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"Fagossomo Encerramento Ensaio" para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

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DOI:

10.3791/54470

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26 de agosto de 2016

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

Neste artigo

Resumo

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

Resumo

A fagocitose é um mecanismo usado por células especializadas para internalizar e eliminar microorganismos ou detritos celulares. Ele se baseia em rearranjos profundos do citoesqueleto de actina que é a força motriz para a extensão da membrana plasmática ao redor da partícula. Além disso, o engolfamento eficiente de material grande depende da exocitose focal dos compartimentos intracelulares. Este processo é altamente dinâmico e vários atores moleculares foram descritos como tendo um papel durante a formação do copo fagocítico. A regulação precisa no tempo e no espaço de todas essas moléculas, no entanto, permanece indefinida. Além disso, a última etapa do fechamento do fagossomo tem sido muito difícil de observar porque a inibição por interferência de RNA ou mutantes negativos dominantes geralmente resulta em formação de copos fagocíticos paralisados.

Montamos uma abordagem experimental dedicada usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) combinada com epifluorescência para monitorar passo a passo a extensão de pseudópodes e suas pontas em um fagossomo crescendo em torno de uma partícula frouxamente ligada a uma lamínula. Este método nos permite observar, com alta resolução, as próprias pontas dos pseudópodes e sua fusão durante o fechamento do fagossomo em células vivas para duas proteínas diferentes marcadas com fluorescência ao mesmo tempo.

Introdução

Fagocitose é uma função de célula grande que começa com o reconhecimento e ligação de material para a superfície receptores, que depois leva à internalização e degradação do material ingerido. Enquanto eucariotas unicelulares como o Dictyostelium discoideum molde e amebas usar fagocitose para a alimentação de bactérias, organismos superiores evoluíram com células profissionais. Os macrófagos ou células dendríticas são a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos em vários tecidos e órgãos, e são cruciais para activar o sistema imunitário adaptativo através de apresentação de antigénio e produção de citocinas 1-4. Sob certas circunstâncias a fagocitose pode ser realizada por células fagocíticas não profissionais, por exemplo, células endoteliais e epiteliais. Este processo é importante para manter a homeostase durante o desenvolvimento e na vida adulta de renovação do tecido normal e de remodelação. fagócitos Finalmente, especializados, tais como células de Sertoli nos testículos ou da retinanas células epiteliais pigmentares são extremamente potentes fagócitos 5.

A formação de um fagossoma onde a degradação de microrganismos ou fragmentos celulares ocorre começa com o agrupamento de receptores fagocíticos na superfície da célula fagocítica. eventos de sinalização a jusante seguintes agrupamento de receptores opsónicos, tais como receptores Fc (FcR) ou receptores de complemento (CRS) têm sido bem caracterizadas. No entanto, também existem numerosas receptores não-opsónicos incluindo receptores semelhantes a Toll (TLRs), lectinas, receptores de manose e receptores scavenger. Estes receptores reconhecem determinantes sobre a superfície das partículas, tais como resíduos de manose ou fucose, fosfatidilserina, e lipopolissacarídeos 1,6-9.

Agente patogénico ou fragmentos de células de reconhecimento envolve a ligação ao agrupamento e de vários tipos de receptores de fagocitária, que, em seguida, conduzir a uma intensa e transiente remodelação da actina. Em exocitose paralelo, focal de compartmen intracelularTS contribui para a libertação da tensão da membrana e é importante para a fagocitose eficiente de grandes partículas. Os eventos de sinalização que levam à deformação de polimerização e membrana actina foram dissecados em modelos experimentais que desencadearam um único receptor fagocítica. Durante a fagocitose FcR-mediada, há intensa polimerização de actina, que é regulada por pequenas GTPases (Rac, Cdc42). Entre os seus efectores a jusante, a proteína síndroma de Wiskott-Aldrich (WASP) conduz à activação da proteína relacionada com a actina 2/3 complexo (Arp2 / 3) que nucleia 1,2,4,10 filamentos de actina. A produção local de fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato (PI (4,5) P 2) é crucial para a polimerização de actina inicial que dirige a formação pseudópode. Sua conversão em PI (3,4,5) P 3 é necessário para a extensão pseudopod e fechamento fagossomo 11. Diversas vias de contribuir para o desaparecimento de PI (4,5) P 2. Em primeiro lugar destacamento de fosfatidilinositol kina fosfatoses (PIPKIs) do PI prisões fagosoma (4,5) P 2 síntese. Em segundo lugar, pode ser fosforilada e consumido por PI3K de classe I-quinases (PI3K) e convertido em PI (3,4,5) P 3 12. Um papel para fosfatases e fosfolipases também tem sido implicado em PI (4,5) P 2 hidrólise e remoção de F-actina durante a fagocitose em células de mamífero e em Dictyostelium 13,14. O δ fosfolipase C (PLC) hidrolisa PI (4,5) P 2 em diacilglicerol e fosfato de tris-inositol-1,4,5-. O OCRL PI (4,5) P 2 e PI (3,4,5) P 3 fosfatase (síndrome oculocerebrorrenal de Lowe) também tem sido implicado na formação do fagossoma. formação local preciso da F-actina e sua despolimerização é estreitamente regulada no espaço e no tempo e temos demonstrado que o recrutamento de compartimentos intracelulares é importante para entregar localmente a fosfatase OCRL, contribuindo assim para a despolimerização de actina locais na base do copo fagocitária 13,15. Para isso, utilizou-se o conjunto experimental descrita aqui.

Os jogadores mecanismo e moleculares necessários para o encerramento fagossomo e cisão da membrana permanecem pouco conhecidos devido às dificuldades em visualizar e monitorar o local de encerramento fagossomo. Até recentemente, a fagocitose foi observado em células fixas ou vivos que internalizam partículas na face dorsal ou em seus lados, tornando a visualização em tempo útil do local de fechamento fagossomo difícil. Além disso, métodos de fixação pode causar retração de membranas e enviesar os resultados na extensão pseudópodos e encerramento. Em contrapartida, o ensaio que criámos e descrever aqui nos permite visualizar a extensão pseudopod ea etapa de encerramento da fagocitose em células vivas 13, com base em microscopia interna total reflexão (TIRFM) 16. Esta técnica utiliza óptica uma onda evanescente para excitar fluoróforos numa zona fina na interface entre um modo transparentetampa (lamela) e um (meio de cultura de células) de líquido. A espessura da profundidade de excitação é de cerca de 100 nm a partir da superfície sólida, permitindo a visualização de eventos moleculares perto da membrana plasmática. TIRFM permite uma elevada relação de sinal-para-fundo, e limita a fluorescência para fora de foco recolhida e a citotoxicidade devido à iluminação de células.

Tomando vantagem de TIRFM, foi desenvolvido o "ensaio de encerramento fagossoma" em que lamelas são activados com poli-lisina e, em seguida, revestida com as células vermelhas do sangue de IgG-IgG-opsonizados (SRBCs). Macrófagos que expressam proteínas transitoriamente fluorescente etiquetado de interesse são, então, autorizado a engolir as IgG SRBCs. Enquanto as células separar as partículas que são alvo não-ligado de forma covalente à superfície do vidro, as pontas dos pseudopods podem ser observadas e registadas no modo de TIRF. aquisições TIRF são combinados com aquisições no modo de epifluorescência, após o deslocamento da uM fase 3 acima, o que permite a visualization da base do copo fagocítica. A adição de drogas farmacológicas, tais como os da inibição da actina ou dinamina durante o processo também é possível, para dissecar ainda mais o processo, a nível molecular.

O protocolo descrito em pormenor aqui é para uma linha celular de macrófagos de murídeo e RAW264.7 partículas opsonizadas, mas virtualmente, ele pode ser adaptado a qualquer outra célula fagocítica e com outros objectivos, tais como esferas. Este método permitirá uma melhor caracterização da regulação no tempo e no espaço dos jogadores moleculares envolvidos na extensão pseudopod e fechamento fagossoma durante vários processos fagocíticas.

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Protocolo

Nota: O plasmídeo utilizado Lifeact-mCherry é um dom tipo de Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, gerada após 17.

1. Células e Transfecção

Nota: RAW264.7 de macrófagos são crescidas até à sub-confluência em meio completo (meio RPMI (Roswell Instituto Parque Memorial) 1640, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, 50 ^ M β-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina e 10% de FCS ( soro fetal de vitelo)) em uma placa de 100 mm. Eles são transf ectadas com plasmídeos que codificam para proteínas marcadas fluorescentemente por electroporação. Rotineiramente aproximadamente 5-6 x 10 6 células são transfectadas com 20 ug ou 10 ug de plasmídeo para cada transfecção e co-transfecção, respectivamente. Note-se que outros meios de transfecção à base de electroporação ou lipofecção podem ser utilizados como abordagens alternativas.

  1. Raspar as células com um levantador de células e ressuspender-los em 10 ml de meio de cultura por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
  2. Centrifugar asuspensão de células 300 x g, 5 min a RT no rotor de ângulo oscilante.
  3. Pré-aqueça 10 ml de meio completo suplementado com 10 ug / ml de gentamicina, a 37 ° C.
  4. A seguir à centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de "tampão de lavagem A" a partir do kit de electroporação.
  5. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg, 5 min a temperatura ambiente no rotor de ângulo oscilante.
  6. Enquanto isso preparar a mistura de ADN à temperatura ambiente: 120 ul de 2x tampão B, 20 ^ g de ADN plasmidico que codifica para a proteína de interesse, qsp 240 mL de H 2 O.
  7. A seguir à centrifugação, eliminar todo o sobrenadante.
  8. Ressuspender o sedimento de células na mistura de ADN e transferência em cuvetes de electroporação de 4 mm.
  9. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
  10. Electroporate a 250 V, 900 uF.
  11. Imediatamente ressuspender as células no pré-aquecido (37 ° C) de meio completo suplementado com gentamicina e a chapam em uma placa de 100 mm.
  12. Incubam-se as células transfectadas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2.
  13. Na manhã seguinte, substituir o meio completo com 10 ml de meio de microscopia isento de soro (RPMI 1640 sem vermelho de fenol, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 50 uM β-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina).

2. Opsonização de glóbulos vermelhos

Nota: Como um modelo de meta de partículas para os macrófagos, células do sangue ovelhas vermelhas (SRBCs) são utilizados. Normalmente, cerca de 7 x 10 6 SRBCs por 35 milímetros prato fundo de vidro é usado.

  1. Lavar os SRBCs com 100 ul de 1x PBS (fosfato salino tamponado) /0.1% de BSA (albumina de soro bovino) e centrifugação (600 xg, 4 min).
  2. A seguir à centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender as SRBCs em 100 ul de 1x PBS / 0,1% BSA e centrifugação (600 xg, 4 min).
  3. A seguir à centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender as SRBCs em 1X PBS / BSA a 0,1% com IgG de coelho anti-SRBCsna sub-aglutinar concentração. Utilizar 500 ul de solução contendo anticorpo / 5 ul de SRBCs.
    Nota: A concentração sub-aglutinação de anticorpos corresponde à concentração mais baixa que não induziu aglutinação detectada como a formação de uma rede. Em geral, a concentração sub-aglutinação é de 8,2 ug / ml.
    1. Determinar a concentração de anti-IgG de SRBCs necessários para opsonizar os SRBCs por um teste de neutralização. Serialmente dilua a anti-IgG de SRBCs (estoque a 13,1 mg / ml) entre 1/50 - 1 / 25.600 de uma microplaca. Adicionar 2 x 10 6 SRBCs em cada poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante várias horas.
  4. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos com rotação lenta.
  5. Após duas lavagens em 1X PBS / BSA a 0,1% como descrito acima, ressuspender os SRBCs-IgG (IgG-opsonizadas SRBCs) em meio isento de soro microscopia pré-aquecido (2 ml / prato).

3. Revestimento de poli-lisina de lamelas

  1. Enquanto isso, Tratar pratos 35 milímetros de vidro de fundo com 2 ml de 0,01% de poli-L-lisina durante 30 min à temperatura ambiente.
  2. Lavar os pratos duas vezes com 2 ml de PBS 1x.

4. Fixação não-covalente de SRBCs em pratos com fundo de vidro

  1. Despeje 2 ml de SRBCs suspensão por 35 milímetros prato de vidro de fundo.
  2. Centrifugar com um rotor girando a 500 xg durante 2 min para 35 milímetros de vidro pratos de fundo.
  3. Remover o sobrenadante e lavar uma vez com 2 ml de PBS 1X / BSA a 10%.
  4. Incubam-se as partículas durante 30 min com 2 ml de PBS 1X / BSA a 10% por placa de Petri.
  5. Lavar os pratos três vezes com 2 ml de PBS 1x.
  6. Substituir 1x PBS com 2 ml de meio pré-aquecido (37 ° C) sem soro microscopia.

5. A fagocitose visualizado por TIRFM

  1. Microscópio
    Nota: TIRFM foi realizada usando um microscópio equipado com uma objectiva de imersão em óleo (N 100X, NA1.49), uma câmara de aquecimento com CO 2, e duas cantele câmeras de detecção de fótons EMCCD (Electron Multiplicando Charge Coupled Device) acoplado com uma lente de 1.5X.
    1. O dia antes da sessão de microscópio TIRF, ligar a câmara de aquecimento a 37 ° C para permitir um aquecimento homogéneo da platina do microscópio.
  2. Determinação ângulo crítico
    Nota: software ImageJ Color Profiler é usado para processar fluxos de imagem TIRF.
    1. Coloque um 35 milímetros prato de vidro de fundo contendo SRBC opsonizado com meio de microscopia sem soro sob o microscópio.
    2. Raspar as células e ressuspender-los na forma antes de os adicionar (100 - 500 ul) no prato.
    3. Utilizar o software "Aquisição vivo" para controlar o microscópio e executar de excitação com um 491 nm e / ou um laser de 561 nm para identificar as células que expressam as proteínas marcadas fluorescentemente.
    4. Identificar uma célula que expressa as proteínas marcadas fluorescentemente.
    5. Coloque-o no meio do campo e adquirir 500 imas idades em um comprimento de onda de excitação, com ângulos diferentes a partir de 0º até 5º, com um incremento de 0.01º (Figura 2A). Os ângulos são automaticamente alterada pelo sistema de microscópio.
    6. Determinar o ângulo crítico permitindo que a luz incidente seja totalmente reflectida na interface vidro / médio e gerar a onda evanescente. Usando o software ImageJ Color Profiler, abra a sequência de imagens, clicando em "Arquivo", "Abrir" e selecione o arquivo.
    7. Seleccionar uma região de interesse (ROI), com a ferramenta rectangular, na célula com uma fluorescência uniforme (Figura 2B amarelo 1).
    8. Traçar o "perfil do eixo Z" significa intensidade de fluorescência medida no ROI com a função dos ângulos no eixo x, clicando na guia "Imagem", "Pilhas" no menu suspenso e "Plot-eixo Z perfil" para baixo (Figura 2B vermelho 2).
      Nota: O ângulo crítico é o ângulo que conduz à mafluorescência ximum antes de uma queda acentuada na fluorescência.
    9. Usar qualquer valor de ângulo sobre o eixo x superior ao ângulo crítico durante a sessão de microscopia para obter um sinal TIRF como exemplo 2.00 (Figura 2C).
  3. aquisições
    1. Usando o software vivo Aquisição, configurar os parâmetros de aquisição com o módulo "Protocolo Editor" (Figura 3A).
      1. Criar um protocolo com um "loop" compreendendo "Canais Multi" aquisição para adquirir sinal fluorescente a partir de proteínas de interesse na região de TIRF. Introduzir o ângulo TIRF (por exemplo 2,00), o tempo de exposição (por exemplo, 50 ms) e a intensidade do laser (por exemplo, 50%) (Figura 3B 1).
      2. Introduzir um "movimento Z" da mm objectivo dos 3 acima da região TIRF para obter a aquisição de sinal na epifluorescência com o "Canais Multi" ferramenta. Insira um ângulo abaixo tele ângulo crítico (por exemplo 1,00), o tempo de exposição (50 ms) e a intensidade do laser (50%) (Figura 3B, 2 e 3).
      3. Em seguida adicione um "z move" da mm objectiva 3 abaixo, para retornar na região de TIRF (Figura 3B 4). Adicionar um "instantâneo" da célula em LED (Light-Emitting Diode) (Figura 3B 5) luz brilhante.
    2. Encontrar uma célula de interesse, com um nível moderado de expressão de proteína marcada com fluorescência que inicia a fagocitose de SRBC por membrana plasmática que se estende em torno da partícula.
    3. Coloque-o no meio do campo.
    4. Iniciar a transmissão de aquisição de 500 - 1000 quadros. Na aba "contagem de loop", digite "750 frames" (Figura 3B 1).
      Nota: software ImageJ Color Profiler é usado para processar fluxos de imagem TIRF.
    5. Abra as imagens da sequência de programa Image J clicando"Arquivo", "Abrir" e escolher o arquivo.
    6. Separar os canais clicando na guia "Imagem", "Hyperstacks" no menu suspenso e em "Stack para hyperstack" função. Conclua a janela apareceu: Ordem: xyctz; Channel (c): número de canais (ex: "2" se você tem dois fluorocromos); Slices (z): número de fatias em eixo z (ex: "1" se não há movimento no eixo Z); Frames (t): número de imagens divididas por número de canais; Modo de exibição: escala de cinza.
      Nota: Duas sequências de imagem separados são gerados, correspondendo aos dois canais diferentes.

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Resultados

O sistema experimental descrito neste manuscrito está esquematicamente representada na Figura 1. Macrófagos RAW264.7 transfectadas que expressam as proteínas de interesse fundida com uma marcação fluorescente são colocados em contacto com glóbulos vermelhos de ovelha IgG-opsonizado (SRBCs) que eram não-covalentemente fixo sobre a lamela. Os macrófagos pode destacar o SRBC da lamela para afundá-lo. O microscópio utilizado TIRF permite a aquisição concomitante de sinais a ...

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Discussão

O protocolo experimental aqui descrito propõe um método inédito para acompanhar em tempo real e em células vivas, com alta resolução, a formação de um fagossomo e, em particular, seu fechamento. Vários aspectos técnicos devem ser discutidos. Em primeiro lugar, o ensaio é muito sensível à temperatura. É muito importante verificar se a câmara de aquecimento está a 37 °C e se todos os meios, dispositivos ou células são mantidos dentro da câmara para evitar mudanças de temperatura que possam prejudicar a eficiência da fagoci...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, França) pelas discussões iniciais sobre a abordagem experimental e ao Dr. Jamil Jubrail pela leitura do manuscrito. Nadège Kambou e Susanna Borreill são reconhecidas por realizarem experimentos com o método em nosso laboratório. Este trabalho foi apoiado por bolsas do CNRS (Programa ATIP), Ville de Paris e Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 incluindo uma bolsa de doutorado para FMA) para FN, e Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales" (ANRS), incluindo uma bolsa de doutorado para JM.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Glóbulos vermelhos anti-ovelha IgGMP Biomedicals55806
Soro bovino Albumina fração de choque térmico, pH 7, ≥ 98% SigmaA7906
Elevador de célulasCorning3008
Cuvetes 4 mmProjeto de célulaEP104
DPBS, sem cálcio, sem magnésioThermo Fischer Scientific14190-094
Kit de eletrotampãoProjetoEB110
100 mm TC-Placa de cultura de células tratada com TCCorning353003
Pulsador de células X GeneBiorad165-2661
Solução de gentamicinaSigmaG1397
Pratos com fundo de vidro 35 mm sem revestimento 1.5MatTek corporationP35G-1.5-14-C Case
iMICTILL PhotonicsObjetiva de imersão em óleo (N 100X, NA1.49), câmara de aquecimento com CO2, uma câmera de detecção de fóton único EMCCD (Electron Dispositivo de Multiplicação de Carga Acoplada) e uma lente 1.5X
Solução de Poli-L-Lisina 0.1%SigmaP8920-100mlDiluição a 0.01% em água 
RPMI 1640 médio GLUTAMAX  SuplementoLife technologies61870-010
RPMI 1640 médio, sem vermelho de fenol (10 x 500 ml)Life technologies11835-105Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs)EurobioDSGMTN00-0QConservado em tampão Alsever a 4 &graus; C antes de usar
à temperatura ambiente de célula

Referências

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