína de revestimento de MS2 (MS2-CP) para a sequência de ARN MS2, e do domínio de ligação a estreptavidina (SBP) a estreptavidina esferas conjugadas. Isso permite a purificação eficiente de mRNAs MS2-marcadas através de contas de estreptavidina. Além disso, a expressão de 12 cópias de MS2 laços permite até seis MS2-CPS de se ligar simultaneamente para o RNA e aumentar a eficiência do seu isolamento. Este protocolo foi, portanto, sugerida para permitir a identificação de novas proteínas associadas à ARNm uma vez que as amostras eluídas são sujeitas a análise por espectrometria de massa proteómica.

Recentemente, utilizou rápido para identificar novas proteínas associadas com a levedura Pmp1 ARNm 20. Pmp1 ARNm foi anteriormente mostrado para ser associado com a membrana do RE e do seu 3 'não traduzida (UTR) foi encontrado para ser um dos principais determinantes nesta associação 21. Assim, RBPs que se ligam Pmp1 UTR 3 'são susceptíveis de desempenhar um papel importante na sua localização. Rápida seguida de cromatografia líquiday-espectrometria de massa / espectrometria de massa (LC-MS / MS) resultou na identificação de várias novas proteínas que interagem com Pmp1 20. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado da metodologia rápida, controles importantes que precisam ser feitas, e dicas técnicas que podem melhorar o rendimento e especificidade.

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Protocolo

Nota: Inserir uma sequência que consiste em 12 locais de ligação MS2 (MS2 malhas; MS2L) no locus genómico desejado, geralmente entre a grelha de leitura aberta (ORF) e a 3 'UTR. Um protocolo detalhado para essa integração é fornecido em outros lugares 22. Verifique a inserção correta e expressão por PCR, análise de Northern ou RT-PCR 20,23. É importante verificar que a integração não interferiu com a síntese do 3 'UTR. Além disso, um plasmídeo que expressa MS2 CP-fundido com PAS sob a expressão de um promotor indutível (depleção de metionina) também deve ser introduzido nas células 24. Uma estirpe idêntica, excluindo os loops MS12 introduzidas, deve ser utilizado como um controlo para a detecção de sinais não específicos.

1. purificação rápida

  1. Cresça 500 ml de células de levedura (250-1,000 usar ml de células de levedura de acordo com o nível da expressão do gene de interesse) que expressam ARNm de MS2-tagged 20 eProteína de fusão MS2-CP-GFP-PAS 24 a DO600 0,8-1,0 a 30 ° C no meio de crescimento apropriado (por exemplo, dextrose sintética (SD) meio selectivo).
  2. células Centrifugar a 3000 x g durante 4 min a RT e desprezar o sobrenadante.
  3. Lavar células em 1x tampão de fosfatos salino (PBS), de centrifugação, como anteriormente (passo 1.2), ressuspender em um volume igual (passo 1.1) de SD sem metionina, e incubar durante 45 - 60 min a 30 ° C para induzir a expressão da MS2 -CP-GFP-PAS proteína de fusão.
    Nota: tempo de indução mais longos podem causar agregação de GFP.
  4. Retiradas 10 ml de células e extrair RNA a partir desta amostra usando o método simples "fenol quente" 25. Atenção: O fenol é altamente tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança.
    Nota: Este ARN é uma boa referência para a qualidade do ARN isolado (Figura 1A).
  5. Por 500 ml células, adicionar 1,35 ml de 37% de formaldeído para a final concentration de 0,1% para reticular os complexos de ARN-proteína. Continue incubação a 30 o C por 10 min. Atenção: O formaldeído é altamente tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança.
  6. Adicionar 26,5 ml de 2,5 M de glicina para uma concentração final de 0,125 M e incuba-se durante 3 minutos para parar a reticulação. A partir deste passo, colocar tudo em gelo para minimizar a degradação do RNA.
  7. Células centrifugar a 3000 xg durante 4 min a 4 ° C e lavar com 45 ml frio 1x PBS.
  8. Ressuspender as células em 1 ml de tampão de lise rápida por 100 ml de cultura de células inicial.
  9. Dividido em alíquotas de 500 mL em tubos de microcentrífuga com tampa de rosca e adicione ~ 400 mg de contas de vidro refrigerada a cada alíquota (cerca de um total de 0,2 ml tubo de PCR).
  10. Lisar as células em um grânulo batedor durante 3 min. imediatamente colocar o lisado em gelo.
    Nota: lise celular lançamentos RNases celulares, que são a principal causa de degradação do RNA. tampão de lise rápida contém uma elevada concentração de RNase inhibitors, tais como a heparina não específica inibidor de RNase e inibidores específicos. Trabalhando rapidamente e manter tudo frio também é recomendado.
  11. Transferir o lisado para novos tubos. Pierce um pequeno orifício na parte inferior de cada tubo de microcentrífuga com uma agulha quente (0,8 mm x 40 mm) e colocar os tubos de microcentrífuga de topo dos tubos de 15 ml. Utilizar a cabeça de uma seringa de 5 ml, como um adaptador entre os tubos de microcentrífuga e os tubos de 15 ml. Centrifugar a montagem de tubos a 3000 xg durante 1 min a 4 o C.
  12. Transferir o fluxo através do tubo de 15 mL para um novo tubo de 1,5 ml e centrifugar a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar os detritos celulares.
  13. sobrenadantes de piscina de todos os tubos de 1,5 ml em um único tubo de 15 ml, e reserve 1/50 e 1/100 do volume do lisado para o RNA e isolamento de proteínas, respectivamente.
    Nota: Estes irão servir como as amostras de "input" para posterior análise (Figura 1).
  14. Adicionar 300 ug de avidina por 500 ml de ie cultura de levedura nitial incubar durante 30 minutos (este pode ser reduzido para 10 min) a 4 ° C sob rolamento constante (10 rpm).
    Nota: Os blocos de avidina e biotina proteínas biotiniladas se liguem às esferas de estreptavidina.
  15. A pré-lavagem as esferas de estreptavidina antes da incubação com lisado de células.
    1. Transferir cerca de 300 ul de estreptavidina grânulos lama para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e remover o sobrenadante superior. Isto irá resultar em 250 ul de pérolas. Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão de lise rápida. Centrifugar as esferas de estreptavidina a 660 xg durante 2 min a 4 ° C entre cada passo.
    2. Bloquear as pérolas por incubação durante 1 h com 0,5 ml de tampão de lise rápida, a 0,5 ml de 10 mg / ml de BSA e 10 uL de 10 mg / ml de ARNt de levedura. Grânulos podem ser deixados O / N em solução de bloqueio a 4 ° C com rotação, se necessário.
    3. Lavar duas vezes com 1 ml de tampão de lise rápida.
      Nota: As esferas magnéticas pode também ser utilizado para reduzir o tempo e background. Estes, no entanto, tem menor capacidade do que esferas de sepharose.
  16. Adicionar 250 ul das esferas de estreptavidina pré-lavado para o lisado contendo avidina (a partir do passo de 1,14) e incubar 1 h a 4 ° C com rotação constante (10 rpm).
    Nota: Este tempo de incubação é um compromisso entre a prestação de tempo de ligação suficiente e minimizando as chances de degradação do RNA.
  17. Centrifuga-se a 660 xg durante 2 min a 4 ° C para eliminar as esferas de estreptavidina e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml. Separe 1/50 e 1/100 do volume do lisado para o isolamento de ARN e proteína, respectivamente.
    Nota: Estas serão as amostras não ligadas "".
  18. Lavam-se as esferas com 1 ml de tampão de lise rápida, agitar, transferir para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, e centrifuga-se tal como no passo 1.17. Repita este passo três vezes.
  19. Lavam-se as esferas com 1 ml de tampão de lavagem rápida, e esta gire tempo (10 rpm) durante 5 min a 4 ° C. Repita esta etapa duas vezes.
  20. Lavam-se as esferas com 1 ml de PBS 1x e centrifugação tal como acima.
  21. Lavam-se as esferas de novo com 120 ul de PBS 1x. Centrifugar como acima, e tomar todo o sobrenadante para o ARN e a extracção de proteínas como a amostra de "lavagem".
    Nota: Esta última amostra de lavagem indica o rigor das lavagens e deve ser do mesmo volume que a amostra de eluição. Isto irá simplificar o processamento e carregamento em ensaios subsequentes.
  22. Para eluir o ARN e proteínas associadas ao ARN a partir da coluna, adicionar 120 ul de biotina 6 mM em PBS 1x e incubar durante 45 min a 4 ° C com rotação constante (10 rpm).
  23. Centrifugar as esferas como anteriormente e transferir o material fluido para um novo tubo de 1,5 mL. Girar a amostra eluiu-se novamente e transferir a fase superior para um novo tubo de 1,5 mL para garantir que não haja transição de grânulos.
  24. Colher amostras para RNA ou extração de proteínas.
    Nota: O volume ocupado deve depender do nível seguinte ensaio e a expressão do ARN ou proteína de interesse. Como orientação, para análise do Norte 26, tomar 80% da amostra, por Western blot 23,27 ou RT-PCR 28, tome 20%, e por espectrometria de massa 29 para descobrir novas proteínas, tome toda a amostra.

2. Extracção de ARN

  1. Adicionar um volume igual de tampão de reticulação 2x Reversão e incubar durante 45 min a 65 ° C. Continue diretamente para a extração de RNA.
    Nota: A reversão de reticulação contém tampão de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), o que melhora de forma significativa a extracção de RNA 20.
  2. Use o fenol padrão: Método de clorofórmio 26 para extrair RNA do "input" e amostras "não ligados" (passos de 1,13 e 1,17).
    Nota: Estas amostras contêm uma grande quantidade de heparina o inibidor de RNase, que pode inibir a ensaios utilizando subsequentes Transcriptase- reversa (RT) (por exemplo, RT-PCR), por conseguinte, LiCl precipitação 30 é aconselhada para removê-lo. O WAsh "e" "amostras de eluição (passos 1.21 e 1.24) contêm pequenas quantidades de ARN e são precipitados através dos seguintes passos.
  3. Adicionar um volume igual de guanidínio 8M-HCI (GuHCI) e dois volumes de etanol a 100% à "lavagem" e amostras de "eluição". Incubar a -80 ° C durante pelo menos 2 h.
    Nota: guanidínio será eficiente desnaturar as proteínas e, assim, inibir as RNases e proteases na amostra.
  4. Centrifuga-se a 20000 xg, a 4 ° C durante 30 min e desprezar o sobrenadante. Lava-se a pastilha com etanol frio a 80% e centrifuga-se novamente a 20000 xg, 4 ° C durante 15 min.
  5. Dissolver o sedimento RNA em 400 mL de RNase água livre e precipitar novamente para remover qualquer sobra GuHCl ou outros contaminantes. Adicionar 40 ul de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 800 ul de etanol a 100%, incuba-se a -20 ° C durante pelo menos 1 h.
  6. Centrífuga e lavar como no passo 2.4 e remover todo o etanol com uma ponta de 10 mL. Ressuspender o Pell RNAet em 10 mL RNase água livre. Tome cuidado extra como o sedimento RNA normalmente não é visível.
    Nota: As amostras podem ser utilizadas para a análise de Northern como descrito em 23 (Figura 1).

3. Proteína Preparação para Western Blot ou Análise Espectrometria de Massa

  1. Adicione 1/3 do volume de tampão de amostra de Laemmli 4x (LSB) para amostras de proteína e incubar 45 min a 65 ° C para inverter a ligação cruzada de proteínas e RNA.
    Nota: As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C.
  2. Proteínas executado em um gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) 31. Ajustar a percentagem de gel de acordo com o tamanho das proteínas a ser analisada.
    Nota: gel de acrilamida a 10% dá uma vasta gama de separação e está bem como uma primeira aproximação.
  3. Transferir as proteínas para a membrana como na análise de imunomarcação padrão 27 para controlo da eficiência de isolamento (Figura 1C). Manchar ou com Coomassie Blue R250 ou prata mancha antes da análise de espectrometria de massa.
    Nota: mancha de prata é a escolha preferida, pois é mais sensível e permite uma melhor detecção (Figura 1B). A coloração pode ser feito com qualquer soluções preparadas manualmente ou kits comerciais. O tempo de incubação do gel na solução final corante deve ser determinada experimentalmente. Longo incubação pode revelar proteínas abundantes de baixo, mas pode causar proteínas altamente expressos tais como MS2-CP-PAS-GFP para ser mais manchado e podem mascarar proteínas circundantes na sua vizinhança. Além disso, pode ocorrer um fundo alta. Siga a reação com cuidado, e adicionar solução de parada no momento apropriado.
  4. Cortar bandas do gel e transferi-los para tubos de 1,5 ml. Armazenar as amostras a -20 ° C, ou enviar para a extracção de proteína e digestão com tripsina seguida por análise por LC-MS / MS 32.
  5. Como uma abordagem alternativa para proteómica exclui a etapa de separação em gel, digerir material eluído a partir do passo 1.24 em tãolução utilizando tripsina e sujeita a análise por LC-MS / MS 33.
    Nota: Omitir a separação SDS-PAGE simplifica o protocolo e aumenta o rendimento. No entanto, as amostras podem conter vestígios de detergente NP-40, que inibe a análise de espectrometria de massa. Para ultrapassar este problema, execute os seguintes passos:
    1. Executar proteína em SDS-PAGE a 31 por 10 - 15 min.
    2. Cortar toda a porção de pista (isto é, onde as proteínas estão localizados).
      Nota: A amostra de proteína pode incluir uma quantidade significativa de proteína-MS2 CP-PAS que podem obscurecer os sinais de proteínas de baixa abundância.

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Resultados

RAPID permite o isolamento de um ARN alvo específico com as suas proteínas associadas. Crítico para o seu sucesso é manter o ARN intacto, tanto quanto possível, obtendo-se assim uma quantidade suficiente de proteínas. Para determinar a eficiência e a qualidade de isolamento de ARN, análise de Northern é realizado (Figura 1A). análise do Norte tem a vantagem de reportar diretamente a eficiência e qualidade dos rápidos. Assim, as quantidades relativas dos produtos de degra...

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Discussão

Vários métodos utilizam o isolamento de ARNm específicos para identificar as suas proteínas associadas 11,34 35. Estes métodos aplicam-se in vitro e in vivo em estratégias para investigar interacções ARN-proteína. Métodos in vitro incubar exogenamente ARN transcrito com lisado celular para capturar RBPs e isolar complexos de RNP 36,37. Uma abordagem eficaz deste tipo foi apresentado recentemente, o que permitiu a identificação de novas proteínas que se ligam um...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin para os seus conselhos úteis na criação do protocolo rápida e fornecendo os plasmídeos necessários. Agradecemos também a Dr. Abigail Atir-Lande por sua ajuda no estabelecimento deste protocolo e Dr. Tamar Ziv do Smoler Proteomics Center for sua ajuda com a análise LC-MS / MS. Agradecemos Prof. TG Kinzy (Rutgers) para o anticorpo YEF3. Este trabalho foi apoiado pela concessão 2011013 do Binacional Science Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
TrissigmaT1503
SDSbio-lab1981232300
DTTsigmaD9779
Fenol ácido (pH 4,3)sigmaP4682
Fenol ácido: Clorofórmio (5: 1, pH 4,3)sigmaP1944
Clorofórmiobio-lab3080521
FormaldeídoFrutarom5551820
GlicinasigmaG7126
NP-40Calbiochem492016
HeparinaSigmaH3393
Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)SigmaP7626
LeupeptinaSigmaL2884
AprotininaSigmaA1153
Inibidor de Tripsina de SojaSigmaT9003
PestatinaSigmaP5318
DNase IPromegaM610A
Ribonuclease  ContasInibidor Takara2313A
SartoriusBBI-85417010.4-0.6mm de diâmetro 
Mini BeadBeaterBioSpecMini BeadBeater 16
GuanidiniumSigmaG4505
AvidinSigmaA9275
Contas de EstreptavidinaGE Healthcare 17-5113-01
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA7906
Levedura tRNASigmaR8508
BiotinaSigmaB4501
Extrato de leveduraBacto288620
peptonaBacto211677
GlicoseSigmaG8270
1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
0,2 M NaOH
4x Tampão de amostra Laemmli (LSB)0,2 M Tris-Hcl pH 6,8, 8% SDS, 0,4 M DTT, 40% glicerol, 0,04% Bromofenol-Azul.
de lise de fenol quente10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS 
3 M Acetato de Sódio pH 5,2
100% e 70% Etanol (EtOH)
RNase Água
RaPID lise tampão20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 5 mg/ml Heparina, 1 mM Ditiotreitol (DTT), 1 mM Fluoreto de Fenilmetilsulfonil (PMSF), 10 µ g/ml de Leupeptina, 10 µ g/ml Aprotinina, 10 µ g/ml Inibidor de Tripsina de Soja, 10 µ g/ml de Pepstatina, 20 U/ml de DNase I, 100 U/ml de Ribonuclease  Inibidor.
de reversão de reticulação100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2% SDS.
de lavagem RaPID20 mM Tris-HCl pH 7.5,  300 mM NaCl, 0.5% NP-40
0.5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus KitBio-Rad 161-0449Para detectar proteínas em géis de poliacrilamida
SD meio seletivo1,7 g/l de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos e sulfato de amônio, 5 g/l de sulfato de amônio, 2% de glicose, 350 mg/l de treonina, 40 mg/l de metionina, 40 mg/l de adenina, 50 mg/l de lisina, 50 mg/l de triptofano, 20 mg/l de histidina, 80 mg/l de leucina, 30 mg/l de tirosina, 40 mg/l de arginina
anti-eEF3 (EF3A, YEF3)Presente de Kinzy TG. (Escola de Medicina Robert Wood Johnson da UMDNJ)1:5.000
Anti GFP anticorpoSanta Cruzsc-83341:3.000
Anti coelho IgG-HRP conjugadoSIGMAA91691:10.000
de Vidro Tampão livre de2x Tampão Tampão

Referências

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