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Artigo de método

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

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DOI:

10.3791/54486

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5 de setembro de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Virus-Cell Interactions Laboratory, Lady Davis Institute for Medical Research, 2Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University

Neste artigo

Resumo

Métodos para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA visando etapas pós-integração do ciclo de replicação do HIV-1 são descritos. Esses métodos são úteis para rastrear novas moléculas e otimizar o formato das existentes.

Resumo

Pequenas terapias de RNA direcionadas às etapas pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1 estão entre os principais candidatos à terapia gênica e têm potencial para serem usadas como terapias medicamentosas para a infecção pelo HIV-1. Os inibidores pós-integração incluem ribozimas, RNAs em grampo curto (sh), pequenos RNAs interferentes (si), RNAs de interferência U1 (U1i) e aptâmeros de RNA. Muitos deles foram identificados usando ensaios de co-transfecção transitória com um plasmídeo de expressão do HIV-1 e alguns avançaram para ensaios clínicos. Além das medidas de eficácia, pequenos RNAs foram avaliados quanto ao seu potencial de afetar a expressão de RNAs humanos, alterar o crescimento e/ou diferenciação celular e provocar respostas imunes inatas. Nos protocolos aqui descritos, é descrito um conjunto de ensaios de transfecção transitória projetados para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA direcionadas a etapas pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1. Usamos esses ensaios para identificar novas ribozimas e otimizar o formato de shRNAs e siRNAs direcionados ao RNA do HIV-1. Os métodos fornecem um conjunto rápido de ensaios que são úteis para rastrear novos RNAs anti-HIV-1 e podem ser adaptados para rastrear outros inibidores pós-integração da replicação do HIV-1.

Introdução

Uma limitação dos actuais tratamentos do HIV-1 é que eles devem ser cronicamente administrado para prevenir a progressão da doença. Transplantação de VIH-1 resistente a linfócitos T, ou células-tronco hematopoiéticas, tem o potencial para proporcionar um controlo de longa duração de replicação do HIV-1 na ausência do tratamento medicamentoso 1,2 e pode também ser uma abordagem eficaz para atingir uma cura de HIV-1 3. Uma maneira de tornar as células resistentes ao HIV-1 é a replicação para inserir um ou mais genes que codificam para anti-HIV-1 RNA ou péptidos em células de um indivíduo infectado durante um transplante autólogo 4. Vários genes candidatos anti-VIH-1 foram concebidos com alguns estudos clínicos que entram em combinações de dois ou três 5 6, para prevenir o desenvolvimento de resistência do HIV-1 para um único gene.

Anti-HIV-1 RNA estão entre os principais candidatos para a terapia de combinação de genes devido ao seu baixo potencial para provocar respostas imunes e porquesão transcritas a partir de sequências de genes muito curtos. Alguns-HIV-1 anti RNAs foram projetados para direcionar entrada e de integração viral. No entanto, a maioria dos ARNs anti-HIV-1 como alvo passos pós-integração no ciclo de vida viral (Figura 1). Inibidores pós-integração incluem RNAs de engodo, tendo como alvo os HIV-1 proteínas reguladoras Tat ou Rev 1, e RNAs à base de anti-senso, tendo como alvo locais diferentes em HIV-1 RNA, como as ribozimas 7, 8 e shRNAs U1i RNAs 9. Os métodos que foram utilizados para comparar a eficácia dos anti-HIV-1-RNA incluem a monitorização de replicação virai nas células transduzidas com genes que codificam para os ARN candidatas e medindo a produção virai em células transitoriamente transfectadas com plasmídeos que expressam os ARN candidatas e um plasmídeo de expressão de HIV-1 10 -13. Nós já usou um ensaio de produção HIV-1 para a tela HIV-1 RNA para sites de destino nova ribozimas 13-15. Estes métodos já foram refinados para optimizar o formato de um ARNmolécula de interferência expressa a partir de DNA de plasmídeo como um shRNA ou entregue como um siARN sintética 16. O ensaio mede a produção de vírus maduras a partir de células 293T de rim embrionário humano (HEK), e pode ser usado para comparar os efeitos dos inibidores que têm como alvo as etapas de pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1 (Figura 1). Para os inibidores que têm como alvo as etapas de pré-integração, ensaios alternativos, tais como um ensaio de infecciosidade de células TZM BL-17 são necessários para avaliar a eficácia antiviral.

As principais preocupações de segurança para a entrega de anti-HIV-1 RNA na clínica incluem potenciais efeitos fora do alvo em RNAs humanos ou proteínas, e ativação de sensores imune inata. Para avaliar a toxicidade do anti-HIV-1 siRNAs, utilizou-se um ensaio de viabilidade celular em diferentes linhas celulares 16. Nós também medido activação dos sensores imunes ARN de cadeia dupla, ARN activada proteína quinase R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), bem como expressão do gene de interferão estimulada, p150 ADAR1. Estes ensaios podem ser utilizados para confirmar que a eficácia do anti-HIV-1 RNA não é devido aos efeitos indirectos sobre a viabilidade celular ou a activação do sensor imune. Eles são também úteis na exclusão com RNAs candidatos potenciais toxicidades de desenvolvimento posterior.

Nos seguintes protocolos, os procedimentos para identificar novos RNAs terapêuticos e optimizar o formato das existentes são descritos. Os métodos são úteis para inibidores pós-integração baseadas em ARN rastreio de HIV-1 da replicação e pode ser adaptado para o rastreio de outros inibidores pós-integração, tais como pequenas moléculas de direccionamento Rev exportação mediada por ARN viral 18 ou CRISPR / sistemas Cas concebidos para direccionar integrada HIV-1 DNA 19.

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Protocolo

1. Células e transfecções

  1. Culturas de células HEK 293T em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Prepara-se uma suspensão de 2 x 10 5 células / mL no meio de cultura celular. Adicionar 500, 100 e 1.000 mL da suspensão de células a cada poço de 24 poços, 96 poços e 12 poços placas, para a produção virai, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente (Figura 2A).
  2. Agite suavemente as placas e incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2. Cultivar células a 50-70% de confluência.
  3. De acordo com um plano de transfecção, preparar diluições de ARN de teste e os controlos em tubos de 1,5 ml (micro exemplo, a Figura 2B).
    1. Para o ensaio de produção viral, preparar uma diluição de 10 ng / ul de um plasmídeo de expressão de HIV-1 e adicionar 10 uL a cada tubo. Próximo preparar 5 uM diluições de ARN de teste e um controlo negativo RNA. Adicionar 2,5 ou 10 ul de cada diluição de ARN de teste e de controlo negativo aos tubos correspondentes para 25 ou 100 nM de concentração final.
    2. Para o ensaio de viabilidade de células, preparar 5 uM diluições de ARN e um teste de 10 mg / ml de diluição do ARN de controlo positivo, de baixo peso molecular, poli I: C. Adicionar 2 mL de ARN de teste, ou de diluições de ARN controlo positivo para os correspondentes tubos de 100 nM ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente.
    3. Para o ensaio de activação imunitária, adicionar 20 ul de ARN de teste, ou de diluições de ARN de controlo positivo, preparado no passo 1.3.2. aos tubos correspondentes para 100 nm ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente.
      Nota: Para os plasmídeos de expressão de ARN de teste, preparar diluições de 10 ng / ul em vez dos 5 uM diluições de ARN de teste, dando quantidades finais de 25 e 100 ng para o passo 1.3.1. e 100 ng para etapas 1.3.2. e 1.3.3.
  4. Adicionam-se 50, 25 ou 75 ul de DMEM a cada tubo de transfecção para prod viralução, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente. Para os ensaios de produção virais, trazem células e tubos de transfecção preparados para a 3 (BSL3) laboratório nível bio-segurança antes da próxima etapa.
  5. Adicionar 2 ml da sequencialmente reagente de transfecção para os tubos de transfecção e incubar 15 min a 20 para permitir que os complexos de modo a formar. Ver a Tabela de Materiais para o reagente de transfecção específico a ser utilizado.
  6. Adicionar toda a mistura de transfecção de cada gota a gota, para as posições correspondentes nas placas de cultura de células micro tubo. Agite suavemente e incuba-se as placas durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
  7. Meça HIV-1 de produção (seção 2), a viabilidade celular (seção 3) e ativação imune (secção 4) nas placas de cultura de células (Figura 2C).

2. Ensaio de produção virai

  1. Remover as placas de cultura celular de 24 poços da incubadora e agitar suavemente as placas no interior da cultura de células BSL3capuz. Transferir 150 ul de sobrenadante de cada poço para um poço correspondente de uma placa de 96 poços de fundo plano, que vai ser utilizado para quantificar a produção de HIV-1.
    Nota: Os ensaios de quantificação virais mais comuns incluem a medição da expressão da proteína da cãpside de HIV-1 (p24) pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) 20, a quantificação de ARN viral por transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) 21 e medindo a actividade da enzima RT HIV-1. Passos 2.2 a 2.5 explicar métodos para quantificar HIV-1 actividade RT 13,15,16.
  2. Transferência de 5 ul de sobrenadante para poços correspondentes de uma placa de 96 poços, contendo 25 ul de uma perturbação viral cocktail 15 (Tabela 1). Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente e transferir a placa para uma estação de trabalho radioactividade.
    Nota: Passo 2.2. só é necessário se uma estação de trabalho de radioactividade que não está disponível no laboratório BSL3. Se as placas não precisam de ser removidos dolaboratório BSL3, vá para o passo 2.3. e adicionar 50 ul de radioactivos / viral cocktail ruptura (Tabela 1) em lugar dos 25 ul de coquetel radioactivos.
  3. Prepara-se uma radioactivos cocktail 15 (Tabela 1), e adicionar 25 ul a cada poço de sobrenadante viral e cocktail de interrupção. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 h.
  4. Ponto 5 uL da mistura de reacção sobre quadrados correspondentes de uma fibra de vidro Di Etil amino-etil (DEAE) de papel filtermat e deixar que as gotas para secar durante 10 min. Manchar a mistura de reacção em todos os outros quadrados de modo que não há duas amostras Boarder diretamente um ao outro. Isto ajuda a evitar o cruzamento entre amostras para determinar as contagens por minuto (cpm) no passo 2.6.
  5. Lavar os papéis 5x durante 5 min com tampão de 2x citrato de sódio salino (SSC) (Tabela 1), seguido por duas lavagens com um mínimo de 95% de etanol. Permitir que os papéis para secar e selá-los em sacos de amostras.
  6. Clip sacos de amostras containing do papel filtermat em uma fita e insira a cassete em um contador de cintilação de microplacas. Definir o contador para ler cpm de 32 P com a data de referência prevista para o lote de [32 P] dTTP utilizado na experiência. Selecionar quais amostras de ler usando o mapa da placa e iniciar o contador.
  7. Para qualquer método de quantificação viral, dividir os valores obtidos para cada teste de ARN pelo controlo negativo adjacente e multiplicar este valor por 100 para obter a percentagem de inibição da produção do VIH-1 para cada repetição dos ARN de teste. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste em diferentes concentrações é fornecido na Figura 3.

3. ensaio de viabilidade celular

  1. Remover as placas de 96 poços a partir da incubadora e adicionar 20 uL de 5 mg / ml de MTT (brometo de 3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazólio), diluído em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ( DPBS) a cada poço. Incubar as placas de fou 3 horas a 37 ° C.
  2. Adicionar 150 uL de isopropanol, acidificado com detergente (1% de NP-40, de HCl 4 mM em isopropanol) a cada poço e incuba-se as placas durante 2 horas à temperatura ambiente.
  3. Determinar a absorvância a 570 nm num espectrofotómetro de microplacas.
  4. Calcular o metabolismo de MTT relativo para cada ARN de controlo e de teste positivo, dividindo o valor obtido para cada amostra pelo seu controlo de transfecção adjacente. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecida na Figura 4.

4. Activação Ensaio Imunológico

  1. Remover as placas de 12 poços a partir da incubadora e aspirar o meio de cultura. Lavar suavemente as células duas vezes com DPBS e adicionar 70 ul de tampão de lise frio de 22 (incluindo os inibidores de protease e fosfatase, quadro 1) a cada poço. Incubar as placas durante 10 min em gelo.
  2. Transferir os lisados ​​celulares para micro tubos e rápido congelá-los por imersão dotubos em azoto líquido. Permitir que as amostras para descongelar e repetir por mais 2 ciclos de congelação descongelação para um total de 3.
  3. Centrifugar os lisados ​​durante 15 minutos a 4 ° C, 15700 x g, para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante para novos tubos de micro e determinar a concentração de proteína usando o método de azul de Coomassie (Bradford) 23,24.
  4. Resolver 75 ug de proteína de cada amostra num gel de poliacrilamida desnaturante a 10% e transferir para uma membrana de nitrocelulose como anteriormente descrito 25,26.
  5. Após electroforese e transferência para uma membrana, revelam bandas de proteína por incubação da membrana em Ponceau S (Tabela 1) durante 1 min seguido de lavagem em água destilada duas vezes. Use as bandas e escada proteína como um guia para cortar a membrana em 80 e 55 kDa.
    Nota: No passo 4.4 amostras pode ser executado em 16 x 18 cm 2 géis para baixo a 34 kDa, de modo que é fácil de cortar a membrana nas posições especificadas e não cortar através dabandas de interesse. Alternativamente, vários géis podem ser executados com as mesmas amostras para evitar o corte da membrana.
  6. Lavar a coloração de Ponceau S com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween 20 (TBST, Tabela 1). Adicionar TBST com leite não gordo a 5% para cobrir completamente as membranas. Incubam-se as membranas à temperatura ambiente com agitação durante 1 h.
  7. Incubam-se as membranas de O / N em TBST, com 3% de albumina de soro bovino (BSA) e anticorpos diluídos a 1: 1000 contra ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), para as peças de topo, meio e inferior da membrana, respectivamente.
  8. Lavam-se as membranas 5x durante 5 min com TBST e incubar em TBST com 5% de leite sem gordura e os anticorpos secundários anti-coelho de cabra marcado com peroxidase (diluído a 1: 5000) durante 1 h.
  9. Lava-se a membranas de 5x durante 5 min com TBST e aplicar a solução de electroquimioluminescência (ECL) para visualizar as bandas em películas de acordo as instruções do fabricante.
  10. Depois de visualizar as bandas de proteína sobre os filmes, lavar as peças do meio e inferior da membrana durante 10 minutos com uma solução de anticorpo de extracção. Incubam-se as membranas de o / n em TBST, com 3% de BSA e anticorpos contra PKR total de (a 1 em 500) e IRF3 (a 1 em 1000), para o meio e pedaços de fundo, respectivamente. Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho para a membrana PKR (meio).
  11. Lava-se a peça de fundo da membrana 5x durante 5 min com TBST e incubar a membrana em TBST, com 3% de BSA durante 1 hora com um anticorpo contra actina (diluído a 1: 5000). Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho. Um exemplo de resultados comparando diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecido na Figura 5. Veja a Tabela de Materiais para os anticorpos específicos a serem utilizados.

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Resultados

Um esquema geral dos processos é mostrado na Figura 2, com um plano de transfecção exemplo para três RNAs de teste e um ARN de controlo fornecida na Figura 2B. Para os ensaios de viabilidade celular de produção e virais, a leitura para cada construto de teste é normalizada para um controlo negativo. Os duplicados estão transfectadas em conjuntos, de modo que cada ARN teste é normalizado para o seu controlo negativo adjacente. Isto é feito para evitar dad...

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Discussão

O ensaio de produção de HIV-1 descrita foi realizada utilizando células HEK293T (Figura 2) e é semelhante para os ensaios utilizados para rastrear ARN de HIV-1 para ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, ARNsi 30, e U1i locais de ARN alvo 11,31. Usando diferentes métodos para quantificar a produção de HIV-1, a maioria dos estudos mediram a produção virai de 48 h após a co-transfecção de um plasmídeo de expressão do VIH-1 com RNAs candidatos. Após a produção do VIH-1...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O trabalho aqui apresentado foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (concede DCB-120.266, PPP-133377 e HBF-348967 para AG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicilina/Estreptomicina GibcoThermo Fisher15140-122
Placas de cultura de células, 96 poços, 24 poços, 6 poços.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubos AxygenCorning311-08-051
Baixo peso molecular Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01reagente de transfecção para RNAs sintéticos
TransIT-LT1MirusMIR 2300reagente de transfecção para plasmídeos de expressão de RNA
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
modelo de RNA poli(A) Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Contador de cintilação de microplacasPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Espectrofotômetro de microplacasBio-rad1706930
Comprimidos tampão de liseRoche4693159001, 4906837001inibidores de protease e fosfatase
MicrocentrífugaEppendorf5415R
Bradford reagenteBio-rad500-0006
Câmara de corrida em gelHoeferSE600
Célula de transferência semi-secaBio-rad1703940
Escada de proteínas EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Membrana de nitroceluloseBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Solução de remoção de anticorposMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher 
anticorpodo Dr. B.L. Bass
anticorpo fosfo-T446-PKRAbcamab32036
anticorpo fosfo-S396-IRF3Sinalização4947
Anticorpodo Dr. A. Hovanessian
Anticorpo IRF3Sinalização celular11904
Anticorpo de actinaMilliporeMAB1501
Anti-coelho de cabra marcado com peroxidaseKPL474-1506
Anti-rato de cabra marcado com peroxidaseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5
PI32106 ADAR1 celular PKR

Referências

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55(2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22(2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96(2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80(2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

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Reimpressões e permissões

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