Avaliação rápida e específica da atividade da peroxidase de halogenação em amostras de sangue enriquecido por leucócitos

Resumo

Este protocolo descreve o rápido enriquecimento de leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue para uma subsequente determinação específica da atividade da peroxidase halogenante dentro das células. O método pode ser aplicado a material humano e não humano e pode contribuir para a avaliação de novos marcadores inflamatórios.

Resumo

Neste trabalho é descrito um protocolo para o enriquecimento rápido e padronizado de leucócitos a partir de amostras de sangue total pequenos. Este procedimento baseia-se na lise hipotónica de eritrócitos e pode ser aplicado a amostras humanas, bem como com o sangue de origem não-humana. O pequeno volume da amostra inicial de cerca de 50 a 100 ul torna este método aplicável para a amostragem de sangue de repetição a partir de pequenos animais de laboratório. Além disso, o enriquecimento de leucócitos é alcançado em poucos minutos e com os esforços de baixo materiais entre os produtos químicos e de instrumentação, tornando este método aplicável em vários ambientes de laboratório.

Purificação de leucócitos Padronizada é combinado com um método altamente selectivo coloração para avaliar a actividade da peroxidase de halogenação das peroxidases heme, mieloperoxidase (MPO) e peroxidase de eosinófilo (EPO), ou seja, a formação de ácido hipocloroso e hipobromoso (HOCl e HOBr). Enquanto MPO é fortemente expressa em neutrophils, o tipo de célula mais abundante imunitário no sangue humano, assim como em monócitos, a enzima relacionada com a EPO é expresso exclusivamente em eosinófilos. A atividade de halogenação destas enzimas são os destinatários usando a fluoresceína específica HOBr-quase HOCl- e corante aminofenil (APF) e da peroxidase primário de peróxido de hidrogênio substrato. Após a análise de citometria de fluxo subsequente todas as células peroxidase-positivo (neutrófilos, monócitos, eosinófilos) são distinguíveis e a sua actividade de peroxidase de halogenação pode ser quantificada. Uma vez que a coloração APF pode ser combinado com a aplicação de marcadores de superfície celular, este protocolo pode ser estendido para abordar especificamente sub-fracções de leucócitos. O método é aplicável para a detecção de HOCl e HOBr produção tanto em humano e em leucócitos de roedores.

Dado o papel imunológico amplamente discutido e diversamente destes produtos enzimáticos em doenças inflamatórias crónicas, este protocolo pode contribuir para uma melhor compreensão dorelevância imunológica de peroxidases heme derivados de leucócitos.

Introdução

Leucócitos polimorfonucleares (PMN, também denominados granulócitos e monócitos) representam importantes componentes celulares do sistema imune inato no sangue ^1,2. Eles contribuem para a defesa principal contra patogénios, assim como para a activação do sistema imune adaptativo e o início de uma resposta inflamatória sistémica ^2-4. No entanto, especialmente dos neutrófilos, o tipo mais abundante de granulócitos e monócitos também contribuem significativamente para a regulação e rescisão de eventos inflamatórios agudos ^5. Por conseguinte, estas células podem também desempenhar um papel importante em doenças inflamatórias crónicas como a artrite reumatóide ^6,7. Na verdade, a asma, uma doença inflamatória crónica das vias aéreas, é caracterizada por uma apoptose dos eosinófilos auditivos, o segundo tipo mais de granulócitos no sangue ^8. No entanto, a apoptose de granulócitos e sua rápida remoção por macrófagos são dois passos essenciais durante a terminação celularde inflamação ^9-11.

Nas células imunes chamados duas enzimas intimamente relacionados, nomeadamente mieloperoxidase (MPO, neutrófilos e monócitos) e peroxidase de eosinófilo (EPO, eosinófilos) pode ser encontrado ^12,13. Estas peroxidases heme são classicamente relacionada com a resposta imune humoral como eles de duas electronicamente oxidar halogenetos de (pseudo) para o hipo correspondente (pseudo) halous ácidos que são conhecidos pelas suas propriedades bactericidas ^14-16. Sob condições fisiológicas MPO se forma principalmente o ácido hipocloroso (HOCl) e hypothiocyanite ^(- OSCN) enquanto que o ácido hipobromoso e último (HOBr) são formados por EPO ^17-19. Novos resultados sugerem que esta atividade da enzima de halogenação (pseudo-) também podem contribuir para a regulação de respostas inflamatórias e ao encerramento de reações imunes ^20,21. De facto, a produção de HOCl por MPO e produtos derivados foram mostrados para suprimir respostas adaptativas baseados em células imunitárias T ^22-24.

A fim de obter mais insights sobre o papel imunológico de leucócitos a partir do sistema imune inato em doenças inflamatórias crónicas e para determinar a contribuição de MPO e EPO a esta função fisiológica foi desenvolvido um método para enriquecer rapidamente leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue para uma específica subsequente determinação da atividade da peroxidase de halogenação nestas células. Para a depleção de eritrócitos nós escolhemos um método padronizado incluindo as etapas de lise hipotônica de dois subsequentes com água destilada, o que leva a um enriquecimento de leucócitos rápido em custos de material baixos. Para a determinação subsequente da MPO halogenação e da actividade EPO a HOCl- e específicos de HOBr corante aminofenil fluoresceína (APF) foi usado ^25-27. Em contraste com a aplicação de métodos de coloração de peroxidase inespecífica ^28,29, esta abordagem permite a detecção selectiva da actividade de peroxidase de halogenação, o qual é muitas vezes prejudicada pelo infl graveamação ^30,31.

Protocolo

Todas as amostras de sangue humano foram obtidas de voluntários saudáveis, e o protocolo de enriquecimento de leucócitos aplicada segue as diretrizes da comissão de ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Leipzig. Os experimentos com sangue de rato foram aprovados pelo comitê de ética local responsável (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), de acordo com as directrizes alemãs sobre cuidados com os animais e utilização.

1. Configuração Experimental

NOTA: Como o procedimento de lise hipotônica para o esgotamento dos eritrócitos a partir das amostras de sangue é um procedimento de tempo crítico, prepare todo o equipamento necessário (por exemplo, buffers) para esta parte do protocolo de antecedência.

1. Rotular um 15 ml tubo de centrifugação para a lise hipotônica e um tubo de 1,5 ml da amostra para posterior fluoresceína aminofenil (APF) coloração por amostra de sangue.
   1. Se o enriquecimento de leucócitos irão ser realizada sob condições estéreis, executar esta rotulagem sob um fluxocaixa.
2. Prepare a cerca de 12 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, 10 mM) por amostra. Dependendo do facto de os leucócitos devem ser isolados, em condições estéreis ou não, preparar PBS, quer com a solução estéril pronta a partir de um fornecedor ou por dissolução de comprimidos de PBS em água destilada. Verificar o valor de pH e, se necessário, ajustar o pH para 7,4, utilizando pequenas quantidades de soluções de 0,1 M de HCl e de NaOH.
   1. Dissolve-se comprimidos PBS (ver tabela de materiais) em 200 ml de água destilada para obter uma solução tampão não-estéril suficiente para cerca de 16 amostras. Se desejado, esterilizar a solução por filtração estéril.
3. Prepare a cerca de 1 ml de solução de Hanks equilibrada de sais (HBSS) suplementada com Ca ²⁺ por amostra.
   1. Dissolve-se 970 mg de sal de HBSS em 100 ml (volume final) de água bidestilada. Antes de preencher até ao volume final, verifique o valor de pH e ajustá-lo para pH 7,4. Devido à sua capacidade tampão baixo, preparar este tampão fresco cada dia, umd realizar o ajustamento do pH com especial cuidado, usando pequenas quantidades de soluções de HCl 0,1 M e NaOH.
      NOTA: solução estéril pode ser usado, dependendo da experiência. A solução pode ser esterilizada por filtração estéril.
4. Além dos dois tampões, de etiquetas e preparar um tubo (por exemplo, 50 ml de tubo de centrifugação) ou recipiente de vidro (por exemplo, 250 ml de medição do copo) com água duplamente destilada para o procedimento de lise hipotónico com antecedência. Prepare cerca de 10 ml de água por amostra.
5. Preparar um recipiente com gelo esmagado para a coloração APF (secção 3), a qual é realizada em gelo.
6. Preparar alíquotas de APF antecedência para permitir a preparação rápida de soluções de trabalho utilizados durante a coloração (passo 3.2) e evitar repetidamente congelamento e descongelamento da solução APF.
   NOTA: APF é geralmente obtido como um 5 mg / ml (11,81 mM) solução estoque em acetato de metilo.
   1. Congelar alíquotas de 10-100 ul em tubos de 0,5 ml. Para a APF manchando uma finalconcentração de corante de 10 uM é utilizado (Passo 3.8).

2. Hypotonic lise dos eritrócitos

NOTA: Execute as etapas de lise hipotônica (exceto os passos de centrifugação) sob uma bancada de fluxo laminar para evitar a contaminação. Executar todo o processo à temperatura ambiente. À medida que a lise hipotónica é um processo crítico tempo, ajustar as pipetas para água (2 ml) e PBS (5 ml) adição com antecedência e abre a água e frascos PBS antes de iniciar o procedimento. Guardar a solução de PBS e a água destilada, à temperatura ambiente antes do uso.

1. A partir de cada amostra de sangue de transferência 100 ul aos 15 ml tubo de centrifugação adequado.
   Nota: Nas nossas experiências amostras de sangue geralmente contêm 10 U / ml de heparina, a fim de evitar a coagulação. No entanto, devido a diferentes fontes de material de amostra a natureza e concentração do anti-coagulante podem ser diferentes. A sua influência sobre a coloração APF deverão ser testadas por Comparção dos resultados com os resultados obtidos a partir de amostras de sangue para além de outros tipos ou as concentrações de anti-coagulante.
2. Adicionar 2 ml de água destilada e misturar as amostras usando um misturador de vórtice para definir um nível médio. Incubar as amostras durante 60 segundos, em seguida, adicionar 5 ml de PBS por amostra e misturar usando o misturador de vórtice.
   NOTA: até cerca de 5 amostras podem ser preparadas em paralelo. Manter a ordem da amostra o mesmo para a adição de água e PBS para atingir tempos de incubação comparáveis.
3. Após regeneração das condições isotónicas através da adição de PBS (passo 2.2) sedimentar as restantes células intactas em todas as amostras por centrifugação durante 6 min à temperatura ambiente e 450 x g.
4. Retire o sobrenadante por coloca-lo em um caixote do lixo mesa. Remover o máximo de líquido possível, invertendo o tubo de centrifugação e tocando a abertura em uma toalha de papel. Assegure-se que o pellet celular é o mais seco possível.
5. Repetir o procedimento de lise hipotónico, tal como descrito antes (passo 2.2).
   NOTA: Em princípio este procedimento de lise hipotónico (passos 2.3 a 2.5) poderia ser repetido mais de uma vez, dependendo da pureza da fracção de leucócitos mista a ser obtido. Após dois lise passos a quota de permanecer eritrócitos na fracção celular mista obtida é cerca de 25%.
6. Sedimentar as restantes células intactas por centrifugação durante 6 min à temperatura ambiente e 450 x g. Remover o sobrenadante (veja o passo 2.4). Adicionar 500 uL de HBSS ao sedimento e dissolvê-lo suavemente até se obter uma solução homogénea. Transferir cada amostra para o tubo de amostra de 1,5 ml em conformidade marcado.
7. Dependendo da experiência analisar directamente amostras obtidas (por exemplo, por meio de citometria de fluxo) ^25, mancha com anticorpos marcados por fluorescência (para a identificação de tipos de células individuais) ^32, incubar com estímulos de células (para as experiências de activação de células) ³³ ou armazenado em gelo e utilização mais tarde. Dependendo do objetivo do estudo, imediatamente realizar experimentos subsequentes sobrea fracção de leucócitos mista desde granulócitos têm uma meia-vida relativamente curto de cerca de 20 h.
   NOTA: O mesmo vale para a coloração atividade da peroxidase descrito abaixo.

3. halogenação atividade da peroxidase Coloração

NOTA: HOCl- e HOBr-produção pelas peroxidases heme derivados do sangue de MPO e EPO é quantificada usando APF, o qual é oxidado a fluoresceína pelos ácidos hypohalous nomeados. Portanto, se a rotulagem de células com anticorpos marcados com fluorescência é realizada em combinação com coloração APF, fluoróforos evitar que interferem com o sinal de emissão da fluoresceína.

1. Realização da coloração APF a 4 ° C em gelo.
2. Para a preparação de uma solução de trabalho de APF descongelar uma aliquota adequada do corante (por exemplo, 10 ul, 11,81 mM) e dilui-lo com HBSS a exactamente 1 mM (por exemplo, adicionar 108,1 ul de tampão para o 10 ul).
   1. Para cada amostra (solução de células ul 500) preparar 5 μl da solução de trabalho APF descrito. Por conseguinte, utilizar uma aliquota de 10 ul de APF (11,81 mm), que produz 118,1 solução ul APF de trabalho (1 mM) para preparar cerca de 20 amostras. Devido à perda durante a pipetagem preparar cerca de 10% mais solução de trabalho APF do que calculado.
3. A fim de verificar a especificidade da peroxidase da coloração APF, preparar amostras de controlo com o inibidor de heme peroxidase de hidrazida do ácido 4-aminobenzóico (4-ABAH) ^35.
   1. Prepara-se uma solução stock de 1 M de 4-ABAH (151,17 g / mol) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) por diluição de 75,6 mg de 4-ABAH em 500 mL de solvente. Diluir 4-ABAH 1/10 em HBSS.
4. Para a preparação de uma solução de marca H ₂ O ₂ trabalhando em dois tubos de 1,5 ml com centrifugação "mM H ₂ O ₂ 70" e "H 7 mM de ₂ O _2", respectivamente.
   1. No tubo rotulado "mM H ₂ O ₂ 70", recém Diluir 10 uLde uma solução de estoque de 30% (8,8 mM) de H ₂ O _2, usando 990 ul de água destilada para se obter uma concentração de cerca de 88 mM. Armazenar em gelo e usar dentro de 4 horas.
      NOTA: H ₂ O ₂ é normalmente fornecido como uma solução estoque de 30% pelos fornecedores. Quando armazenado a 4 ° C, é estável durante cerca de 3 anos. Efectuar diluições de H ₂ O ₂ em água destilada para evitar a decomposição. H ₂ O ₂ diluições também pode ser preparada em solução de 0,1 M de NaOH.
   2. Para a determinação da H exacta concentração ₂ O _{2 a} preparar uma diluição adicional de 1 a 10 a partir do primeiro H ₂ O _{2 a} solução de estoque (cerca de 88 mM) pela adição de 100 ul desta solução a 900 ul de água destilada no tubo 1,5 ml rotulados "mM H 7 ₂ O _2".
   3. Gravar um espectro na gama de UV próximo (por exemplo, 200-300 nm) usando um photospectrometer UV-Vis e usar a absorvância a 240 nm (49; ₂₄₀ = 34 M ^-1 cm ^-1) para determinar a concentração real de H ₂ O ₂ na segunda H ₂ O _{2 a} solução de reserva ^34. Certifique-se de que a cuba de referência contém apenas água destilada. Para as cuvetes de quartzo de medição como o uso de um espectro na gama de UV é registada.
   4. A partir deste resultado, calcular as concentrações exactas de ambas as soluções de reserva _de H ₂ O _2. Ajustar a concentração de a primeira solução de estoque no "mM H ₂ O ₂ ^70" de tubos de amostra para exactamente 70 mM, por adição de uma quantidade adequada de água destilada. Guardar a solução obtida trabalhando sobre gelo e utilizar no prazo de uma hora.
5. Adicionam-se 5 ul da solução de trabalho de 4-ABAH (100 mM) às amostras adequadas para uma concentração final de 1 mM. Incubar as amostras durante 15 min a 37 ° C na incubadora antes de APF adição.
6. Adicionar 5 uL APF solução de trabalho (1 mM) a cada500 ul de amostra para se obter uma concentração de corante final de 10 uM. Misturar suavemente as amostras (por exemplo, usando o misturador de vórtice de uma definição média) e incubar durante 30 min a 37 ° C.
7. Adicionar 5 uL H solução de trabalho ₂ O ₂ (70 mM) a cada amostra de 500 ul para uma concentração final de 700 uM. Misturar suavemente as amostras e incuba-se-lhes durante 60 minutos a 37 ° C. Realizar medições adequadas de controlo em paralelo.
   NOTA: As medidas de controlo mostraram que 700 uM _de H ₂ O ₂ não são tóxicos para as células. quaisquer respostas celulares significativas nem foram observados.
   NOTA: A coloração com APF pode também ser realizada por omitindo a adição de H ₂ O _2, dependendo da questão científica. Na ausência de peróxido de hidrogénio apenas a MPO cloração basal e a actividade da EPO é determinada, enquanto a adição de H ₂ O ₂ permite a detecção da produção máxima de HOCl e HOBr pelas células. Tele últimos meios um sinal de fluorescência significativamente maiores.
8. Por peletização das células, centrifugação das amostras durante 10 min a temperatura ambiente e 400 x g. Cuidadosamente remover o sobrenadante sem destruir o sedimento e adicionar 250 uL de HBSS para ressuspender as células.
   NOTA: As amostras estão agora prontos para análise através de citometria de fluxo ^25.
9. Armazenar as amostras no escuro até análise para evitar branqueamento. Após excitação a 480-490 nm detectar a emissão de fluoresceina a cerca de 525 nm ^{de 37.}

Resultados

Como relatado anteriormente o método descrito acima acabou por ser aplicável tanto para a saúde humana e para o material não-humano ^32. Além disso, como mostrado para ratos com sintomas asmáticos a coloração APF pode ser um instrumento adequado, para detectar diferenças no estado pró-inflamatória sistémica. Portanto, em um estudo posterior utilizou-se este protocolo para avaliar repetidamente a atividade de halogenação de MPO (e EPO) em ratas escuro Agouti com artrite...

Discussão

Como os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue humano, o isolamento de células de peroxidase-positivos muitas vezes só incide sobre estas células e inclui uma separação dos neutrófilos a partir de outros leucócitos por centrifugação em gradiente de densidade de ^38. No entanto, como os neutrófilos são muito menos abundante em amostras de sangue de murino ³⁹ para os últimos métodos mais complicadas tem que ser utilizado ^40. Além disso ambos os métodos também conduzem à rem...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais/Equipamentos
Tubos de centrifugação de 15 ml	VWR/Corning	734-0451-1,5
ml Tubos de amostra	VWR/Eppendorf	211-2130DE-Pipetas
para volumes até 5 ml	Eppendorf	por exemplo, 3120000070	Estamos usando pipetas Eppendorf Resarch plus com volumes ajustáveis na faixa de 1 a 10 e micro; l, 10-100 µ l, 100-1.000 µ l um 500-5.000 µ l
bancada de fluxo laminar	Thermo Electron Corperation	HeraSafe-Vortex
mixer	Bender & Hobein AG	Vortex Genie	2-Centrífuga
mesa	Kendro Produtos de Laboratório	Laborfuge 400R	A centrífuga deve ser capaz de ser usada a 450 x g
Centrífuga pequena	Eppendorf	5415D	A centrífuga deve ser capaz de ser usada a 400 x g
Incubadora	Heraeus	cytoperm 2	Configurações: 37 ° C, 95% de humidade, 5% de conteúdo de CO2
espectrofotómetro UV-Vis	Varian	Cary 50 bio	Deve ser registado um espectro entre 200 e 300 nm. Assim, as cubetas de quartzo devem ser aplicadas
Citômetro de fluxo	Becton, Dickinson	BD Facs Calibur	Qualquer citômetro de fluxo pode ser usado equipado com um laser adequado para a excitação de fluoresceína (por exemplo< / em>, laser de argônio de 488 nm)
< forte > Nome< / forte >	< forte > Empresa < / forte >	< forte > Número de catálogo< / forte >	< forte > Comentários< / forte >
Produtos químicos
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	amresco	K812	estéril, pronta para uso
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	comprimidos para solução salina balanceada Hanks (HBSS) de 200 ml de água milipore
com Ca2+	Sigma-Aldrich	H1387	970 mg/100 ml, verificar cuidadosamente e ajustar o valor do pH para 7,4
Ácido clorídrico	Merck Millipore	1,09057.1000	Solução 1 M
Hidróxido de sódio	Riedel-deHaë n	30620	Pellets sólidos. Para uma solução 1 M, resolva 4 g/100 ml de água milipore
Aminofenil fluoresceína	Cayman	10157	Solução de 5 mg/ml (11,81 mM) em acetato de metila, alíquotas (por exemplo 100 µ l) deve ser preparado e armazenado a -20 & C
Peróxido de hidrogênio	Sigma-Aldrich	H1009	Esta solução estoque de 30% corresponde a uma concentração de cerca de 8,8 M. Outras diluições devem ser preparadas em água destilada imediatamente antes do uso e quantificadas por medições de absorbância
Hidrazida de ácido 4-aminobenzóico (4-ABAH)	Sigma-Aldrich	A41909	Uma primeira solução de estoque de 1 M deve ser preparada em DMSO e uma segunda de 100 mM por diluição de 1:10 em produtos químicos HBSS
DMSO	VWR	23500.26	-