Métodos para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA visando etapas pós-integração do ciclo de replicação do HIV-1 são descritos. Esses métodos são úteis para rastrear novas moléculas e otimizar o formato das existentes.
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Artigo de método
Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pequenas terapias de RNA direcionadas às etapas pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1 estão entre os principais candidatos à terapia gênica e têm potencial para serem usadas como terapias medicamentosas para a infecção pelo HIV-1. Os inibidores pós-integração incluem ribozimas, RNAs em grampo curto (sh), pequenos RNAs interferentes (si), RNAs de interferência U1 (U1i) e aptâmeros de RNA. Muitos deles foram identificados usando ensaios de co-transfecção transitória com um plasmídeo de expressão do HIV-1 e alguns avançaram para ensaios clínicos. Além das medidas de eficácia, pequenos RNAs foram avaliados quanto ao seu potencial de afetar a expressão de RNAs humanos, alterar o crescimento e/ou diferenciação celular e provocar respostas imunes inatas. Nos protocolos aqui descritos, é descrito um conjunto de ensaios de transfecção transitória projetados para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA direcionadas a etapas pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1. Usamos esses ensaios para identificar novas ribozimas e otimizar o formato de shRNAs e siRNAs direcionados ao RNA do HIV-1. Os métodos fornecem um conjunto rápido de ensaios que são úteis para rastrear novos RNAs anti-HIV-1 e podem ser adaptados para rastrear outros inibidores pós-integração da replicação do HIV-1.
Introdução
Uma limitação dos actuais tratamentos do HIV-1 é que eles devem ser cronicamente administrado para prevenir a progressão da doença. Transplantação de VIH-1 resistente a linfócitos T, ou células-tronco hematopoiéticas, tem o potencial para proporcionar um controlo de longa duração de replicação do HIV-1 na ausência do tratamento medicamentoso 1,2 e pode também ser uma abordagem eficaz para atingir uma cura de HIV-1 3. Uma maneira de tornar as células resistentes ao HIV-1 é a replicação para inserir um ou mais genes que codificam para anti-HIV-1 RNA ou péptidos em células de um indivíduo infectado durante um transplante autólogo 4. Vári....
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Protocolo
1. Células e transfecções
- Culturas de células HEK 293T em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Prepara-se uma suspensão de 2 x 10 5 células / mL no meio de cultura celular. Adicionar 500, 100 e 1.000 mL da suspensão de células a cada poço de 24 poços, 96 poços e 12 poços placas, para a produção virai, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente (Figura 2A).
- Agite suavemente as placas e incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2. Cultivar células a 50-70% de confluência.
- De acordo ....
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Resultados
Um esquema geral dos processos é mostrado na Figura 2, com um plano de transfecção exemplo para três RNAs de teste e um ARN de controlo fornecida na Figura 2B. Para os ensaios de viabilidade celular de produção e virais, a leitura para cada construto de teste é normalizada para um controlo negativo. Os duplicados estão transfectadas em conjuntos, de modo que cada ARN teste é normalizado para o seu controlo negativo adjacente. Isto é feito para evitar dad.......
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Discussão
O ensaio de produção de HIV-1 descrita foi realizada utilizando células HEK293T (Figura 2) e é semelhante para os ensaios utilizados para rastrear ARN de HIV-1 para ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, ARNsi 30, e U1i locais de ARN alvo 11,31. Usando diferentes métodos para quantificar a produção de HIV-1, a maioria dos estudos mediram a produção virai de 48 h após a co-transfecção de um plasmídeo de expressão do VIH-1 com RNAs candidatos. Após a produção do VIH-1.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O trabalho aqui apresentado foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (concede DCB-120.266, PPP-133377 e HBF-348967 para AG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicilina/Estreptomicina Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Placas de cultura de células, 96 poços, 24 poços, 6 poços. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubos Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Baixo peso molecular Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | reagente de transfecção para RNAs sintéticos |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | reagente de transfecção para plasmídeos de expressão de RNA |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| modelo de RNA poli(A) | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Contador de cintilação de microplacas | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Espectrofotômetro de microplacas | Bio-rad | 1706930 | |
| Comprimidos tampão de lise | Roche | 4693159001, 4906837001 | inibidores de protease e fosfatase |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagente | Bio-rad | 500-0006 | |
| Câmara de corrida em gel | Hoefer | SE600 | |
| Célula de transferência semi-seca | Bio-rad | 1703940 | |
| Escada de proteínas EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Membrana de nitrocelulose | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Solução de remoção de anticorpos | Millipore | 2504 | |
| ECL - Pierce | Thermo Fisher | ||
| anticorpo | do Dr. B.L. Bass | ||
| anticorpo fosfo-T446-PKR | Abcam | ab32036 | |
| anticorpo fosfo-S396-IRF3 | Sinalização | 4947 | |
| Anticorpo | do Dr. A. Hovanessian | ||
| Anticorpo IRF3 | Sinalização celular | 11904 | |
| Anticorpo de actina | Millipore | MAB1501 | |
| Anti-coelho de cabra marcado com peroxidase | KPL | 474-1506 | |
| Anti-rato de cabra marcado com peroxidase | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
Referências
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
- Allers, K., et al....
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Reimpressões e permissões
