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DOI:

10.3791/54487

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7 de outubro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Virginia

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo in vivo para medir a dorsiflexão do pé após estimulação do nervo fibular e contração do compartimento crural anterior do membro posterior do rato. Essas medições são uma ferramenta translacional indispensável para avaliar a patologia do músculo esquelético e as abordagens de engenharia de tecidos para reparo e regeneração muscular.

Resumo

Apesar da capacidade regenerativa do músculo esquelético, déficits funcionais e / ou cosméticos permanentes (por exemplo, perda de massa muscular volumétrico (VML), resultante de lesões traumáticas, doenças e diversas doenças congénitas, genéticas e adquiridas são bastante comuns. A engenharia de tecidos e tecnologias de medicina regenerativa têm enorme potencial para fornecer uma solução terapêutica. no entanto, a utilização de modelos animais biologicamente relevantes em combinação com avaliações longitudinais de medidas funcionais pertinentes são críticos para o desenvolvimento de melhores terapias de regeneração para o tratamento de lesões VML-like. a este respeito, um sistema de alavanca de músculo comercial pode ser usado para medir o comprimento, tensão, força e parâmetros de velocidade no músculo esquelético. Utilizou-se este sistema, em conjunto com uma potência elevada, estimulador bi-fase, para medir in vivo a produção de força em resposta à activação do compartimento crural anterior do o membro posterior de ratos. Temos Previamente usado neste equipamento para avaliar o impacto funcional de lesões VML no músculo tibial anterior (TA), bem como a extensão da recuperação funcional após o tratamento do músculo TA feridos com a nossa tecnologia de engenharia de tecidos de reparação do músculo (TEMR). Para tais estudos, o pé esquerdo de um rato anestesiado está firmemente ancorada a uma platina ligados a um servomotor, e do nervo fibular comum é estimulado por dois eletrodos de agulha percutânea para provocar a contração muscular e flexão dorsal do pé. A contração do músculo fibular do nervo induzido por estimulação é medida ao longo de uma gama de frequências de estimulação (1-200 Hz), para garantir uma eventual patamar na produção de força que permite uma determinação precisa da força tetânica máxima. Para além da avaliação da extensão da lesão VML, bem como o grau de recuperação funcional a seguir ao tratamento, esta metodologia pode ser facilmente aplicado para estudar diversas aspectos da fisiologia muscular e patofisiologia. Tal abordagem should ajudar com o desenvolvimento mais racional de terapias melhoradas para a reparação e regeneração muscular.

Introdução

Músculo esquelético tem uma capacidade intrínseca notável para reparação em resposta a lesão ou doença 1,2. Experimentalmente, a robustez desta resposta regenerativa tem sido bem documentada em modelos animais por estudar, por exemplo, o curso de tempo de danos do músculo esquelético, a regeneração e reparação depois da aplicação de miotoxinas (por exemplo, cardiotoxina) 3-7. Mais especificamente, após extensa lesão muscular induzida por cardiotoxina (38-67% de fibras musculares 8), a regeneração é mediada por células satélite, as células estaminais residentes que amadurecer para finalmente tornar-se fibras musculares funcionais 4,9-13. O resultado final é o aumento pós-danos regeneração funcional, o tecido muscular produtoras de força saudáveis 14-16. Embora os detalhes estão bem além do escopo deste relatório, o mecanismo de base para a regeneração muscular reflete os eventos cuidadosamente orquestrada de numerosos tipos de células de várias linhagens utilizando canoniCAL vias de sinalização crítica para o desenvolvimento tanto de tecidos e morfogénese 5,17-21. É importante ressaltar que a regeneração induzida por miotoxina está habilitado pelo fato de que a matriz extracelular, inervação neuronal e perfusão dos vasos sanguíneos permanecem estruturalmente intacta seguinte lesão muscular induzida por cardiotoxina 3,8,22. Em contraste, estas estruturas de tecidos e componentes principais são, por definição, totalmente ausente no contexto da lesão VML; onde a perda de Frank de tecido, devido a uma variedade de causas, resulta em défices funcionais e cosméticos permanentes 23-25.

Independentemente dos desafios adicionais associados com a reparação e regeneração muscular após lesão VML em comparação com lesão muscular induzida por miotoxina, uma melhor compreensão do mecanismo de base para a regeneração do músculo esquelético e reparação, em uma variedade de contextos, seriam bem servido por utilização de biologicamente modelos animais relevantes em combinação com um longitudinalssessments de medidas funcionais pertinentes. Tal como aqui discutido, os estudos sobre o membro posterior de rato proporcionam um excelente sistema modelo para este fim. Mais especificamente, os músculos do compartimento crural anterior (tibial anterior, extensor digitorum longus (EDL) e hallicus longus (HL)), que são responsáveis ​​pela flexão dorsal do pé, são facilmente identificadas e manipuladas. Além disso, eles são servidos por grandes vasos sanguíneos (ilíacas e ramos), e são inervados por nervos (ciático e filiais, incluindo peroneal) a todo o comprimento da perna 26-28. Como tal, pode-se utilizar o modelo de membro posterior de ratos para avaliar diretamente músculo esquelético função / patologia in vivo, ou para avaliar o impacto mais indireto de alterações relacionadas com a patologia nos vasos sanguíneos ou nervos na função muscular esquelética correspondente. Em qualquer um dos cenários, a gravidade da doença, bem como a eficácia do tratamento pode ser determinada como uma função da produção de força muscular (binário) e correspondente pé movement 29-34.

Idealmente, medidas de força são acompanhados por estudos histológicos e expressão gênica análises para avaliar com mais rigor o estado estrutural e molecular do músculo esquelético. histologia básica e imuno-histoquímica, por exemplo, são capazes de responder a perguntas sobre o tamanho do músculo, o alinhamento das fibras musculares, composição da matriz extracelular, localização de núcleos, número de celular, e localização de proteínas. A análise da expressão do gene, por sua vez, é necessária para a identificação dos mecanismos moleculares que podem influenciar / modulam a maturidade das fibras musculares, estados de doença, e actividade metabólica. Embora estes métodos fornecem informações cruciais, eles geralmente representam endpoints terminais, e mais importante, eles não conseguem abordar diretamente a capacidade funcional do músculo esquelético e, portanto, são correlativos em vez de causador. No entanto, quando os estudos histológicos e as análises de expressão de genes são avaliados em conjunto com MEASUR funcionalES, em seguida, os mecanismos de produção de força e a regeneração funcional pode ser identificado de forma mais precisa.

A este respeito, a força de produção de capacidades de um músculo pode ser medida in vitro, in situ ou in vivo. Todas as três abordagens têm vantagens e limitações. Em uma experiência in vitro, por exemplo, o músculo é completamente isolado e removido do corpo do animal. Ao eliminar as influências dos vasos sanguíneos e os nervos que alimentam o músculo, a capacidade contráctil do tecido pode ser determinada em um ambiente externo rigorosamente controlada 35. No teste muscular in situ permite que o músculo a ser isolado, como com preparações in vitro, no entanto , a inervação e suprimento de sangue permanecem intactos. A vantagem do modelo experimental in situ é que ele permite um músculo indivíduo a ser estudado, enquanto a inervação e fornecimento de sangue está perturbado minimamente 36. Em ambosin vitro e em experiências in situ, tratamentos farmacológicos podem ser aplicados mais directamente, sem ter que conta para os efeitos de quaisquer tecidos circundantes ou o impacto do sistema circulatório nas respostas contrácteis medidos 37. No entanto, em testes de função in vivo, tal como aqui descrito, é a técnica menos invasivo para avaliar a função do músculo no seu ambiente nativo 38, e pode ser realizada repetidamente ao longo do tempo (isto é, longitudinalmente). Como tal, será o ponto focal da discussão abaixo.

A este respeito, percutâneas eléctrodos inseridos perto do músculo de interesse, ou o nervo motor que serve isso, fornecer um sinal eléctrico para o músculo. Um transdutor seguida, mede o comprimento ou a força resultante alterações no músculo ativado como dirigidos por um protocolo de software personalizado predeterminado. A partir destes dados, podem ser determinadas as propriedades físicas do músculo. Estas incluem, porce-frequência, tétano máxima, força-velocidade, rigidez, comprimento tensão e fadiga. comprimento do músculo ou a força também pode ser mantido constante para que o músculo se contrai isometrically ou isotonicamente. Mais importante, estes protocolos experimentais podem ser realizados rapidamente, facilmente repetida, e customized- tudo ao mesmo tempo que o animal é anestesiado e com um período de recuperação de horas a dias. Um único animal pode sofrer em vigor vivo testando várias vezes, permitindo assim estudos longitudinais de modelos ou avaliação de plataformas terapêuticas / tecnologias de doença.

Tal como aqui descrito, um sistema de alavanca de músculo comercial em conjunção com uma alta potência, estimulador bi-fase é utilizado para executar em testes de função muscular in vivo para avaliar a contribuição do músculo tibial anterior do membro posterior de rato a flexão dorsal do pé através da estimulação de o nervo fibular. Nós desenvolvemos um protocolo que é especificamente desenhado para avaliar a medicina regenerativa / titecnologias de engenharia ssue para a reparação muscular após lesão VML traumática do rato músculo TA. Deve notar-se; a EDL e HL precisa ser dissecado para fora do compartimento crural anterior para avaliar especificamente o músculo TA (que representam cerca de 15-20% do torque total tibial anterior medido após a estimulação do nervo fibular (Corona et al., 2013) ). Como essa abordagem fornece uma análise longitudinal abrangente do músculo fisiologia / função, ele pode lançar importante visão mecanicista em vários outros tipos de investigações fisiológicas, bem como uma variedade de doenças ou áreas terapêuticas 39. Por exemplo, em testes de função do músculo vivo é aplicável a estudos de fisiologia do exercício, a isquemia / reperfusão pesquisa, miopatia, lesão do nervo / neuropatia e vasculopatia, sarcopenia, e distrofias musculares 40.

Protocolo

Todos os animais foram tratados com humanidade e todos os protocolos foram aprovados pela Universidade de Virginia IACUC.

1. Preparação Equipamento

  1. Certifique-se de que todas as máquinas estão conectados corretamente.
  2. Ligue o computador, seguido do estimulador bifásica de alta energia e um sistema de alavanca de modo duplo.
  3. Neste momento, colocar o animal na câmara de anestesia fornecido com isoflurano a 2%, e ligar o elemento de aquecimento de modo a que a plataforma é aquecida a 37 ° C.
  4. Colocar os eletrodos em 70% de etanol, para que dicas o politetrafluoretileno (PTFE) revestidos estão submersos e serão desinfectados ao configurar o dispositivo e software.
  5. Localize e abra o software de controle de sistema de alavanca no ambiente de trabalho.
    NOTA: Este será o software necessário para realizar testes funcionais.

Setup 2. Software

  1. Uma vez que o programa é aberto (Figura 1A), alterar o parâmetros para Stim instantâneo no menu de configuração para os valores desejados.
    NOTA: Neste protocolo, todos os parâmetros permanecem em níveis predefinidos, com excepção de "Run Time (s)", que é alterado para 180 segundos (Figura 1B).
  2. Criar uma pasta Autosave sob o menu de configuração.
  3. Localize uma janela de tipo capaz rotulado de "salvamento automático Base". Insira o nome da amostra, por exemplo "Rat1-date-timepoint". Diretamente à esquerda da janela do tipo capaz de "salvamento automático Base", clique na caixa "Ativar salvamento automático."
  4. Na parte superior da tela de controle, selecione "Sequencer". Uma nova janela se abrirá. Na parte inferior da nova janela, selecione "Sequência Open". Uma nova janela se abrirá. Selecione a sequência de premade e clique em OK. A lista de protocolos com os parâmetros de sequência, incluindo a frequência, duração dos estímulos, e tempo de descanso irá desenvolver na janela com o nome: editor de sequência (Figura 1C). Clique em "Sequence Load" -> & #34; Close Window ".
  5. Para ver em tempo real atual e estímulo, selecione "File" -> "Data Monitor Live". Uma nova janela se abrirá.
  6. Na nova janela Live Data, a tela de formato para o teste usando a função de escala automática, ou inserir manualmente os valores de y máximo e mínimo mostrados na tela.

3. animal Set-up

NOTA: Todas as medidas de força são as de um 11 semanas de idade ratos Lewis. Existe uma correlação linear entre a massa muscular e produção de força (em Newtons). Portanto, como a idade do rato aumenta, os valores de força produzida pela perna deve aumentar também.

  1. Assegure-se que o animal se encontra no plano de anestesia adequada antes de o retirar da câmara de anestesia. Remover completamente todos os pêlos na face lateral entre o tornozelo e da pelve da perna experimental utilizando uma máquina de cortar cabelo elétrica.
    NOTA: O plano de anestesia adequada é obtida quando o i animaisé não-responsivos a uma pitada dedo do pé. É necessário seguir as orientações apresentadas por Comitê Animal Care e Use de cada instituição.
  2. Colocar o animal em decúbito dorsal, garantindo o nariz do animal é firmemente no cone anestesia nariz para que ele permaneça na profundidade suficiente de anestesia.
  3. Regular a posição do pedal do aparelho por três botões independentes (Figura 2). Usando o botões (A e B) para ajustar o pedal, colocar o aparelho de pedal na sua posição mais à esquerda e mais baixa, respectivamente. Isto irá permitir o correto posicionamento do pé do animal, deixando espaço para manipulações posteriores. Nesta posição, utilizar o botão do lado esquerdo da faixa para mover o aparelho para perto ou para mais longe do experimentador modo que a perna animais assenta num plano direito.
  4. Limpar a perna com três mudanças de iodo e álcool. O iodo deve permanecer na perna durante 30 seg.
  5. Ajustar o animal ou plataforma(Figura 2A, D) de modo que a perna estendida assegura o contacto completo entre a sola do pé e o pedal de pé.
  6. Usando fita adesiva médica, proteger o pé do animal contra a placa de pé (Figura 2D). É crucial que o calcanhar é nivelado contra a parte inferior do pedal e todo o pé é plana e não irá desalojar a partir da placa durante o teste.
  7. Localizar o mecanismo de fixação para estabilizar a perna. Empurre o pino estabilizador no longe o suficiente para reduzir o movimento da perna e fixá-la no lugar, girando a chave Allen.
  8. Nesta posição, o botão de usar C para mover o aparelho para perto ou para longe do experimentador para que o tornozelo, a tíbia e fémur mentira em linha recta (Figura 2C). Certifique-se de que a perna seja paralelo com o pedal de pé. Fazer ajustes no campo e botões finos encontrados na parte de trás do aparelho, a mover-se lentamente o tornozelo, de modo que o pé e a tíbia estão em uma posição de 90 °.
  9. continue para mover a perna para que o fémur ea tíbia estão em um 90 graus ângulo perpendicular (Figura 2B). Neste ponto, o animal está pronto para os eléctrodos.

4. colocação dos eletrodos

  1. Ative "Stim instantânea", clicando no botão laranja rotulada "Stim instantânea".
  2. Colocar os dois eléctrodos superficialmente sobre a extremidade proximal do tibial anterior e mover as pontas dos eléctrodos em volta até picos são observados no monitor vivo. Idealmente, os picos deve ser em torno de 0,4 N.
    NOTA: Os eléctrodos deve ser colocado adjacente e ortogonal ao plano do nervo peroneal, que por sua vez, corre lateralmente a partir do joelho e perpendicular à tíbia.
  3. Inserir uma agulha longe o suficiente para derme Pierce, e apenas na camada muscular. Mova o outro eletrodo ao redor até picos são vistos no monitor ao vivo cerca de 0,6 agulhas N. Insira e prenda-os no lugar usando uma braçadeira hobby ou fita adesiva médica.
  4. UMAdjust ajustes finos e grossos para encontrar saída de força máxima.
  5. No estimulador bifásica de alta potência, haverá dois botões no centro. Uma é rotulado de "GAMA" eo outro "AJUSTE". Gire o botão "RANGE" para a corrente máxima desejada.
    NOTA: Os picos irá aumentar lentamente em magnitude, e a intensidade da corrente máxima é determinada como o nível no qual três estimulações consecutivas resultar em respostas contrácteis idênticos. Resista transformando a amperagem maior do que o necessário; a amperagem máxima vai estimular todo o músculo se contraia, mas qualquer corrente mais elevada resultará no recrutamento dos músculos vizinhos e antagonistas potencialmente bem.
  6. Gire o botão "AJUSTE" para definir a percentagem do "RANGE" que será usado para estimular o músculo. Neste ponto, a força deve ler-se em cerca de 1,0 N. Isto pode requerer um aumento ou diminuição na corrente.
  7. Verifique novamente os eletrodos para se certificar de que eles são seguros. PareStim instante.
  8. Na janela "Live Data", clique em "Start Sequence".
  9. Continuar a acompanhar as curvas, indo de volta para o ecrã de controlo, e clicando no botão "Análise", localizado acima da laranja "Stim instantânea" botão. A curva tetânica deve começar a tomar forma em torno da estimulação 60 Hz.

5. Acabamento Estimulação e Clean Up

  1. Depois da sequência de terminar, retire os eletrodos e limpe com álcool a 70%. Colocar os eletrodos nas tampas.
  2. Solte a braçadeira do joelho e desligue a anestesia. Remover o animal a partir do gás anestesia e colocar o animal em decúbito ventral, ainda na almofada de aquecimento. Manter o rato em 100% O 2 durante alguns minutos após o gás isoflurano foi desligado para manter o rato oxigenado. O animal pode mover-se, inicialmente, mas não devolver o animal de volta para a jaula até que o animal recupere a consciência. Se a dor muscular é notadoapós a recuperação, deve ser dada uma dose de AINE conforme especificado pelo seu comitê de cuidados com os animais.
  3. Desligue todos os equipamentos listados na etapa 1.2, feche o software, e continuar a análise dos dados.
  4. Limpe a plataforma e pé pedal.

Análise 6. Os dados

NOTA: A análise dos dados é feita para caber uma sequência projetada por este laboratório e de acordo com protocolos de laboratório. valores de análise, os pontos de importância de dados e outros aspectos do procedimento irá mudar dependendo da intenção do usuário.

  1. Abra o software de análise de dados.
  2. Clique no menu High Throughput para permitir a análise de vários arquivos de dados (amostras) de cada vez. Selecione "Força Frequency" Análise.
  3. Clique no botão "Escolher arquivos" e abrir tantos arquivos de dados salvos como desejado.
  4. Selecione "Manual" na caixa de Cursor método de colocação.
    NOTA: Isto irá permitir que o usuário para analisar toda a datum dentro de um marcador de tempo desejado, em oposição ao programa seleccionar automaticamente a localização análise.
  5. Altere o valor timestamp End Cursor para 2. Clique no botão "Analisar" (Figura 1D).
  6. Para salvar a tabela e analisar os dados usando uma planilha, clique no botão "Salvar tabela botão para ACSII. Isto irá salvar o arquivo, e pode ser aberto com uma planilha em um momento posterior.
  7. Abra o arquivo de dados salvos na planilha.
  8. Criar uma coluna adicional denominada "máxima absoluta", e determinar a diferença entre a linha de base e os valores máximos para cada amostra. Isto irá fornecer a força máxima total produzida em cada frequência.
  9. Para determinar o torque, multiplicar cada valor de força por o comprimento do braço de alavanca.
    NOTA: neste caso, que pode ser representado pelo comprimento do pé do animal. Este protocolo utiliza o valor médio determinado experimentalmente de 30 mm. O usuário tem determinado agora os valores para o mabinário ximum produzida em cada frequência.
  10. Represente graficamente estes valores como uma curva de frequência de binário, ou, o binário máximo produzido pelo animal através de todas as frequências de estimulação.
    NOTA: Este pode ser identificados e utilizados como um único ponto de comparação entre amostras.

Resultados

A curva tetânica podem ser utilizados para distinguir os melhores resultados a partir de resultados sub-óptimos. Esta curva geralmente começa a formar a uma frequência de 60 Hz. O factor chave para a obtenção de bons resultados, é a capacidade de estimular o músculo de modo que ele produz a sua força máxima e mantém a força que durante o tétano. A curva ideal deve ter, de uma ascensão ininterrupta afiado, vertical, no momento da estimulação, seguido por uma fase de plateau plana com oscilações mínimas, e, um período ininterrupto diminuição acentuada vertical no término da estimulação (Figura 4). Desvios da curva ideal indícios de que o músculo está cansado (Figura 5D) ou que o músculo não está a ser devidamente estimulado a produzir força máxima (Figura 5B - C). Este último geralmente resulta da colocação de eletrodos incorreta levando à insuficiência do recrutamento máximo de fibras musculares durante a estimulaçãoção. Uma característica distintiva que permite ao investigador para determinar se uma curva não-ideal é o resultado da colocação do eléctrodo incorrecta ou alterações patológicas para o músculo é se ou não a curva tetânica é completa (fundido) ou incompleta (não fundido). Um, curva tetânica incompleta não fundido indica que os eléctrodos são extraviado, resultando no músculo não tendo uma contracção máxima. Um exemplo de uma alteração patológica no músculo pode ser observado como uma diminuição da contração máxima, em comparação com o controlo, ou uma resposta contráctil que cansa mais rapidamente.

Os três tipos diferentes de picos obtidos no decurso deste procedimento representar diferentes posições de eléctrodos e da perna e pode ser visto na Figura 3. Os primeiros picos será de cerca de 0,4 N e ocorrem quando a colocação do eléctrodo correcta é determinada superficialmente sobre a pele (Figura 3A). O segundo conjunto de picos tem hamplitude de grau superior, geralmente em torno de 0.5-0.6N (Figura 3B) e ocorrem quando os eléctrodos perfurar através da derme. Após estes são obtidos, a perna e o pé são ajustadas para maximizar a produção de força, a qual é obtida quando o pico de amplitude aumenta para aproximadamente 1N ou maior (Figura 3C). Neste ponto, Instant Stim pode ser desligado e a sequência pode começar. Essas diretrizes garantir resultados precisos e reprodutíveis e são checkpoints-chave em todo o protocolo.

Os resultados finais pode ser representado de diversas maneiras, dependendo da informação que o utilizador extraiu-se a partir do teste de força e do desenho experimental. Neste protocolo, a força máxima é medida através de todas as frequências de estimulação, no entanto outros pontos de dados pode ser importante para um determinado pesquisador ou aplicação. Um exemplo é a frequência de estimulação em que a curva tetânica começa a tomar forma. Tele dados podem ser comparados com outros resultados obtidos a partir de uma experiência anterior ou posterior no mesmo animal, ou para as comparações entre os diferentes grupos de tratamento. produção de força pode ser normalizado pela massa corporal para calcular a força isométrica e fornecer uma avaliação mais imparcial do impacto da idade sobre a contração máxima observada. Embora os animais de diferentes peso corporal e idade vai produzir várias forças máximas, a forma da curva tetânica deve ser consistente entre todos os grupos, quando o procedimento é realizado correctamente.

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Figura 1: Resumo das funções do sistema de alavanca e software de análise de dados para análise (A) Visão geral do software de controle ao abrir o programa.. (B) Parâmetros para "Stim instantânea." (C) sequência Exemplo para a estimulação força-freqüência. (D ) Os dados representativos de uma análise de frequência força de alto rendimento no software de análise. Note-se que o procedimento de análise de exemplo sequência e dados é específico para este protocolo e não representam toda a gama de sequências e saídas que são fornecidos por este software. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Aspectos Críticos para o posicionamento do Rato eo posicionamento do pé no aparelho (A) O rato está em uma posição supina com o pé esquerdo, firmemente agarrado à platina.. Os ângulos retos feitas pelo pé, perna e coxa são circuladas. (B) O ângulo direito criado pelo tornozelo é realçado. (C) A perna deve ser alinhados em um plano direto do pé para o corpo. (D) A colocação do eletrodo é paralelo e perpendicular ao plano do nervo peroneal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Picos representativos demonstrando a importância da correta colocação de eléctrodos para máxima força pico de produção respostas tetânica linha de base (A) observados com eletrodos colocados muito superficialmente.. (B) picos maiores, com eletrodos inseridos no lugar correto. (C) A transição de picos maiores de sinalização colocação do eletrodo correto para óptima pré-sequência de amplitude de pico, como as posições das pernas e dos pés são perfeitamente ajustados./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4:. Curve tetânico Optimal a 100 Hz Esta curva aumenta e diminui de forma acentuada e tem uma fase de planalto. Este exemplo indica a colocação do eletrodo correto e estimulação força máxima. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5:. Exemplos representativos de Curves tetânicas Sub-ótima obtida a 100 Hz (a) após relaxamento, essa curva cai abaixo da linha de base. Isto é indicativo de estimulaçãode antagonistas. (B - D) Estes gráficos são o resultado da colocação de eletrodos imprópria e recrutamento desigual das fibras musculares. As fases de planalto demonstram grandes oscilações (B), uma inclinação ascendente (C), ou uma inclinação para baixo (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo demonstra um método relativamente simples para a realização de testes em função do músculo in vivo no compartimento crural anterior do membro posterior de rato. Outras formas de teste de função muscular, incluindo ex vivo e in situ protocolos, também pode fornecer informações importantes sobre a fisiologia muscular. No entanto, o significado da in vivo testes de função reside na sua natureza não invasiva, eo fato de que ele recapitula de forma mais precisa os mecanismos endógenos de estimulação muscular. Para tanto ex vivo e em ensaios in situ, o tendão e / ou músculo estão expostas, e, por conseguinte, devem ser mantidas húmidas ou submerso 41,42. Ensaios in vivo remove variáveis de confusão de trauma e inflamação que podem ser provocadas por procedimentos cirúrgicos necessários no teste de função muscular situ; isso é especialmente importante se o objetivo do experimento é investigar os processos inflamatórios e celulares 43. Além disso, os ensaios in vivo requer pouca habilidade cirúrgica como o músculo não é isolada do seu ambiente e não requer nós precisos para reduzir músculo / tendão de deslizamento (como é o caso de testes in situ ou ex vivo) 41. Além disso, com a prática suficiente, a velocidade da colocação do eletrodo correto e a capacidade de rapidamente fazer ajustes para alcançar a produção de força máxima do músculo irá garantir que a conclusão do protocolo é rápida e reproducible- tanto dentro animais e entre diferentes usuários do mesmo equipamento 39 . É benéfico para começar com uma avaliação de todo o componente crural anterior tal como ilustrado, antes da excisão dos músculos sinérgicos menos acessíveis (EDL e HL) para investigação mais directa do músculo TA. Usando essa abordagem, pode-se muito rapidamente conseguir o domínio da técnica. Enquanto o processo aqui descrito demonstra e destaca a utilidade de uma força Frprotocolo equency para induzir tétano e determinar a força máxima produzida por um músculo, os usuários devem determinar o tipo (s) de teste funcional que melhor informar a sua experiência específica (s) e objetivos de pesquisa.

Existem vários passos críticos que devem ser cuidadosamente realizada, a fim de garantir resultados experimentais óptimas e reprodutíveis, isto é, a produção da força máxima consistente pelo músculo para uma variedade de parâmetros de estimulação. Várias das principais características estão descritas na Figura 2. No entanto, a colocação ea estabilidade do eletrodo estimulando adequada é um pré-requisito absoluto para estimulação máxima reprodutível do nervo peroneal. A este respeito, os eléctrodos devem ser colocados superficialmente. Isto é, se a colocação do eléctrodo é muito profundo, uma arrisca estimulação eléctrica directa dos músculos antagonistas, diminuindo, assim, a magnitude da resposta contráctil observada do compartimento crural anterior. Além disso, odois eléctrodos deve ser colocado na proximidade de uns com os outros quanto possível para reduzir a resistência eléctrica da pele e do tecido conjuntivo circundante. Em geral, posicionamento dos eletrodos perto do joelho e medial da perna rastreamento diretamente à beira do tibial anterior para onde ele se encontra com o gastrocnêmio, muitas vezes produz a produção de força adequada. Isto também assegura que os eléctrodos estão colocados adjacentes e ortogonais ao plano do nervo peroneal, que por sua vez, se estende perpendicularmente à tíbia e lateralmente para baixo da perna abaixo do joelho. No entanto, a variabilidade natural em anatomia entre animais requer vigilância constante para garantir que a colocação do eletrodo é otimizado em base caso-a-caso. Como tal, há um certo nível de tentativa e erro relacionado com a colocação do eléctrodo que é significativamente diminuída pela experiência do utilizador. O número de vezes que os eléctrodos de perfurar a pele deve ser minimizada para reduzir o inchaço e a inflamação, que me diminuiprodução de força asured. Isto é dependente de onde as agulhas são colocadas inicialmente, mas recomenda-se para mover as agulhas de duas vezes ou menos particularmente na área ao redor da rótula. Finalmente, uma vez que os eléctrodos são colocados na perna do animal, pequenos ajustes podem ser feitos para o posicionamento da perna e da corrente fornecida através dos eléctrodos. Isto deve ser feito durante o monitoramento simultâneo a força produzida a partir de uma única contração. Além disso a colocação do eléctrodo, adaptações também podem ser feitas para a tensão fornecida através dos eléctrodos. No entanto, na configuração descrita aqui, é importante ter cuidado quando se aumenta a tensão, como uma maneira para aumentar a produção de força, porque o aumento de tensão irá estimular os nervos que inervam músculos antagonistas.

Há três preocupações técnicas fundamentais que devem ser monitorados para garantir que a colocação do eletrodo mantém adequada. Em primeiro lugar, o pé do animal anestesiado deve ser firmementeancorada ao aparelho de pedal, o qual mede a produção de força muscular (Figura 2). Se o pé não está firmemente ancorada, a verdadeira força produzida pelo músculo pode ser incompleta traduzido para o transdutor de força. Fixação instável pé também apresenta o risco de perder o posicionamento ideal dos eléctrodos como o movimento para além contracção muscular normal (ou seja, o pé afastando-se da platina) pode causar o deslocamento dos eléctrodos a partir de sua posição superficial ou desalojar-los completamente. Ambos os cenários irá diminuir a força medida. Em segundo lugar, o corpo do animal deve ser completamente supina e alinhados num plano direito (Figura 2). O posicionamento correto do corpo animais impede ligeiros movimentos da perna devido à respiração, e também minimiza a torção da perna e da pelve, permitindo um melhor posicionamento e contínuo contato dos eletrodos estimulantes. Em terceiro lugar, o posicionamento correto e ancoragem do joelho é critical para assegurar que a perna permanece constante, e assim, ajuda a estabilizar o posicionamento ideal dos eléctrodos estimulantes para permitir a activação consistente do nervo peroneal.

Existem alguns pontos adicionais que devem ser enfatizados. Em primeiro lugar, o sistema de alavanca músculo comercial é concebido para realizar testes sobre a perna esquerda, no entanto, a configuração pode ser modificada para realizar testes sobre a perna direita, bem. Em segundo lugar, os sistemas de alavanca de músculo pode ser escolhido com base no tamanho do animal, de modo que os utilizadores devem assegurar que a plataforma utilizada é adequada para medir e suportar a força produzida pelo modelo animal de escolha. músculos testáveis ​​para a plataforma equipamentos são limitados aqueles que induzem a extensão plantar ou dorsiflexão do pé. Em terceiro lugar, ele deve novamente ser enfatizado que a colocação do eletrodo pode ser desafiador e requer paciência e prática para dominar a técnica. Eletrodos também tornar-se aborrecido rapidamente com o uso regular, por isso, é útil ter várias s peçasets por uma vez torna-se difícil para picar a pele superficialmente. Em terceiro lugar, o protocolo descrito no presente relatório utiliza sequências de estimulação e procedimentos específicos de análise de dados. A alavanca do músculo software de controle de sistema e de dados software de análise e os dados que ele fornece podem responder a muitas outras questões experimentais e, portanto, sua utilidade se estende para além do que é aqui descrito. Como tal, os usuários são encorajados a explorar além dos limites do protocolo (s) de software apresentado neste artigo. Apesar destas limitações menores, em testes de função muscular in vivo é uma abordagem poderosa para determinar a capacidade de saúde e contrátil do músculo esquelético, porque é minimamente invasivo e pode ser realizada em várias ocasiões, ao longo de um período de tempo prolongado, no mesmo animal. Em suma, este tipo de utilitário reparadas torna o sistema particularmente hábeis em testar os efeitos de novas terapias para lesão do músculo esquelético ou doença no membro posterior de rato.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à Dra. Hannah Baker por seu extenso trabalho na otimização desse procedimento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IsothesiaHenry Schein Animal Health05260-04-04
Isoflurano Vaporizador-Funil de EnchimentoVeterinário Equipar911103
Adaptador de Entrada para VaporizadorVeterinário Equipar911124
Adaptador de Saída para VaporizadorVeterinário Equipar911125
Máquina de Anestesia de MesaVeterinário Equipar901801
Gás oxigênio comprimidoPraxairN/A
VaporGuard Filtro de Carvão AtivadoVet Equipar931401
T/Bomba Aquecedor de água profissionalStrykerN/Adefinido em Terapia Contínua Tempo a 38/100 para temperatura
Transpore Fita Cirúrgica3M1527S-1rasgar ao meio para fazer tiras mais finas
A5 Golden animal clippersOster078005-050-002
Solução de iodopovidonaAplicare82-227K
Cotonetes
200 laboratórios Deconà prova de etanol diluídos a 70% com aplicadores com ponta de algodão de água deionizada
Puritan836-WC
Eletrodos revestidos de Teflon-Eletrodo de agulha monopolarChalgren Enterprises111-725-24TP
servomotorCambridge TechnologyModelo 6650LR
Sistema de Alavanca de Modo DuploAurora Scientific IncModelo 305C-LR-FPentre em contato com o fabricante para solicitar a
InterfaceSinal Aurora Scientific IncModelo 604A
Estimulador Bifásico de Alta PotênciaAurora Scientific IncModelo 701C
Análise de dados softwaresoftware Aurora Scientific IncDMAv5.110 software
de controle do sistema de alavanca muscularSoftware Aurora Scientific IncDMCv5.400 software
de álcool de

Referências

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