"Fagossomo Encerramento Ensaio" para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Fagocitose é uma função de célula grande que começa com o reconhecimento e ligação de material para a superfície receptores, que depois leva à internalização e degradação do material ingerido. Enquanto eucariotas unicelulares como o Dictyostelium discoideum molde e amebas usar fagocitose para a alimentação de bactérias, organismos superiores evoluíram com células profissionais. Os macrófagos ou células dendríticas são a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos em vários tecidos e órgãos, e são cruciais para activar o sistema imunitário adaptativo através de apresentação de antigénio e produção de citocinas ^1-4. Sob certas circunstâncias a fagocitose pode ser realizada por células fagocíticas não profissionais, por exemplo, células endoteliais e epiteliais. Este processo é importante para manter a homeostase durante o desenvolvimento e na vida adulta de renovação do tecido normal e de remodelação. fagócitos Finalmente, especializados, tais como células de Sertoli nos testículos ou da retinanas células epiteliais pigmentares são extremamente potentes fagócitos ^5.

A formação de um fagossoma onde a degradação de microrganismos ou fragmentos celulares ocorre começa com o agrupamento de receptores fagocíticos na superfície da célula fagocítica. eventos de sinalização a jusante seguintes agrupamento de receptores opsónicos, tais como receptores Fc (FcR) ou receptores de complemento (CRS) têm sido bem caracterizadas. No entanto, também existem numerosas receptores não-opsónicos incluindo receptores semelhantes a Toll (TLRs), lectinas, receptores de manose e receptores scavenger. Estes receptores reconhecem determinantes sobre a superfície das partículas, tais como resíduos de manose ou fucose, fosfatidilserina, e lipopolissacarídeos ^1,6-9.

Agente patogénico ou fragmentos de células de reconhecimento envolve a ligação ao agrupamento e de vários tipos de receptores de fagocitária, que, em seguida, conduzir a uma intensa e transiente remodelação da actina. Em exocitose paralelo, focal de compartmen intracelularTS contribui para a libertação da tensão da membrana e é importante para a fagocitose eficiente de grandes partículas. Os eventos de sinalização que levam à deformação de polimerização e membrana actina foram dissecados em modelos experimentais que desencadearam um único receptor fagocítica. Durante a fagocitose FcR-mediada, há intensa polimerização de actina, que é regulada por pequenas GTPases (Rac, Cdc42). Entre os seus efectores a jusante, a proteína síndroma de Wiskott-Aldrich (WASP) conduz à activação da proteína relacionada com a actina 2/3 complexo (Arp2 / 3) que nucleia ^1,2,4,10 filamentos de actina. A produção local de fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato (PI (4,5) P ₂₎ é crucial para a polimerização de actina inicial que dirige a formação pseudópode. Sua conversão em PI (3,4,5) P ₃ é necessário para a extensão pseudopod e fechamento fagossomo ^11. Diversas vias de contribuir para o desaparecimento de PI (4,5) P _2. Em primeiro lugar destacamento de fosfatidilinositol kina fosfatoses (PIPKIs) do PI prisões fagosoma (4,5) P ₂ síntese. Em segundo lugar, pode ser fosforilada e consumido por PI3K de classe I-quinases (PI3K) e convertido em PI (3,4,5) P ₃ ^12. Um papel para fosfatases e fosfolipases também tem sido implicado em PI (4,5) P ₂ hidrólise e remoção de F-actina durante a fagocitose em células de mamífero e em Dictyostelium ^13,14. O δ fosfolipase C (PLC) hidrolisa PI (4,5) P ₂ em diacilglicerol e fosfato de tris-inositol-1,4,5-. O OCRL PI (4,5) P ₂ e PI (3,4,5) P ₃ fosfatase (síndrome oculocerebrorrenal de Lowe) também tem sido implicado na formação do fagossoma. formação local preciso da F-actina e sua despolimerização é estreitamente regulada no espaço e no tempo e temos demonstrado que o recrutamento de compartimentos intracelulares é importante para entregar localmente a fosfatase OCRL, contribuindo assim para a despolimerização de actina locais na base do copo fagocitária

Os jogadores mecanismo e moleculares necessários para o encerramento fagossomo e cisão da membrana permanecem pouco conhecidos devido às dificuldades em visualizar e monitorar o local de encerramento fagossomo. Até recentemente, a fagocitose foi observado em células fixas ou vivos que internalizam partículas na face dorsal ou em seus lados, tornando a visualização em tempo útil do local de fechamento fagossomo difícil. Além disso, métodos de fixação pode causar retração de membranas e enviesar os resultados na extensão pseudópodos e encerramento. Em contrapartida, o ensaio que criámos e descrever aqui nos permite visualizar a extensão pseudopod ea etapa de encerramento da fagocitose em células vivas ^13, com base em microscopia interna total reflexão (TIRFM) ^16. Esta técnica utiliza óptica uma onda evanescente para excitar fluoróforos numa zona fina na interface entre um modo transparentetampa (lamela) e um (meio de cultura de células) de líquido. A espessura da profundidade de excitação é de cerca de 100 nm a partir da superfície sólida, permitindo a visualização de eventos moleculares perto da membrana plasmática. TIRFM permite uma elevada relação de sinal-para-fundo, e limita a fluorescência para fora de foco recolhida e a citotoxicidade devido à iluminação de células.

Tomando vantagem de TIRFM, foi desenvolvido o "ensaio de encerramento fagossoma" em que lamelas são activados com poli-lisina e, em seguida, revestida com as células vermelhas do sangue de IgG-IgG-opsonizados (SRBCs). Macrófagos que expressam proteínas transitoriamente fluorescente etiquetado de interesse são, então, autorizado a engolir as IgG SRBCs. Enquanto as células separar as partículas que são alvo não-ligado de forma covalente à superfície do vidro, as pontas dos pseudopods podem ser observadas e registadas no modo de TIRF. aquisições TIRF são combinados com aquisições no modo de epifluorescência, após o deslocamento da uM fase 3 acima, o que permite a visualization da base do copo fagocítica. A adição de drogas farmacológicas, tais como os da inibição da actina ou dinamina durante o processo também é possível, para dissecar ainda mais o processo, a nível molecular.

O protocolo descrito em pormenor aqui é para uma linha celular de macrófagos de murídeo e RAW264.7 partículas opsonizadas, mas virtualmente, ele pode ser adaptado a qualquer outra célula fagocítica e com outros objectivos, tais como esferas. Este método permitirá uma melhor caracterização da regulação no tempo e no espaço dos jogadores moleculares envolvidos na extensão pseudopod e fechamento fagossoma durante vários processos fagocíticas.

Nota: O plasmídeo utilizado Lifeact-mCherry é um dom tipo de Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, gerada após ^17.

1. Células e Transfecção

Nota: RAW264.7 de macrófagos são crescidas até à sub-confluência em meio completo (meio RPMI (Roswell Instituto Parque Memorial) 1640, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, 50 ^ M β-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina e 10% de FCS ( soro fetal de vitelo)) em uma placa de 100 mm. Eles são transf ectadas com plasmídeos que codificam para proteínas marcadas fluorescentemente por electroporação. Rotineiramente aproximadamente 5-6 x 10 ⁶ células são transfectadas com 20 ug ou 10 ug de plasmídeo para cada transfecção e co-transfecção, respectivamente. Note-se que outros meios de transfecção à base de electroporação ou lipofecção podem ser utilizados como abordagens alternativas.

1. Raspar as células com um levantador de células e ressuspender-los em 10 ml de meio de cultura por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
2. Centrifugar asuspensão de células 300 x g, 5 min a RT no rotor de ângulo oscilante.
3. Pré-aqueça 10 ml de meio completo suplementado com 10 ug / ml de gentamicina, a 37 ° C.
4. A seguir à centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de "tampão de lavagem A" a partir do kit de electroporação.
5. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg, 5 min a temperatura ambiente no rotor de ângulo oscilante.
6. Enquanto isso preparar a mistura de ADN à temperatura ambiente: 120 ul de 2x tampão B, 20 ^ g de ADN plasmidico que codifica para a proteína de interesse, qsp 240 mL _de H ₂ O.
7. A seguir à centrifugação, eliminar todo o sobrenadante.
8. Ressuspender o sedimento de células na mistura de ADN e transferência em cuvetes de electroporação de 4 mm.
9. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
10. Electroporate a 250 V, 900 uF.
11. Imediatamente ressuspender as células no pré-aquecido (37 ° C) de meio completo suplementado com gentamicina e a chapam em uma placa de 100 mm.
12. Incubam-se as células transfectadas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO _2.
13. Na manhã seguinte, substituir o meio completo com 10 ml de meio de microscopia isento de soro (RPMI 1640 sem vermelho de fenol, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 50 uM β-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina).

2. Opsonização de glóbulos vermelhos

Nota: Como um modelo de meta de partículas para os macrófagos, células do sangue ovelhas vermelhas (SRBCs) são utilizados. Normalmente, cerca de 7 x 10 ⁶ SRBCs por 35 milímetros prato fundo de vidro é usado.

1. Lavar os SRBCs com 100 ul de 1x PBS (fosfato salino tamponado) /0.1% de BSA (albumina de soro bovino) e centrifugação (600 xg, 4 min).
2. A seguir à centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender as SRBCs em 100 ul de 1x PBS / 0,1% BSA e centrifugação (600 xg, 4 min).
3. A seguir à centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender as SRBCs em 1X PBS / BSA a 0,1% com IgG de coelho anti-SRBCsna sub-aglutinar concentração. Utilizar 500 ul de solução contendo anticorpo / 5 ul de SRBCs.
   Nota: A concentração sub-aglutinação de anticorpos corresponde à concentração mais baixa que não induziu aglutinação detectada como a formação de uma rede. Em geral, a concentração sub-aglutinação é de 8,2 ug / ml.
   1. Determinar a concentração de anti-IgG de SRBCs necessários para opsonizar os SRBCs por um teste de neutralização. Serialmente dilua a anti-IgG de SRBCs (estoque a 13,1 mg / ml) entre 1/50 - 1 / 25.600 de uma microplaca. Adicionar 2 x 10 ⁶ SRBCs em cada poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante várias horas.
4. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos com rotação lenta.
5. Após duas lavagens em 1X PBS / BSA a 0,1% como descrito acima, ressuspender os SRBCs-IgG (IgG-opsonizadas SRBCs) em meio isento de soro microscopia pré-aquecido (2 ml / prato).

3. Revestimento de poli-lisina de lamelas

1. Enquanto isso, Tratar pratos 35 milímetros de vidro de fundo com 2 ml de 0,01% de poli-L-lisina durante 30 min à temperatura ambiente.
2. Lavar os pratos duas vezes com 2 ml de PBS 1x.

4. Fixação não-covalente de SRBCs em pratos com fundo de vidro

1. Despeje 2 ml de SRBCs suspensão por 35 milímetros prato de vidro de fundo.
2. Centrifugar com um rotor girando a 500 xg durante 2 min para 35 milímetros de vidro pratos de fundo.
3. Remover o sobrenadante e lavar uma vez com 2 ml de PBS 1X / BSA a 10%.
4. Incubam-se as partículas durante 30 min com 2 ml de PBS 1X / BSA a 10% por placa de Petri.
5. Lavar os pratos três vezes com 2 ml de PBS 1x.
6. Substituir 1x PBS com 2 ml de meio pré-aquecido (37 ° C) sem soro microscopia.

5. A fagocitose visualizado por TIRFM

1. Microscópio
   Nota: TIRFM foi realizada usando um microscópio equipado com uma objectiva de imersão em óleo (N 100X, NA1.49), uma câmara de aquecimento com CO _2, e duas cantele câmeras de detecção de fótons EMCCD (Electron Multiplicando Charge Coupled Device) acoplado com uma lente de 1.5X.
   1. O dia antes da sessão de microscópio TIRF, ligar a câmara de aquecimento a 37 ° C para permitir um aquecimento homogéneo da platina do microscópio.
2. Determinação ângulo crítico
   Nota: software ImageJ Color Profiler é usado para processar fluxos de imagem TIRF.
   1. Coloque um 35 milímetros prato de vidro de fundo contendo SRBC opsonizado com meio de microscopia sem soro sob o microscópio.
   2. Raspar as células e ressuspender-los na forma antes de os adicionar (100 - 500 ul) no prato.
   3. Utilizar o software "Aquisição vivo" para controlar o microscópio e executar de excitação com um 491 nm e / ou um laser de 561 nm para identificar as células que expressam as proteínas marcadas fluorescentemente.
   4. Identificar uma célula que expressa as proteínas marcadas fluorescentemente.
   5. Coloque-o no meio do campo e adquirir 500 imas idades em um comprimento de onda de excitação, com ângulos diferentes a partir de 0º até 5º, com um incremento de 0.01º (Figura 2A). Os ângulos são automaticamente alterada pelo sistema de microscópio.
   6. Determinar o ângulo crítico permitindo que a luz incidente seja totalmente reflectida na interface vidro / médio e gerar a onda evanescente. Usando o software ImageJ Color Profiler, abra a sequência de imagens, clicando em "Arquivo", "Abrir" e selecione o arquivo.
   7. Seleccionar uma região de interesse (ROI), com a ferramenta rectangular, na célula com uma fluorescência uniforme (Figura 2B amarelo 1).
   8. Traçar o "perfil do eixo Z" significa intensidade de fluorescência medida no ROI com a função dos ângulos no eixo x, clicando na guia "Imagem", "Pilhas" no menu suspenso e "Plot-eixo Z perfil" para baixo (Figura 2B vermelho 2).
      Nota: O ângulo crítico é o ângulo que conduz à mafluorescência ximum antes de uma queda acentuada na fluorescência.
   9. Usar qualquer valor de ângulo sobre o eixo x superior ao ângulo crítico durante a sessão de microscopia para obter um sinal TIRF como exemplo 2.00 (Figura 2C).
3. aquisições
   1. Usando o software vivo Aquisição, configurar os parâmetros de aquisição com o módulo "Protocolo Editor" (Figura 3A).
      1. Criar um protocolo com um "loop" compreendendo "Canais Multi" aquisição para adquirir sinal fluorescente a partir de proteínas de interesse na região de TIRF. Introduzir o ângulo TIRF (por exemplo 2,00), o tempo de exposição (por exemplo, 50 ms) e a intensidade do laser (por exemplo, 50%) (Figura 3B 1).
      2. Introduzir um "movimento Z" da mm objectivo dos 3 acima da região TIRF para obter a aquisição de sinal na epifluorescência com o "Canais Multi" ferramenta. Insira um ângulo abaixo tele ângulo crítico (por exemplo 1,00), o tempo de exposição (50 ms) e a intensidade do laser (50%) (Figura 3B, 2 e 3).
      3. Em seguida adicione um "z move" da mm objectiva 3 abaixo, para retornar na região de TIRF (Figura 3B 4). Adicionar um "instantâneo" da célula em LED (Light-Emitting Diode) (Figura 3B 5) luz brilhante.
   2. Encontrar uma célula de interesse, com um nível moderado de expressão de proteína marcada com fluorescência que inicia a fagocitose de SRBC por membrana plasmática que se estende em torno da partícula.
   3. Coloque-o no meio do campo.
   4. Iniciar a transmissão de aquisição de 500 - 1000 quadros. Na aba "contagem de loop", digite "750 frames" (Figura 3B 1).
      Nota: software ImageJ Color Profiler é usado para processar fluxos de imagem TIRF.
   5. Abra as imagens da sequência de programa Image J clicando"Arquivo", "Abrir" e escolher o arquivo.
   6. Separar os canais clicando na guia "Imagem", "Hyperstacks" no menu suspenso e em "Stack para hyperstack" função. Conclua a janela apareceu: Ordem: xyctz; Channel (c): número de canais (ex: "2" se você tem dois fluorocromos); Slices (z): número de fatias em eixo z (ex: "1" se não há movimento no eixo Z); Frames (t): número de imagens divididas por número de canais; Modo de exibição: escala de cinza.
      Nota: Duas sequências de imagem separados são gerados, correspondendo aos dois canais diferentes.

O sistema experimental descrito neste manuscrito está esquematicamente representada na Figura 1. Macrófagos RAW264.7 transfectadas que expressam as proteínas de interesse fundida com uma marcação fluorescente são colocados em contacto com glóbulos vermelhos de ovelha IgG-opsonizado (SRBCs) que eram não-covalentemente fixo sobre a lamela. Os macrófagos pode destacar o SRBC da lamela para afundá-lo. O microscópio utilizado TIRF permite a aquisição concomitante de sinais a partir da área de TIRF correspondentes às pontas dos pseudopods e sinais no modo de epifluorescência, após uma mudança de Z 3 um acima.

É essencial para determinar o ângulo crítico para a reflexão interna total de fluorescência, tal como descrito na Figura 2. Isto assegura um sinal TIRF limpa a partir de uma região de 100 nm abaixo da membrana plasmática. A Figura 3 representa o desenvolvimento de acquisitiem parâmetros através de um módulo chamado "Editor do Protocolo" incluído no software vivo Aquisição. Este módulo permite aos usuários criar e gerenciar fluxos de trabalho antes de serem enviados para o microscópio, que irá executar o processo. No final da aquisição, o utilizador recebe um fluxo TIFF.

A Figura 4 mostra, um filme TIRFM ao vivo de células representante de um "ensaio de fechamento fagossomo" em macrófagos RAW264.7 transfectadas com o plasmídeo (por exemplo, Lifeact-mCherry, um presente amável do Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, gerado após 17) a seguir a polimerização da actina. Macrófagos transitoriamente plasmídeo expressando foram autorizados a envolver-IgG SRBCs ligados à lamela. À medida que as pontas das pseudopods foram justaposto à lamela de vidro em torno de um SRBC, um anel de F-actina foi detectado na área de TIRF (painel superior) que progressivamente estreitado até fechado. Em paralelo, o obscuro F-actinasinal detectado por epifluorescência, após o deslocamento da fase 3 uM de cima (painel inferior) correspondeu a despolimerização na base do copo fagocitária. Após 3 min de aquisição, a SRBC foi totalmente interiorizado, como confirmado com luz transmitida (painel à direita).

Por conseguinte, este método pode ser usado para distinguir correctamente os acontecimentos moleculares que ocorrem nas próprias extremidades dos pseudopods e os acontecimentos moleculares que ocorrem na base do copo fagocitária.

Figura 1. Representação esquemática do "Ensaio de Encerramento fagossoma" Analisado por TIRFM. O ensaio de encerramento fagossoma é realizada usando macrófagos que expressam transitoriamente um ou dois fluorescentemente marcado com proteína. Os macrófagos são depositados sobre SRBCs IgG-opsonizadas não covalentemente imobilizado no coa poli-lisinated lamelas. As imagens são gravadas no modo TIRF para detectar o local de encerramento fagossomo e em modo de epifluorescência para detectar a base da taça fagocitária. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Determinação do ângulo crítico para TIRFM. (A) utilizando "aquisição vivo", uma célula que expressa proteínas marcadas fluorescentemente é colocado no meio do campo (uma região em vermelho). Com a opção TIRF Pilha, imagens foram adquiridas em um comprimento de onda de excitação, com ângulos diferentes a partir de 0 ° até 5 °, com um incremento de 0,01 ° (região 2 em vermelho). (B) A sequência de imagens é aberto usando ImageJ software Color Profiler ea intensidade média de fluorescência de aregion de interesse (ROI) é plotado com a função dos ângulos no eixo X usando "Pilhas" e "Plotz eixo perfil" (região 1 em vermelho). (C) A posição x do pico de fluorescência no lote corresponde a o ângulo crítico: 1,98 ° (linha pontilhada preto). Qualquer valor após esse ângulo pode ser usado. Como exemplo, 2,00 ° pode ser escolhido (linha vermelha). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Processo de Workflow usando o Live módulo de aquisição: "Editor do Protocolo". (A) Na janela "Editor de Protocolo", uma tela de fluxo de trabalho é criada. (B) Este protocolo compreende um "Loop" de ações que o microscópio irá repetir o número de vezes que decidiupelo utilizador. Como um exemplo: 750 (1). Um ciclo incluiu: "Canais Multi" aquisição com excitação laser de proteínas fluorescentes de interesse no modo TIRF. Como exemplo: laser 491 nm de 50% de intensidade ângulo -TIRF 2,00 (2); "Z move" do objectivo de 3 mm (3); "Canais Multi" aquisição em modo de epifluorescência (4); "Z move" do objectivo de volta para a região do TIRF (5) e um "instantâneo" em luz transmitida (6). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. F-actina é acumulado como um ponto no local de ensaio de encerramento de fecho fagossoma. Fagossoma foi realizada usando macrófagos RAW264.7 que expressam transitoriamente o plasmídeo Lifeact-mCherry (uma gentil oferta do Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, gerada após 17). O sinal de plasmídeo foi adquirida na área TIRF (superior) e no modo de epifluorescência (parte inferior). A seta vermelha indica a acumulação de actina na região de TIRF. Transmitidos imagem luz em 3 min é apresentado, indicando uma SRBC internalizado. Barra de escala, 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1: F-actina é acumulada nas pontas do pseudopods e no local da fagossomo Encerramento, enquanto que sejam retirados a partir da Base do ensaio fechamento fagocítica Cup fagossomo foi realizada usando macrófagos RAW264.7 que expressam transitoriamente o plasmídeo.. O plasmídeo de imagem na área TIRF (superior) e no modo de epifluorescência (inferior) utilizando o TIRFM foi realizada alternativaly cada 50 ms durante 3 min a 37 ° C. Por favor clique aqui para ver este vídeo.

Os autores não têm nada a divulgar.