We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.
Trots den regenerativa kapaciteten hos skelettmuskel, permanenta funktionella och / eller kosmetiska underskott (t.ex. volymetriska muskel förlust (VML) till följd av traumatisk skada, sjukdom och olika medfödda, genetiska och förvärvade villkor är ganska vanligt. Tissue engineering och regenerativ medicin teknik har en enorm potential att ge en terapeutisk lösning. Men användningen av biologiskt relevanta djurmodeller i kombination med längsgående bedömningar av relevanta funktionella åtgärder är avgörande för utvecklingen av förbättrade regenerativa terapier för behandling av VML-liknande skador. i detta avseende ett kommersiellt muskel hävstångssystem kan användas för att mäta längden, spänning, kraft och hastighetsparametrar i skelettmuskel. Vi använde detta system, tillsammans med en hög effekt, bifas stimulator, för att mäta in vivo-kraft produktion som svar på aktivering av den främre crural utrymmet i råttan bakben. Vi har PREVígare använt denna utrustning för att bedöma den funktionella effekten av VML skada på tibialis anterior (TA) muskler, liksom omfattningen av funktionell återhämtning efter behandling av de skadade TA muskeln med vår vävnadstekniska muskelreparation (TEMR) teknologi. För sådana studier är den vänstra foten av en nedsövd råtta säkert förankrad vid en fotplatta kopplad till en servomotor, och den gemensamma peronealnerven stimuleras av två perkutan nålelektroder att framkalla muskelsammandragning och dorsalflexion av foten. Peronealnerven stimulering-inducerad muskelsammandragning mäts över ett område av stimuleringsfrekvenser (1-200 Hz), för att säkerställa en eventuell platå gällande produktion som gör det möjligt för en noggrann bestämning av topp tetanic kraft. Förutom utvärdering av omfattningen av VML skada samt graden av funktionell återhämtning efter behandling, kan denna metod lätt tillämpas för att studera olika aspekter av muskelfysiologi och patofysiologi. Ett sådant tillvägagångssätt should hjälpa till med mer rationell utveckling av förbättrade läkemedel för muskel reparation och förnyelse.
Skelettmuskel har en anmärkningsvärd inneboende kapacitet för reparation som reaktion på skada eller sjukdom 1,2. Experimentellt har robusthet denna regenerativa svar är väl dokumenterade i djurmodeller genom att studera till exempel tidsförloppet av skelett muskelskada, reparation och återhämtning efter applicering av myotoxins (t.ex. cardiotoxin) 3-7. Närmare bestämt, efter omfattande cardiotoxin-inducerad muskelskada (38-67% av muskelfibrer 8), är regeneremedieras av satellitceller, de inhemska stamceller som mogna att slutligen bli funktionella muskelfibrer 4,9-13. Slutresultatet är en ökad efter skada funktionell regenerering av friska, kraftproducerande muskelvävnad 14-16. Även om detaljerna är långt utanför ramen för denna rapport, den mekanistiska grunden för muskelregenere speglar noggrant iscensatt händelser för många celltyper från flera linjer utnyttjar canonical signaleringsvägar avgörande för både vävnadsutveckling och morfogenes 5,17-21. Viktigast är myotoxin-inducerad regeneremöjliggörs av det faktum att den extracellulära matrisen, neuronal innervation och blodkärls perfusion förblir strukturellt intakt efter cardiotoxin-inducerad muskelskada 3,8,22. I skarp kontrast, dessa viktiga vävnadsstrukturer och komponenter är per definition helt frånvarande i samband med VML skada; där frank förlust av vävnad, på grund av en mängd olika orsaker, resulterar i permanenta funktionella och kosmetiska underskott 23-25.
Oberoende av ytterligare utmaningar i samband med muskel reparation och regenerering efter VML skada i jämförelse med myotoxin framkallad muskelskada, ökad förståelse av den mekanistiska grunden för skelettmuskel förnyelse och reparation, i en mängd olika sammanhang, skulle tjänas väl genom utnyttjande av biologiskt relevanta djurmodeller i kombination med längd enssessments av relevanta funktionella åtgärder. Såsom diskuteras häri, studier av råttan bakben ger en utmärkt modellsystem för detta ändamål. Mer specifikt, musklerna i främre crural facket (tibialis anterior, extensor digitorum longus (EDL) och hallicus longus (HL)), som ansvarar för dorsalflexion av foten, lätt identifieras och manipuleras. Dessutom är de betjänas av större blodkärl (höft och grenar), och innerveras av nerver (ischias och grenar, inklusive peroneal) kör längden av benet 26-28. Som sådan, kan man använda råtta bakbenen modell för att direkt bedöma skelettmuskelfunktion / patologi in vivo, eller för att utvärdera mer indirekta effekterna av patologirelaterade förändringar i blodkärl eller nerver på motsvarande skelettmuskelfunktion. I båda fallen kan sjukdomens svårighetsgrad, liksom effekten av behandlingen bestämmas som en funktion av muskelstyrka produktion (vridmoment) och motsvarande fot movement 29-34.
Helst är kraftmätningar tillsammans med histologiska studier och analys av genuttryck till striktare utvärdera den strukturella och molekylära status skelettmuskulaturen. Grundläggande histologi och immunohistokemi, till exempel, kan svara på frågor om muskelmassa, muskelfiberinriktning, extracellulära matriskomposition, placering av kärnor, cellantal och proteinlokalisering. Genuttryck analys, i sin tur, är nödvändig för att identifiera de molekylära mekanismer som kan påverka / modulerar mognad muskelfibrer, sjukdomstillstånd och metabolisk aktivitet. Även om dessa metoder ger viktig information, de i allmänhet representerar terminal endpoints, och viktigast, inte de direkt ta itu med funktionsförmåga i skelettmuskulaturen, och därmed är korrelat snarare än orsak. Men när histologiska studier och analys av genuttryck utvärderas i samband med funktionell measures alltså mekanismer force produktion och funktionell regenerering kan mest noggrant identifieras.
I detta avseende kan den kraft producerande förmågan hos en muskel mätas in vitro, in situ eller in vivo. Alla tre metoder har både fördelar och begränsningar. I en in vitro experiment, till exempel, är muskeln helt isolerad och avlägsnas från kroppen av djuret. Genom att ta bort påverkan av blodkärl och nerver som försörjer musklerna kan sammandragande förmågan hos vävnaden bestämmas i en hårt kontrollerad yttre miljön 35. In situ muskeltestning gör muskeln som ska isoleras, som med in vitro-preparat, men , innervation och blodtillförseln förblir intakta. Fördelen med in situ försöksmodell är att det tillåter en individ muskel som ska studeras medan innervation och blodtillförseln är minimalt störs 36. I bådain vitro och in situ experiment, kan farmakologiska behandlingar tillämpas mer direkt utan att behöva ta hänsyn till effekterna av eventuella omgivande vävnader eller effekterna av cirkulationssystemet på de uppmätta kontraktila svar 37. Emellertid in vivo funktionstest, såsom beskrivs häri, är den minst invasiv teknik för utvärdering av muskelfunktion i dess nativa miljö 38, och kan utföras upprepade gånger över tiden (dvs i längdriktningen). Som sådant, kommer det att vara i fokus för diskussionen nedan.
I detta avseende perkutana elektroder införda nära muskeln av intresse, eller motornerven som servar det, tillhandahålla en elektrisk signal till muskeln. En givare mäter sedan de resulterande längd eller tvinga förändringar i den aktiverade muskeln som leds av en förutbestämd, anpassad programvara protokoll. Från dessa data, kan de fysikaliska egenskaperna hos muskeln bestämmas. Dessa omfattar tillce-frekvens, maximal stelkramp, tvångs hastighet, stelhet, längd spänning och trötthet. Muskel längd eller kraft kan också hållas konstant så att muskelkontrakt isometriskt eller isotoniskt. Viktigt kan dessa experimentella protokoll snabbt utföras, lätt upprepas och customized- allt medan djuret bedövas och med en återhämtningsperiod på timmar till dagar. En enda djur kan genomgå in vivo kraft testa flera gånger, vilket gör det möjligt longitudinella studier av modeller eller utvärdering av terapeutiska plattformar / teknik sjukdomar.
Som beskrivs häri, en kommersiell muskel hävstångssystem i samband med en hög effekt, är bi-fas stimulator som används för att utföra in vivo muskelfunktionstest för att utvärdera bidraget från tibialis anterior hos råtta bakbenen till dorsalflexion av foten via stimulering av peronealnerven. Vi har utvecklat ett protokoll som är särskilt utformade för att utvärdera regenerativ medicin / tissue teknik för ett muskelreparation efter traumatisk VML skada av råttan TA muskeln. Det bör noteras; EDL och HL måste dissekeras ut ur den främre crural cockpit för att specifikt utvärdera TA muskeln (de står för cirka 15-20% av den totala tibialis anterior vridmoment mätt efter peronealnerven stimulering (Corona et al., 2013) ). Eftersom detta tillvägagångssätt ger omfattande längsgående analys av muskelfysiologi / funktion, kan det sprida viktig mekanistisk insikt om många andra typer av fysiologiska undersökningar samt en mängd olika sjukdomar eller terapeutiska områden 39. Till exempel, in vivo muskelfunktionstest är tillämplig på studier av träningsfysiologi, ischemi / reperfusion forskning, myopati, nervskada / neuropati och vaskulopati, sarcopeni och muskeldystrofi 40.
Detta protokoll visar en relativt enkel metod för att utföra in vivo muskelfunktionstest på den främre crural utrymme råtta bakbenen. Andra former av muskelfunktionstest, inklusive ex vivo och in situ-protokoll, kan också ge viktig information om muskelfysiologi. Men betydelsen av in vivo funktionstest ligger i dess icke-invasiv art, och det faktum att det mest exakt rekapitulerar endogena mekanismer för muskelstimulering. För både ex vivo och in situ testning, senan och / eller muskel utsätts för, och därför måste hållas fuktig eller nedsänkt 41,42. In vivo-testning bort störande variabler av trauma och inflammation som kan orsakas av de kirurgiska procedurer som krävs för in situ muskelfunktionstest; Detta är särskilt viktigt om målet med försöket är att undersöka inflammatoriska och cellulära processer <supp> 43. Dessutom i vivo-testning kräver lite kirurgisk skicklighet som muskeln inte är isolerad från omgivningen och inte kräver exakta knutar att minska muskel / senor glidning (vilket är fallet för in situ eller ex vivo-testning) 41. Dessutom, med tillräcklig erfarenhet, hastigheten på rätt elektrodplacering och möjligheten att snabbt göra justeringar för att uppnå maximal kraft produktion av muskeln kommer att säkerställa att protokollet slutförts är snabb och reproducible- både inom djur och mellan olika användare av samma utrustning 39 . Det är fördelaktigt att börja med en bedömning av hela främre crural komponent som visas före excision av de mindre tillgängliga synergi muskler (EDL och HL) för mer direkt undersökning av TA muskeln. Med hjälp av denna metod kan man ganska snabbt uppnå behärskning av tekniken. Medan förfarandet som beskrivits häri visar och belyser användbarheten av en kraft frequency protokoll för att framkalla stelkramp och bestämma den maximala kraft som produceras av en muskel, bör användarna bestämma vilken typ (er) av funktionell testning som bäst skulle meddela sin specifika experiment (s) och mål forskning.
Det finns flera viktiga steg som bör noggrant utförda för att säkerställa optimala och reproducerbara experimentella resultat, det vill säga i linje maximal kraft produktionen av muskeln till en mängd olika stimuleringsparametrar. Flera av de viktigaste funktionerna beskrivs i Figur 2. Emellertid är korrekt placering och stabilitet hos den stimulerande elektroden en absolut förutsättning för reproducerbar maximal stimulering av peronealnerven. I detta avseende bör elektroderna placeras ytligt. Det vill säga om den elektrodplacering är för djup, riskerar en direkt elektrisk stimulering av antagonistmuskler, vilket minskar storleken av den observerade kontraktila svaret av den främre crural utrymmet. Vidaretvå elektroder ska placeras i så nära anslutning till varandra som möjligt för att minska den elektriska resistansen hos den omgivande huden och bindväv. I allmänhet, elektrod positionering nära knäet och mediala till benet direkt spåra kanten av tibialis anterior där den möter gastrocnemius ger ofta tillräcklig kraft produktion. Detta säkerställer också att elektroderna är placerade intill och vinkelrätt mot planet för den peronealnerven, vilket i sin tur, är vinkelrät mot skenbenet och i sidled ner benet från knäet. Men den naturliga variationen i anatomi mellan djur kräver ständig vaksamhet för att säkerställa att elektrodplacering är optimerat från fall till fall. Som sådan, det finns en viss grad av trial and error i samband med elektrodplacering som väsentligt minskar genom upplevelsen av användaren. Antalet gånger elektrod hål i huden bör minimeras för att minska svullnad och inflammation, vilket minskar migasured kraft produktion. Detta är beroende av var nålar inledningsvis placeras, men det rekommenderas att flytta nålarna två gånger eller mindre speciellt i området runt knäskålen. Slutligen, när elektroderna är placerade i benet hos djuret, mindre justeringar kan göras för att positioneringen av benet och strömmen som levereras genom elektroderna. Detta bör göras samtidigt övervaka kraften produceras från en enda ryckning. Förutom elektrodplacering, kan justeringar också göras till den spänning som levereras över elektroderna. Men i inställnings beskrivs här, är det viktigt att vara försiktig vid ökning av spänningen som ett sätt att öka kraften ut eftersom den ökade spänningen kommer att stimulera de nerver som innerverar antagonistmuskler.
Det finns tre viktiga tekniska problem som måste övervakas för att säkerställa att elektrodplacering förblir optimal. Först måste foten av sövda djur vara säkertförankrad vid fotpedalen apparaten, som mäter muskelkraften (figur 2). Om foten inte är ordentligt förankrad, kan den sanna kraften som produceras av muskeln vara ofullständigt översättas till kraftomvandlaren. Instabil fot fixering införs också risken att förlora den optimala placeringen av elektroderna som rörelse utöver normal muskelsammandragning (dvs foten rör sig bort från fotplattan) kan orsaka förskjutning av elektroderna från sin ytliga ställning eller rubba dem helt. Båda fallen minskar den uppmätta kraften. För det andra bör djurets kropp vara helt liggande och inriktade i en rak plan (Figur 2). Korrekt positionering av djuren kropp förhindrar små rörelser i benet på grund av andning, och minimerar också vridning av benet och bäckenet, vilket möjliggör bättre placering och kontinuerlig kontakt mellan de stimulerande elektroderna. För det tredje, korrekt placering och förankring av knäet är critical för att säkerställa att benet förblir stadig, och sålunda, hjälper till att stabilisera den optimala placeringen av de stimulerande elektroderna för att möjliggöra konsekvent aktivering av peronealnerven.
Det finns några ytterligare punkter som bör betonas. Först kommersiella muskelspaken som utformats för att utföra tester på vänster ben, men installationen kan modifieras för att utföra tester på höger ben samt. För det andra, kan muskel hävarmssystem väljas utifrån storleken på djuret, så att användarna ska se till att den plattform som används är tillräcklig för att mäta och stödja den kraft som produceras av djurmodell för val. Prövbara muskler för utrustning plattform är begränsade till dem som framkallar plantar förlängning eller dorsalflexion av foten. För det tredje bör det återigen understrykas att elektrodplacering kan vara utmanande och kräver tålamod och träna på att behärska tekniken. Elektroder blir också tråkig snabbt med regelbunden användning, så det är bra att ha flera reserv sets för när det blir svårt att sticka huden ytligt. För det tredje, det protokoll som beskrivs i denna rapport använder specifika stimulerings sekvenser och förfaranden för dataanalys. Muskeln spaken System Control och dataanalys programvara och data som den tillhandahåller kan svara på många andra experimentella frågor och därmed dess användbarhet sträcker sig utöver vad som beskrivs häri. Som sådan, användarna uppmanas att utforska bortom gränserna för programvaruprotokoll (s) som presenteras i detta dokument. Trots dessa mindre begränsningar, in vivo muskelfunktion testning är en kraftfull metod för att bestämma hälsa och kontraktila förmågan hos skelettmuskel, därför att den är minimalt invasiv och kan utföras vid flera tillfällen, under en längre tidsperiod, på samma djur. Kort sagt, den här typen av funktionsdugliga verktyg gör systemet särskilt skickliga på att testa effekterna av nya terapier för skelettmuskel skada eller sjukdom i råtta bakbenen.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.
Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
Tabletop Anaesthesia Machine | Vet Equip | 901801 | |
Compressed oxygen gas | Praxair | N/A | |
VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
T/Pump Professional water heater | Stryker | N/A | set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature |
Transpore Surgical Tape | 3M | 1527S-1 | rip in half to make thinner strips |
A5 Golden animal clippers | Oster | 078005-050-002 | |
Povidone-Iodine Solution | Aplicare | 82-227K | |
Alcohol Swabs | |||
200 proof Ethanol | Decon labs | diluted to 70% with deionized water | |
cotton tipped applicators | Puritan | 836-WC | |
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode | Chalgren Enterprises | 111-725-24TP | |
servomotor | Cambridge Technology | Model 6650LR | |
Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | contact manufacturer to order |
Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |