"Fagossomo Encerramento Ensaio" para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Resumo

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

Resumo

A fagocitose é um mecanismo usado por células especializadas para internalizar e eliminar microorganismos ou detritos celulares. Ele se baseia em rearranjos profundos do citoesqueleto de actina que é a força motriz para a extensão da membrana plasmática ao redor da partícula. Além disso, o engolfamento eficiente de material grande depende da exocitose focal dos compartimentos intracelulares. Este processo é altamente dinâmico e vários atores moleculares foram descritos como tendo um papel durante a formação do copo fagocítico. A regulação precisa no tempo e no espaço de todas essas moléculas, no entanto, permanece indefinida. Além disso, a última etapa do fechamento do fagossomo tem sido muito difícil de observar porque a inibição por interferência de RNA ou mutantes negativos dominantes geralmente resulta em formação de copos fagocíticos paralisados.

Montamos uma abordagem experimental dedicada usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) combinada com epifluorescência para monitorar passo a passo a extensão de pseudópodes e suas pontas em um fagossomo crescendo em torno de uma partícula frouxamente ligada a uma lamínula. Este método nos permite observar, com alta resolução, as próprias pontas dos pseudópodes e sua fusão durante o fechamento do fagossomo em células vivas para duas proteínas diferentes marcadas com fluorescência ao mesmo tempo.

Introdução

Fagocitose é uma função de célula grande que começa com o reconhecimento e ligação de material para a superfície receptores, que depois leva à internalização e degradação do material ingerido. Enquanto eucariotas unicelulares como o Dictyostelium discoideum molde e amebas usar fagocitose para a alimentação de bactérias, organismos superiores evoluíram com células profissionais. Os macrófagos ou células dendríticas são a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos em vários tecidos e órgãos, e são cruciais para activar o sistema imunitário adaptativo através de apresentação de antigénio e produção de citocinas ^1-4. Sob certas circunstâncias....

Protocolo

Nota: O plasmídeo utilizado Lifeact-mCherry é um dom tipo de Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, gerada após ^17.

1. Células e Transfecção

Nota: RAW264.7 de macrófagos são crescidas até à sub-confluência em meio completo (meio RPMI (Roswell Instituto Parque Memorial) 1640, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, 50 ^ M β-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina e 10% de FCS ( soro fetal de vitelo)) em uma placa de 100 mm. Eles são transf ectadas com plasmídeos que codificam para proteínas marcadas fluorescentemente por electroporação. Rotineiramente aproximadamente 5-6 x 10 ⁶ células são transfectadas com 20 ug ou 10 ug de plasm....

Resultados

O sistema experimental descrito neste manuscrito está esquematicamente representada na Figura 1. Macrófagos RAW264.7 transfectadas que expressam as proteínas de interesse fundida com uma marcação fluorescente são colocados em contacto com glóbulos vermelhos de ovelha IgG-opsonizado (SRBCs) que eram não-covalentemente fixo sobre a lamela. Os macrófagos pode destacar o SRBC da lamela para afundá-lo. O microscópio utilizado TIRF permite a aquisição concomitante de sinais a .......

Discussão

O protocolo experimental aqui descrito propõe um método inédito para acompanhar em tempo real e em células vivas, com alta resolução, a formação de um fagossomo e, em particular, seu fechamento. Vários aspectos técnicos devem ser discutidos. Em primeiro lugar, o ensaio é muito sensível à temperatura. É muito importante verificar se a câmara de aquecimento está a 37 °C e se todos os meios, dispositivos ou células são mantidos dentro da câmara para evitar mudanças de temperatura que possam prejudicar a eficiência da fagoci.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glóbulos vermelhos anti-ovelha IgG	MP Biomedicals	55806
Soro bovino Albumina fração de choque térmico, pH 7, ≥ 98%	Sigma	A7906
Elevador de células	Corning	3008
Cuvetes 4 mm	Projeto de célula	EP104
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Thermo Fischer Scientific	14190-094
Kit de eletrotampão	Projeto	EB110
100 mm TC-Placa de cultura de células tratada com TC	Corning	353003
Pulsador de células X Gene	Biorad	165-2661
Solução de gentamicina	Sigma	G1397
Pratos com fundo de vidro 35 mm sem revestimento 1.5	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C Case
iMIC	TILL Photonics		Objetiva de imersão em óleo (N 100X, NA1.49), câmara de aquecimento com CO2, uma câmera de detecção de fóton único EMCCD (Electron Dispositivo de Multiplicação de Carga Acoplada) e uma lente 1.5X
Solução de Poli-L-Lisina 0.1%	Sigma	P8920-100ml	Diluição a 0.01% em água
RPMI 1640 médio GLUTAMAX  Suplemento	Life technologies	61870-010
RPMI 1640 médio, sem vermelho de fenol (10 x 500 ml)	Life technologies	11835-105	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs)	Eurobio	DSGMTN00-0Q	Conservado em tampão Alsever a 4 &graus; C antes de usar

à temperatura ambiente de célula