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Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

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DOI:

10.3791/54497

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28 de setembro de 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

Neste artigo

Resumo

O protocolo a seguir descreve a preparação e utilização de tampões para a medição quantitativa das taxas de oxidação de glicose e ácidos graxos no coração isolado de rato em funcionamento. Os métodos utilizados para análise da amostra e interpretação dos dados também são discutidos.

Resumo

O coração dos mamíferos é um grande consumidor de ATP e necessita de um fornecimento constante de substratos de energia para contracção. Não surpreendentemente, alterações do metabolismo do miocárdio têm sido associados ao desenvolvimento de disfunção contráctil e insuficiência cardíaca. Portanto, desvendar a relação entre o metabolismo e contração deve lançar luz sobre alguns dos mecanismos que regem a adaptação cardíaca ou má adaptação em estados de doença. A preparação trabalhar isolado coração de rato pode ser utilizado a seguir, simultaneamente e em tempo real, a função contrátil cardíaca e fluxo de energia fornecendo substratos em vias metabólicas oxidativas. O presente protocolo tem como objectivo proporcionar uma descrição detalhada dos métodos utilizados para a preparação e a utilização de tampões para a medição quantitativa das taxas de oxidação de glucose e ácidos gordos, a principal energia fornecendo substratos do coração. Também são discutidos os métodos utilizados para a análise da amostra e interpretação de dados.Em resumo, a técnica é baseada no fornecimento de 14C-glucose radiomarcada e um ácido gordo de cadeia longa 3 H- radiomarcado a um coração a bater ex vivo através de perfusão de cristalóide normotérmica. 14 CO 2 e 3 H 2 O, derivados finais de as reacções enzimáticas envolvidas na utilização destes substratos de energia fornecendo, são então quantitativamente recuperada a partir do efluente coronário. Com o conhecimento da actividade específica dos substratos radiomarcados utilizados, é então possível quantificar individualmente o fluxo de glicose e de ácido gordo nas vias de oxidação. função contráctil do coração isolado pode ser determinado em paralelo com o aparelho de controlo apropriado e correlacionado directamente com os valores de fluxo metabólico. A técnica é extremamente útil para estudar a relação metabolismo / contracção em resposta a várias condições de estresse, tais como alterações no pré e pós carga e isquemia, uma droga ou um Circulafactor de Ting, ou após a alteração na expressão de um produto génico.

Introdução

Relevância clínica

No coração dos mamíferos, há uma forte correlação positiva entre o fluxo de substratos através de vias metabólicas oxidativas, geração de ATP e um trabalho cardíaco. Ao longo das últimas duas décadas, a investigação da relação entre o metabolismo intrincada e função cardíaca levou a reconhecer que as alterações no metabolismo cardíaco são uma causa para a disfunção contráctil e remodelação estrutural possivelmente patológica na definição de diferentes tipos de doenças cardíacas 2-4. Portanto, espera-se que a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a remodelação metabólica do coração salientou irá levar à identificação de alvos terapêuticos para a prevenção ou tratamento de insuficiência cardíaca 5-7. A recente publicação de uma declaração científica da American Heart Association sobre "Avaliação Cardiac Metabolism", enfatiza o crescente interesse da comunidade científica para tseu campo de pesquisa 8. Mas, enquanto os avanços tecnológicos na imagem cardíaca agora permitir uma avaliação rápida e precisa da morfologia e função cardíaca, o estudo in vivo do metabolismo cardíaco continua a ser limitado e oneroso: espectroscopia e ressonância magnética (NMR) nuclear Positron Emission Tomography de imagem (PET) pode ser usado para seguir cardíaca metabolismo do fosfato de alta energia e atividade do ciclo de Krebs, mas essas técnicas são atormentados por altos custos operacionais e pela sua incapacidade de determinar a contribuição dos vários substratos para o metabolismo oxidativo em condições de estado estacionário 9 .Para esta data, o ex vivo trabalhando preparação do coração representa a técnica única e exclusiva disponível para estudar, simultaneamente e em tempo real, a função contrátil e do fluxo dos substratos utilizados em vias metabólicas oxidativas 7,9. O protocolo seguinte tem como objetivo fornecer orientações na preparação e utilização de reagentes usados ​​para determinar o ratoes de utilização de substratos no coração isolado de rato de trabalho.

O Aparelho coração isolado Rodent Trabalho

Embora a técnica é quase meio século de idade, a preparação de trabalho isolado coração de rato continua a ser um método de escolha para a investigação cardiovascular. Tal como acontece com a preparação de coração de Langendorff, o funcionamento do coração roedor oferece uma maneira relativamente simples, fiável e barato para medir uma vasta gama de parâmetros cardíacos, independentemente dos efeitos de confusão de outros órgãos, e outros factores neuro-hormonais circulantes. Mas, em contraste com o coração de Langendorff-perfundidos, o funcionamento do coração continua a executar o trabalho cardíaco quase fisiológica, um pré-requisito para a geração de fluxo metabólico oxidativo para níveis que são relevantes para condições in vivo. Isto é conseguido através da entrega do tampão de perfusão para o ventrículo esquerdo (VE) através de uma cânula ligada ao átrio esquerdo, e como o LV e contratos enche, otampão é ejectado através da linha aórtica contra uma determinada pressão hidrostática pós-carga. O design do aparelho de perfusão originalmente descrito por Neely e colegas 10 foi posteriormente melhorado por Taegtmeyer, bainhas e Krebs 11, mas mudou muito pouco desde então. Conforme descrito no aparelho original, função contrátil pode ser avaliada através da determinação do débito cardíaco, usando não mais que os cilindros graduados e um cronômetro para medir aórtica e coronariana flui 10,11. Vários fornecedores oferecem agora sistemas completos de perfusão cardíaca de trabalho de roedores. Estes aparelhos disponíveis comercialmente podem ser adquiridos com flowprobes, transdutores de pressão, um cateter de pressão-volume e todo o equipamento necessário para a aquisição de dados e análise funcional cardíaca. Os fornecedores oferecem extensas sessões de documentação e de formação para dar a conhecer o novo usuário com o seu equipamento. Vários artigos de revisão também protocolos detalhes sobre o instrum coração a trabalharentação e sobre a utilização de cateteres para medir a função cardíaca em roedores 12-15. Por esta razão, vamos citar apenas brevemente o set-up do aparelho de perfusão e do equipamento de gravação. O presente protocolo tem a finalidade de complementar a informação já disponível com uma descrição dos métodos que podem ser utilizados para medir, simultaneamente, as taxas de glucose e oxidação de ácidos gordos de cadeia longa, os dois principais substratos energéticos proporcionando, no coração normal. Descrevemos aqui todos os passos envolvidos na a utilização de substratos de energia radiomarcados para o estudo do metabolismo oxidativo do miocárdio, a partir da preparação de reagentes e tampões para a extracção e processamento de amostras, para a análise de dados.

Princípios do Método

Cardiomiócitos gerar a maior parte de sua energia para a contração da fosforilação oxidativa de ácidos graxos (ácidos graxos de cadeia longa principalmente) e carboidratos (GlucosE e lactato). O coração tem muito limitado reservas energéticas e depende de um fornecimento constante desses substratos energéticos prestar a partir da circulação. O catabolismo da glicose através da via glicolítica produz piruvato que é então descarboxilado por o complexo piruvato desidrogenase da membrana mitocondrial interna. ácidos gordos de cadeia longa, extraídos a partir de albumina ou de circulação de lipoproteínas de triglicéridos, são em primeiro lugar activados em moléculas de acil-CoA no citosol e, posteriormente, transportados para dentro da matriz mitocondrial de transporte através da carnitina para entrar na via beta-oxidação. As moléculas de acetil-CoA produzidas pelo catabolismo da glicose e os ácidos gordos de combustível do ciclo de Krebs para gerar os equivalentes redutores (NADH e FADH2) que são usados pela cadeia de transporte de electrões para construir a força motriz protónica através da membrana mitocondrial interna e gerar ATP por meio da actividade da ATP sintase. Água e dióxido de carbono são os subprodutos finais deas reacções enzimáticas que ocorrem dentro do ciclo de Krebs. O fornecimento de 14 C e 3 H- substratos marcados radioactivamente (tais como 14 C-glicose e ácido oleico radiomarcado 3H-radiomarcado) para o coração isolado irá consequentemente levar à produção de 14 CO 2 e H 2 O 3 que pode ser quantitativamente recuperada a partir do efluente coronário. A recolha de 14 CO 2 é levada a cabo mantendo o coração perfundido isolado dentro de uma câmara selada e por imediatamente a recuperar o efluente coronário medida que sai do coração. Uma coluna de permuta aniónica pequena é usado para separar e recuperar 3 H2O a partir do efluente coronário. A radioactividade das amostras processadas é medido com um contador de cintilação líquida, e com o conhecimento da actividade específica dos substratos marcados radioactivamente utilizado, é então possível quantificar individualmente o fluxo de glicose e de ácido gordo nooxidação percursos 16,17.

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Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com a Política de Serviço de Saúde NIH pública sobre o Cuidado Humano e Uso de Animais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Mississippi Medical Center. Todos os procedimentos que envolvem a utilização de radioisótopos foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo escritório de segurança de radiação da Universidade de Mississippi Medical Center.

1. Preparação de estoque regulador Soluções e Reagentes

  1. Krebs-Henseleit (KH) Soluções do depósito
    1. Preparar 2 L de uma solução de estoque de 20x salina concentrada contendo (em mol / L) 2,37 NaCl, KCl 0,0948, 0,0236 KH 2 PO 4, e 0,0236 MgSO 4 7H 2 O. * Filtrar em uma unidade de filtração tamanho 0,45 poro e armazenar em temperatura ambiente por até 1 mês.
    2. Preparar 2 L de uma solução 20x concentrado (0,5 mol / L) de NaHCO 3. A solução pode serarmazenado em temperatura ambiente por um período indefinido de tempo.
    3. Preparar 250 ml de uma / L solução de 1 mol de CaCl 2. Filtrar em uma unidade de filtração tamanho 0,45 poro e armazenar em temperatura ambiente por até 1 mês.
  2. Conversão de troca aniónica resina da forma de cloreto à forma de hidróxido
    1. Lava-se a resina de permuta aniónica por ressuspensão-lo em 1 L de água ultrapura. Permitir que a resina para se estabelecer e deitar fora o excesso de água. Repita este passo mais 4 vezes.
    2. Verter a resina num suporte de filtro de vácuo microanálise de vidro montada sobre um balão de filtragem.
    3. Converter a resina para a forma hidróxido fazendo passar lentamente através de 22 volumes de NaOH a 1 N. Misture a suspensão intermitentemente com uma espátula de aço inoxidável.
    4. Lava-se a resina com água ultrapura até que o pH cai abaixo de 9,0. Verificar o pH com regularidade por imersão de uma tira teste de pH perto da superfície da lama de resina. Cubra e armazenar a resina com água ultrapura para um bogarrafa de vidro rosilicate e proteger da luz. Não permita que a resina para secar antes de usar.
      NOTA: Quando armazenado adequadamente, a resina vai durar pelo menos 3 meses.
  3. Ácido oleico-albumina 8x Concentrado Stock Solution
    1. Em um balão de Erlenmeyer de 4 L, misturar 200 ml de solução stock 20x salgada concentrada e 200 ml de solução concentrada a 20x de NaHCO 3, com 3,6 L de água ultrapura.
    2. Utilizando um tubo de dispersão de gás, com um cilindro de placa porosa, o gás da solução durante 15 min com uma mistura de dióxido de carbono a 5% e 95% de oxigénio para estabilizar o pH.
    3. Pour tampão 470 ml num copo de vidro de 1 L. Adicionar 8,75 ml da / L CaCl solução de 2 Estoque 1 mol para o buffer de 3530 ml que fica no frasco 4 L Erlenmeyer e reserve.
    4. Adicionar 40 g de BSA gordo livre de ácido para o 1 G proveta de vidro e agita-se com uma barra de agitação até à dissolução.
    5. Num tubo de 15 ml, 4 ml de preparar um 50% (v: v) de uma solução de etanol em água ultrapura. Adicionar 487 mg sodium oleato e vortex até que o pó esteja completamente dissolvido.
      Nota: Alguns investigadores usam ácido palmítico em vez de ácido oleico no tampão de perfusão. Uma solução de estoque de albumina-ácido palmítico pode ser preparado seguindo o mesmo procedimento. No entanto, recomenda-se aquecer a solução a 70 ° C para conseguir a solubilização completa de palmitato de sódio.
    6. Adicionar gota a gota a solução de oleato para a solução de BSA livre de ácido gordo sob agitação constante e esperar mais 10 minutos para o ácido oleico complexo-BSA para formar.
      Nota: A solução deve ter uma cor amarelo claro e estar isenta de partículas visíveis. Presença de um precipitado ou partículas insolúveis podem indicar conjugação incompleta do ácido gordo com BSA. Se isso acontecer, a solução deve ser descartado e o processo começou mais uma vez.
      NOTA: Palmitate irá precipitar se é permitido sentar-se em uma pipeta e não pode ser adicionado gota a gota. A solução agitada de BSA pode ser aquecida a 37 ° C para facilitar binding de ácido palmítico. Não sobreaquecer, pois isso pode causar a desnaturação e agregação de BSA.
      ATENÇÃO: Os próximos passos deste protocolo envolvem a manipulação de material radioativo. Utilizar EPI adequado e seguir as normas de segurança e eliminação de resíduos fixados pelo gabinete de segurança de radiação da instituição.
    7. Adicionar 160 ul (0,8 mCi) [9,10- 3H] ácido oleico à solução em agitação de ácido oleico-BSA e agitou-se durante mais 10 min.
    8. Adicionar 2,5 ml de o / L de CaCl 2 solução de estoque 1 mol à solução em agitação de ácido oleico-BSA.
    9. Corte aproximadamente 1,2 m tubo de membrana de diálise e enxaguar tanto dentro como fora com água da torneira. Esfregar a tubagem de diálise vigorosamente sob água da torneira durante 10 a 15 min para remover o revestimento de glicerol da membrana. Alternativamente, remover o revestimento por imersão do tubo de diálise em água quente durante 1 h antes da utilização. Terminar a lavagem do tubo de diálise com wate ultrapurar.
    10. Firmemente amarrar uma extremidade do tubo de diálise. Encher com a solução de ácido oleico-BSA e amarrar a outra extremidade do tubo de diálise.
    11. Colocar o tubo de diálise para encher o balão de Erlenmeyer de 4 L de tampão de KH e permitir diálise durante a noite a 4 ° C sob agitação suave com uma barra de agitação.
    12. No dia seguinte, remover a solução concentrada oleico 8x ácido-BSA a partir do tubo de diálise. Use a solução de ácido oleico-BSA imediatamente para perfusão ou alíquota e armazenar a -20 ºC. alíquotas congeladas são estáveis ​​durante pelo menos 2 meses. Evitar ciclos múltiplos de congelação-descongelação, pois isso pode comprometer a solubilidade do complexo de ácido oleico-BSA.
      NOTA: Use apenas água ultrapura (resistividade de 18,2 MΩ.cm a 25 ºC, carbono orgânico total <10 ppb, microrganismos ≤ 1 UFC / ml, partículas com tamanho de mais de 0,22 ≤1 / ml) para preparar os reagentes e tampões utilizada para a perfusão do coração. A conversão da resina de permuta aniónica a partir do seu cloreto dem para a forma de hidróxido pode ser evitada por compra directa da forma hidróxido com uma despesa adicional (ver Materiais Tabela). Além oleato ou palmitato, qualquer outro tipo de ácido gordo que ocorrem naturalmente também podem ser utilizados, desde que uma versão tritiada do ácido gordo está disponível para seguir a sua oxidação.

2. Preparação do tampão de perfusão

  1. Em um balão de Erlenmeyer de 4 L, misturar 200 ml de solução stock 20x salgada concentrada e 200 ml de solução concentrada a 20x de NaHCO 3, com 3,6 L de água ultrapura. Gás, a solução durante 15 minutos com uma mistura de dióxido de carbono a 5% e 95% de oxigénio, e, em seguida, adicionam-se 10 ml de a / L de CaCl 2 solução de estoque 1 mol para definir a concentração de Ca2 + livre a 2,5 mmol / L.
    AVISO: Os passos seguintes envolvem a manipulação de material radioativo. Utilizar EPI adequado e siga as normas de segurança e eliminação de resíduos estabelecidos pela ra da instituiçãoescritório de segurança mediação financeira.
  2. Transferir 1.750 tampão L KH a uma garrafa de vidro de borosilicato 2 L. Adicionar 250 ml de solução concentrada de ácido 8x-BSA oleico, 1,802 g de D-glucose, 400 uL de insulina em 0,4 U / ml, e 200 ul (0,2 mCi) [U- 14 C] glucose. Inverter o frasco para misturar. Isto irá dar origem a 2 L de tampão de perfusão completa contendo ácido oleico (0,4 mmol / L), D-glucose (5 mmol / L), e insulina (40 mU / ml).
    NOTA: se um volume de 2 L é suficiente para perfundir um coração de rato adulto que trabalha em condições de não-recirculação por pelo menos 60 min.
  3. Use um pouco do tampão KH não radioactivo para encher dois pratos de dissecação e coloque no gelo para se refrescar.

3. Preparação do aparelho de perfusão

NOTA: O investigador pode escolher utilizar um aparelho de perfusão com especificação, tais como a descrita por Taegtmeyer, bainhas e de Krebs 11, ou um dos sistemas disponíveis comercialmente. sistemas de perfusão são tipicamente compostas doelementos descritos na Figura 1 abaixo. Além da tubulação e vidro, o resto do equipamento de gravação é opcional e sua utilização dependerá das necessidades do investigador de abordar a questão experimental sendo solicitado. No entanto, recomendamos o uso de microeletrodos de oxigênio para determinar a concentração de O2 na entrada buffer e sair da circulação coronária (Figura 1). Isto irá ajudar o controlo investigador que o coração é fornecido com uma quantidade apropriada de oxigénio, e que o fornecimento de oxigénio não variar entre experiências. Além disso, a determinação da diferença de oxigénio "arteriovenosa" pode ser usado para calcular o consumo de oxigénio do miocárdio e eficiência cardíaca 16,18.

  1. Ligar o banho de água circulante e é ajustado a 37 ° C para aquecer o aparelho de perfusão.
  2. Ligue o computador eo sistema de aquisição de dados queser utilizado para medir a função cardíaca.
  3. Ligue os dispositivos de gravação (cateter de pressão, cateter de pressão-volume, microeléctrodos de oxigênio, medidores de vazão, etc.) para o sistema de aquisição de dados e realizar a calibração dos instrumentos seguintes instruções do fabricante.
  4. Encha o reservatório tampão com água ultrapura. Ligue a bomba peristáltica e expulsar a água através de toda a tubulação e copos para lavar o sistema. Desligue a bomba peristáltica e garantir que nenhum estadias de água na tubulação e / ou das suas obras, pois isso pode afetar a concentração do tampão de perfusão ea preparação coração.
  5. Conectar um novo 1,0 um filtro de fibra de vidro para o sistema. Ligar o tanque de gás contendo uma mistura de dióxido de carbono a 5% e 95% de oxigénio à câmara de oxigenação.
    AVISO: Os passos seguintes envolvem a manipulação de material radioativo. Utilizar EPI adequado e siga as normas de segurança e eliminação de resíduos estabelecidos pela instituiçãoescritório de segurança de radiação.
  6. Encha o reservatório tampão com tampão de perfusão. Ligue a bomba e assegurar o enchimento de toda a tubulação e vidro com o tampão de perfusão. Executar o tampão de perfusão através do aparelho de perfusão no modo de recirculação e oxigenado durante pelo menos 30 min antes da utilização.
  7. Firmemente anexar o tubo de uma seringa de 20 ml por baixo da câmara do coração para recuperar o efluente coronário. Ligar a extremidade da seringa para o início de uma torneira de passagem de três vias. Ligue o braço lateral de uma seringa de 3 ml. Conecte o braço inferior através tubulação para um recipiente para resíduos líquidos radioactivos.
    Nota: Quando se utiliza o complexo de ácido gordo-BSA, a oxigenação do tampão de perfusão não pode ser realizada por meio de borbulhamento directo com um tubo de dispersão de gás, pois isso irá provocar a formação de espuma excessiva da solução. Usar um oxigenador de membrana (Figura 1) ou de uma câmara de oxigenação fluxo de folha para esse efeito. É altamente recomendável para verificar que um nível adequado of oxigenação é alcançado colocando um microeléctrodo de oxigénio no circuito de perfusão (Figura 1).

4. Isolamento do coração do rato e canulação

  1. Pesar rato em uma escala.
  2. Prepara-se uma seringa com uma dose de anestésico 150 mg / kg de hidrato de sal de sódio de tiobutabarbital e uma seringa de tuberculina com 200 unidades USP de heparina.
  3. Injectar tiobutabarbital IP e esperar para que o animal perca a consciência. Outros agentes de indução pode ser usado, desde que este não interfira com o objectivo da experiência (Ver escolha do anestésico Na discussão abaixo).
  4. Verificar a existência de nível adequado de anestesia, confirmando a falta de reflexo toe pitada. Certifique-se de manter a profundidade adequada da anestesia para assegurar que o animal não sente dor durante o procedimento.
  5. Uma vez que o rato é totalmente inconsciente e não responde a pitada dedo do pé, coloque-o sobre a sua volta na mesa de operação e segmembros Ure com fita adesiva ou alfinetes.
  6. Clipe da livre abdómen de cabelo e realizar uma incisão na linha média do abdome. Não abra a caixa torácica, neste ponto ainda. Mover o estômago e do intestino de lado para revelar a veia cava inferior. Injectar a heparina directamente na veia cava inferior e esperar 5 a 10 segundos, antes de prosseguir.
  7. Utilizando tesouras cortou o diafragma e os lados da caixa torácica para expor o conteúdo da cavidade torácica.
  8. Delicadamente agarrar o coração entre o polegar, indicador e dedo médio e impostos especiais de consumo tanto o coração e os pulmões juntos. Cortar a nível da aorta descendente, tomando cuidado para não danificar o arco aórtico e a aorta ascendente no processo. Imediatamente transferir coração e pulmões de um dos pratos de dissecação cheios com tampão de KH gelada.
  9. Depois que o coração pára de bater, transferir para o segundo prato dissecção e retire todos os pedaços grandes de tecido pulmonar ligados, mantendo o coração submerso em tampão KH gelada. Corte a descering aorta logo acima do arco aórtico.
    AVISO: Os passos seguintes envolvem a manipulação de material radioativo. Utilizar EPI adequado e seguir as normas de segurança e eliminação de resíduos fixados pelo gabinete de segurança de radiação da instituição.
  10. Lave a linha aórtica do aparelho de perfusão para encher a cânula aórtica com tampão morno e para eliminar qualquer água ou o ar que ainda podem estar presentes na tubagem. Permitir que o tampão de perfusão para gotejar a partir da cânula aórtica para minimizar a possibilidade de embolias de ar no momento em que o coração está ligado à cânula.
  11. Utilizando duas pinças micro dissecação abra cuidadosamente a aorta e deslize o coração para cima da cânula aórtica. Fixar a aorta na cânula com um micro grampo de Langendorff e iniciar a perfusão do coração. Observe o coração começar a bater novamente e expulsar todo o sangue restante na vasculatura coronária nos segundos após o início da perfusão.
    NOTA: É muito importante para executar os passos 4.6 a 4,10 tão rápido quanto possível para impedir danos isquémicos irreversível ao coração. Com a experiência, todo o processo deve demorar entre 1 e 2 min. Ao deslizar a aorta se sobre a cânula, tenha cuidado para não passar a raiz da aorta, pois isso pode resultar em hipoperfusão do miocárdio e danos na válvula aórtica.
  12. Ate a aorta à cânula aórtica com uma sutura de seda 3-0 e remover o micro grampo. Localizar a veia pulmonar. Pode ser necessário para cortar os tecidos não cardíacos para encontrá-lo, mas não cortar muito dos tecidos não cardíacos como eles vão servir para amarrar o átrio esquerdo para a cânula.
  13. Lavar o sistema do átrio esquerdo do aparelho de perfusão para encher a cânula da auricula com tampão morno e para eliminar qualquer água ou o ar que ainda podem estar presentes na tubagem. Ser particularmente o cuidado de remover qualquer bolha de ar a partir do aparelho para minimizar a possibilidade de embolias de ar no momento em que o coração está ligado à cânula.
  14. Usando dois micro forc de dissecaçãoeps delicadamente agarrar a abertura da veia pulmonar e deslize o coração para cima da cânula atrial. Pode ser necessário para reposicionar o coração por rotação suave da cânula atrial e / ou aórtica para realizar este passo. Em qualquer caso, assegurar que o procedimento não impõe tensão excessiva sobre o coração e causar a dobragem da aorta. Amarre o átrio esquerdo à cânula atrial com uma sutura de seda 3-0.
  15. Abra a linha de atrial e, simultaneamente, mudar a linha da aorta do modo de Langendorff com o modo de trabalho. Se tampão vazamentos para fora do átrio esquerdo, perto da linha atrial, volte a linha da aorta para Langendorff perfusão, e usar outra sutura de seda 3-0 para amarrar o átrio esquerdo com mais segurança à cânula.

5. Medição da função cardíaca e Coleta de Amostras

NOTA: A determinação dos fluxos metabólicos exigirá o conhecimento do fluxo coronário (CF). Como descrito abaixo, os valores do fluxo coronário pode serobtida com o simples uso de um cronômetro. Além disso, a medição do fluxo aórtico (FA) com o mesmo método permite a determinação do débito cardíaco (CO = CF + FA), que pode então ser utilizado para calcular a potência cardíaca (PC) como uma medida geral da função cardíaca por aplicação a fórmula CP = CO (m 3 / s) * pós-carga (Pa). Outro método disponível para a avaliação da função cardíaca se baseia na medição em tempo real da pressão de pulso com um transdutor de pressão (Figuras 3 e 4). Embora opcional, as medições mais precisas e detalhadas da função contrátil cardíaca e hemodinâmica, incluindo a determinação da pressão sistólica ventricular esquerda e funções diastólica, será alcançado com o uso de um cateter condutância pressão-volume (PV). Esta seção descreve brevemente o cateterismo do coração isolado. Informações adicionais sobre a calibração de cateteres PV e análise de dados com software estatístico pode serencontrada nas referências 14,15.
AVISO: Os passos seguintes envolvem a manipulação de material radioativo. Utilizar EPI adequado e seguir as normas de segurança e eliminação de resíduos fixados pelo gabinete de segurança de radiação da instituição.

  1. Se o experimento inclui a medição direta da função ventricular esquerda com um catéter, perfurar o ápice do VE com uma agulha G 26 e introduzir o cateter através da punção.
  2. Quando se utiliza um cateter de pressão-volume, posicionar cuidadosamente o cateter de modo a que o seu eixo está alinhado com o eixo longitudinal do VE, com o eléctrodo distai direita abaixo da válvula aórtica e adjacente à fronteira endocárdica, e o eléctrodo proximal apenas no interior da parede ventricular.
  3. Selar o coração para a câmara do coração jaqueta de água e monitorar parâmetros funcionais cardíacas com o software de aquisição de dados. Iniciar a gravação depois de parâmetros cardíacos linha de base ter sido estável por mais de 5 min.
  4. Determine o fluxo coronário por measuring o tempo necessário para encher o tubo da seringa de 20 ml ligado por baixo da câmara do coração. Após a medição, abrir a torneira de três vias para esvaziar o efluente coronário para o recipiente de resíduos líquidos radioactivos.
    NOTA: As medições de fluxo também pode ser realizada utilizando um medidor de vazão e flowprobes.
  5. Utilizar a seringa de 3 ml ligado ao braço lateral da torneira de três vias para recuperar ~ 2 ml de efluente coronário à medida que sai do coração. Transferir 0,5 ml do efluente coronária em um tubo sem tampa microcentrífuga 2 ml e proceder imediatamente com a determinação das taxas de oxidação de glicose (Seção 6 abaixo).
  6. Transferir o resto da amostra de efluente coronário (~ 1,5 mL) num tubo de microcentrífuga apropriadamente marcado e armazenar em gelo.
  7. Repita os passos entre 5,4 e 5,6 a intervalos regulares (por exemplo a cada 5 ou 10 min) até ao final da experiência perfusão.
  8. Se usando um cateter de pressão-volume, injectar um bolus de 10 ul de solução salina hipertónica (15%)na linha atrial e logo antes de a cânula atrial antes de concluir o experimento. Utilizar esta injecção de bolus para calcular a condutância paralela (V P), que é crítico para a determinação exacta do volume cardíaco 15.
  9. Desselar a câmara do coração e remover o cateter do LV, se uma foi utilizada na experiência. Recuperar o coração usando uma das seguintes opções:
    1. Se não houver necessidade de isolar áreas específicas do coração para análises a jusante e, se o aparelho de perfusão permite que, tanto as linhas atriais e da aorta e imediatamente perto congelar-Clamp o coração em suas cânulas com uma pinça Wollenberger pré-arrefecido em azoto líquido.
    2. Como alternativa, cortar o coração fora das cânulas e soltá-lo em tampão KH gelada. Rapidamente secar o coração em uma toalha de papel e medir o seu peso molhado. O coração pode então ser dissecados e amostras de tecidos recolhidos para medições específicas. Congelar o tecido restante usando Wollenberger tongs pré-arrefecido em azoto líquido.
  10. Armazenar o tecido do coração congelado a -80 ºC até à determinação do peso seco (ver secção 8. Cálculos).

6. Determinação do miocárdio Glucose Oxidação Rates

NOTA: O método consiste na recuperação quantitativa de 14 CO 2 do efluente coronário com uma solução de captura de hidróxido de hiamina. A 14 CO 2 dissolvido como H 14 CO3- é recuperada na sequência de acidificação do tampão com ácido perclórico. As amostras devem ser processadas imediatamente após a sua recuperação como a difusão passiva de gás entre o ar e a amostra irá resultar numa perda de 14 CO 2 ao longo do tempo. Os frascos de cintilação deve ser hermeticamente fechado com as rolhas de manga de borracha para evitar a perda de 14 CO 2, após a adição de ácido perclórico. Se necessário, parafilme pode ser usado para proteger as rolhas de borracha para a luvafrascos (Figura 2).

  1. Adicionar 1 ml de hidróxido de 10x concentrada de hiamina para frascos de cintilação de vidro (um frasco de amostra + por dois frascos adicionais para determinação da actividade de fundo).
    CUIDADO: Hidróxido de hiamina é altamente tóxico e provoca queimaduras graves. Consulte as MSDS de produtos para movimentação e armazenagem adequada.
  2. Usando pinças delicadamente transferir o tubo sem tampa de microcentrifugação de 2 ml contendo a amostra de efluente coronário 0,5 ml para um frasco pré-cheio com o hidróxido de hiamina. Use 0,5 ml de tampão de perfusão para a determinação da actividade de fundo.
  3. Tapar o frasco com uma rolha de manga de borracha. Parafilm pode ser usado para proteger selagem do frasco. Usando uma seringa de 1 ml e uma agulha longa 23 G, injetar 200 mL de ácido perclórico (60% w: w%) através da rolha de manga de borracha e directamente para dentro do tubo sem tampa 2 ml.
    NOTA: O efluente coronário deve ficar branco, devido à precipitação de BSA.
  4. Deixe os frascos s-lo durante a noite.
    CUIDADO: Ácido perclórico é altamente corrosivo, pode atuar como um oxidante e / ou causar risco de explosão. Consulte as MSDS de produtos para movimentação e armazenagem adequada.
  5. No dia seguinte, retire as rolhas luva de borracha. Cuidadosamente recuperar cada tubo 2 ml sem tampa, com uma pinça e lava-se a parte inferior da câmara de ar no topo do frasco aberto com 1 ml de cocktail de cintilação para recuperar todo o hidróxido de hiamina. Rejeitar o tubo sem tampa em um recipiente resíduos radioactivos devidamente rotulados.
  6. Adicionar um 9 ml de cocktail de cintilação adicionais por frasco. Adicionar 0,5 ml de tampão de perfusão directamente para dois frascos cheios com 10 ml de cocktail de cintilação líquida para a determinação da actividade específica. Agite os frascos vigorosamente à mão e aguarde pelo menos 6 horas para permitir que as bolhas de ar para dissipar antes de medir em um contador de cintilação líquida adequadamente configurado para experimentos de etiqueta dupla.
    NOTA: Use frascos de vidro transparente para visualizar a needle ao perfurar as rolhas luva de borracha. Não deixe cair ácido perclórico para o hidróxido de hiamina como isso irá arruinar a reação. Adicionando os lançamentos de ácido perclórico a 14 CO 2 do efluente coronário para o ar. Embora os frascos devem ser hermeticamente fechado e todo o CO 2 14 deve ser presa no hiamina de hidróxido, recomenda-se realizar este ensaio sob a coifa química.

7. Determinação do miocárdio Oleate Oxidação Rates

NOTA: O método baseia-se na separação e recuperação quantitativa de 3 H 2 O a partir do efluente coronário usando uma resina de permuta aniónica forte. Ao contrário da recuperação de 14 CO 2, não existe qualquer problema de estabilidade da amostra e o efluente coronário pode ser mantido em gelo ou armazenado no congelador antes de realizar o ensaio.

  1. Prepare colunas de resina de permuta aniónica (coluna por uma amostra + TWO colunas adicionais para determinação da actividade de fundo), preenchendo a ponta de tubos de seringa de 3 ml com a lã de vidro. Adicionar a suspensão de resina / água com uma pipeta de transferência até que a resina atingir a marca de 2 ml sobre o tubo de uma seringa.
  2. Lava-se a resina fazendo passar 2 ml de água ultrapura através da coluna. Repita este passo mais duas vezes.
  3. Coloque frascos de cintilação abertos sob as colunas e carregar 0,5 ml de efluente coronária por coluna. Carregar 0,5 ml de tampão de perfusão para a determinação da actividade de fundo.
  4. Lavam-se as colunas, sucessivamente, com 0,5, 1 e 2 ml de água ultrapura. Uma vez que a eluição é feita, descartar as colunas em um recipiente resíduos radioactivos devidamente rotulados.
  5. Adicionar mistura de cintilação 13 ml de líquido por frasco de cintilação. Adicionar 0,5 ml de tampão de perfusão directamente para dois frascos cheios com 13 ml de cocktail de cintilação líquida para a determinação da actividade específica. Agite os frascos vigorosamente e aguarde pelo menos 6 horas antes da medição em um sci líquidocontador ntillation adequadamente configurado para experimentos de etiqueta dupla.

8. Cálculos

  1. Se não o tiver feito, determinar o peso fresco de toda a perfusão do coração.
    NOTA: Não permita que o tecido congelado para descongelar se análises moleculares e bioquímicas devem ser posteriormente realizado no tecido remanescente.
  2. Determinar o peso húmido de uma amostra de tecido a partir do conjunto aspergir-coração (usar cerca de 15 a 30% de todo o coração). Colocar a amostra de tecido num forno regulado para 50 ° C durante a noite e medir o seu peso seco. Utilizar a proporção em peso do peso húmido / seco da amostra de tecido para determinar o peso seco de todo o coração em gramas (g de peso seco.).
  3. Para cada ponto de tempo x expressar o valor do fluxo coronário CF x em ml / min.
  4. Determinação da taxa de oxidação da glucose
    1. Calcular a média dos valores de dois desintegração / min (DPM), medida para a atividade de fundo de 14 C a determine o fator de correção 14C dpm ba.
    2. Determinar a 14 C valor da atividade específica 14C dpm sa média.
    3. Determinar a radioactividade específica da glicose em dpm / nmol (F Glu) através da aplicação da fórmula
      figure-protocol-1
      NOTA: Onde n Glu (imol) = C Glu (umol / L) * volume da amostra (L) = 2,5 quando se utiliza glicose a 5 mmol / L e uma amostra de 0,5 ml.
    4. Determinar, para cada ponto de tempo x a taxa de produção de 14 CO 2 em dpm / min (A), aplicando a fórmula
      figure-protocol-2
      NOTA: Onde Vol x (ml) = 0,5
    5. Divide A por o valor determinado para o peso do coração e seco para se obter a taxa normalizada de produção de 14 CO 2 (uma norma ) em dpm / min por peso seco g.
    6. Aplicar a fórmula GO = uma norma / F Glu para obter a taxa de oxidação da glucose (GO) em umol de glicose / min por g de peso seco.
  5. Determinação da taxa de oxidação Oleate
    1. Calcular a média dos valores min duas desintegração / (DPM) medidos para a atividade de fundo de 3 H para determinar o fator de correção 3H dpm ba.
    2. Determinar a 3 H valor de actividade específica 3H dpm sa média.
    3. Determinar a radioactividade específica de oleato em dpm / nmol (M Ol e) aplicando a fórmula
      figure-protocol-3
      NOTA: Onde n Ole (imol) = C Ole (umol / L) * volume da amostra (L) = 0,2 quando se utiliza oleato a 0,4 mmol / L e uma amostra de 0,5 ml.
    4. Determinar para cada time o ponto X a taxa de produção de 3 H 2 O em dpm / min, (B) através da aplicação da fórmula
      figure-protocol-4
      NOTA: Onde Vol x (ml) = 0,5
    5. Divide B pelo valor determinado para o peso do coração e seco para se obter a taxa normalizada de produção de 3 H2O (B Norm) em dpm / min por g de peso seco.
    6. Aplicar a fórmula OO B = Norma / F Ole para obter a taxa de oxidação oleato (OO) em nmol de oleato / min por g de peso seco.

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Resultados

Duas experiências representativas estão descritas nas figuras abaixo. Em ambos os casos, o centro de um 16 semanas de idade do sexo masculino Sprague Dawley foi isolado e perfundido no modo de funcionamento com tampão de KH preparado de acordo com o protocolo anterior. Em cada experimento, o coração foi submetido a uma condição de tensão de afectar o trabalho cardíaco. função contráctil cardíaca foi avaliada por registo contínuo da pressão de pulso através da inserção de um transdutor de...

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Discussão

Detalhes do protocolo anterior e os métodos para quantificar simultaneamente o fluxo de substrato através da oxidação da glicose e oxidação dos ácidos graxos no coração isolado de rato de trabalho. As medições pode, então, ser sobreposta aos parâmetros funcionais cardíacas gravadas para determinar a relação entre os substratos e metabolismo trabalho cardíaco sob condições basais e de stress (mudança de carga de trabalho, por isquemia-reperfusão, etc ...). É também possível avaliar o modo como a relação metaboli...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos Subsídios do National Institutes of Health R00 HL112952 (para RH), R01 HL108618 (para JPG), P01 HL051971 e P20 GM104357. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloreto de Sódio (NaCl)Fisher ScientificBP358
Cloreto de Potássio (KCl)Fisher ScientificBP366
Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4)Fisher ScientificP284
Sulfato de Magnésio Heptahidratado (MgSO4*7H2O)Fisher ScientificM63
Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)Fisher ScientificS233
Cloreto de Cálcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
AG 1-X8 resina, forma de cloreto, malha seca 100 - 200, 500 gBio-Rad1401441Este item pode ser substituído comprando diretamente a forma de hidróxido  (veja a referência abaixo), mas isso custará quase 8 vezes mais
resina AG 1-X8, forma de hidróxido, tamanho de malha seca de 100 - 200, 100 gBio-Rad1432445A compra deste item permite ignorar a conversão da resina de troca aniônica da forma de cloreto para a forma de hidróxido (consulte a seção 1.2 do protocolo) Suporte de
filtro a vácuo de microanálise de vidroFisher Scientific09-753-2
Hidróxido de sódio (NaOH)Fisher ScientificS318Corrosivo. Consulte a MSDS do produto para manuseio e armazenamento adequados.
Tubo de Dispersão de Gás com Cilindro FritoFisher Scientific11-138B
Probumin Soro Bovino Albumina Sem Ácidos, PóEMD Millipore820027Recomendamos o uso de um BSA desengordurado com carvão, pois outros processos de purificação, como o fracionamento de etanol frio, podem deixar resíduos tóxicos para o coração.
Oleato de sódioSigma-AldrichO7501
Ácido oleico, [9,10-3H(N)]-PerkinElmerNET289005MCMaterial radioativo. Siga as diretrizes do escritório de segurança de radiação da sua instituição para pedidos e manuseio.
Tubo de membrana de diálise, diâmetro de 29 mmFisher Scientific08-667E
D-(+)-GlicoseSigma-AldrichG7021
Glicose, D-[14C(U)]-PerkinElmerNEC042B005MCMaterial radioativo. Siga as diretrizes do escritório de segurança de radiação da sua instituição para pedidos e manuseio.
Humulin R U-100Eli Lilly and CompanyNDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin HydrateSigma-AldrichT133Substância controlada no USDEA Schedule III
3-0 Silk Black BraidRoboz SurgicalSUT-15-3
10x Hyamine HydroxidePerkinElmer6003005Altamente tóxico e causa queimaduras graves. Consulte o produto MSDS para manuseio e armazenamento adequados
Frascos de cintilação de vidro de 20 mlFisher Scientific03-341-25EUse frascos de vidro para recuperação quantitativa de 14CO2
20 ml Frascos de cintilação HDPEFisher Scientific03-337-23BUse frascos de HDPE para recuperação quantitativa de 3H2O
Vermelho Rolhas de Manga de BorrachaFisher Scientific14-126DDFit Frascos de cintilação de 20 mL; Agulha Reutilizável
BD PrecisionGlide 23G x 40 mmBD305194Use para injetar ácido perclórico através da tampa de borracha da armadilha CO2
Ácido Perclórico, 60%Fisher ScientificA228Altamente corrosivo e pode atuar como oxidante e/ou causar risco de explosão. Consulte o produto MSDS para manuseio e armazenamento adequados
Ultima Gold, Coquetel de CintilaçãoPerkinElmer6013327
Lã de VidroFisher ScientificAC38606
Decon Dri-Clean Detergente em PóFisher Scientific04-355Para limpeza de copos, peças plásticas e tubos
Alconox Tergazyme Enzyme-Active DetergentFisher Scientific16-000-115Para limpeza de superfícies "difíceis de alcançar" (tubos, vidraria) contaminadas por resíduos de ácidos graxos-BSA

Referências

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