O modelo de roedor de nonarterítica óptica isquêmica anterior Neuropatia (rNAION)

Resumo

O relatório a seguir descreve como replicar o modelo de roedor de neuropatia óptica isquêmica anterior não arterítica (rNAION), usando os parâmetros apropriados de corante, lente de contato e laser. Também revelamos as etapas apropriadas para avaliar a lesão de RNAion in vivo.

Resumo

A neuropatia óptica isquêmica anterior não arterítica (NAION) é uma lesão isquêmica focal do nervo óptico que afeta 1/700 indivíduos ao longo da vida. A NAION resulta em edema do nervo óptico, perda seletiva dos neurônios das células ganglionares da retina (RGCs) e atrofia do nervo óptico. Um modelo de roedor de NAION que expressa a maioria das características e sequelas de NAION foi desenvolvido, aplicável a ratos e camundongos. Este modelo utiliza uma aplicação de laser focal de comprimento de onda de 532 nm para iluminar um corante fotoativo, Rose Bengal (RB), para causar danos capilares e vazamento no nervo óptico anterior alvo (a região laminar). Após a indução da RNAi, há uma isquemia precoce do nervo óptico, edema do nervo óptico e inflamação intraneural, seguida por RGC seletivo e perda axonal. Como o nervo óptico é um trato da substância branca do SNC, o modelo rNAION é aplicável a estudos mecanísticos de isquemia seletiva da substância branca, bem como análises neuroprotetoras e mecanismos de curto e longo prazo de resposta glial e neuronal à isquemia.

Introdução

Anterior não arterítica neuropatia óptica isquêmica (NAION) é uma lesão isquêmica focal da porção anterior do nervo óptico (ON) ^1. NAION é a causa mais comum de súbita nervo relacionada perda de visão óptica em indivíduos com idade superior a 50 ^2. O mecanismo acredita-se ser uma síndrome do compartimento que resulta em edema intraneural, e provoca a compressão dos capilares que abastecem os axónios no interior do nervo óptico ^3.

Uma vez que o NO é, na verdade, um aparelho do sistema nervoso central (SNC), o modelo de roedor NAION (rNAION) podem ser usadas para estudar os mecanismos e as respostas a derrames do SNC isolada da substância branca. O modelo rNAION podem portanto ser úteis no dissecando muitos problemas associados com o acidente vascular cerebral relacionado danos à substância branca. Ele pode ser usado para avaliar diferentes estratégias neuroprotectoras e agentes de acidente vascular cerebral em matéria branca.

Uma das características mais atraentes do modelo é que ele é, Um procedimento não invasivo indolor. A energia laser pode ser ajustado para produzir vários graus de dano isquémico. Outra característica é que ele se baseia em radicais superóxido induzida por laser para danificar o endotélio capilar, produzindo uma disfunção progressiva capilar. É esta disfunção progressiva e edema que acredita-se ser muito semelhante ao mecanismo que faz com que NAION. A pesquisa mostrou que ele não causa a coagulação do capilar directa, mas funciona através de pelo menos dois mecanismos: superóxido induzida por morte e de extracção de algum do capilar de células endoteliais ^4, e de NFkB (factor nuclear-cadeia kappa-luz-potenciador de células B activadas ) associado regulação inflamatória-se em permanecer endotélio, com o aumento do transporte de fluidos através das membranas celulares para o interstício ^5. O encerramento dos capilares nervo óptico e compressão causados ​​por resultado a acumulação de fluido intersticial em isquemia cabeça do nervo óptico. Um diagrama esquemático é mostrado naFigura 2. O modelo rNAION pode ser usado em ambas as espécies de ratos e camundongos ^6,7, e pode ser variada no nível da sua gravidade, a partir de uma lesão ligeira a uma destruição total, mas indolor do nervo óptico e da retina, tais como a oclusão da artéria central da retina (OACR).

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Maryland Animal Care Institucional e Comitê de Utilização (IACUC; Baltimore, MD, EUA)

1. Experimental Set-up

1. Faça um costume projetado lente de contato de um grau claro óptica circular 7 mm de diâmetro Plexiglas, de 3 mm de espessura. Corte as lentes circulares com uma imprensa de broca. Use uma broca padrão para fazer a curva interior, e, finalmente, polir as curvas internas e externas usando um polidor de lentes de contato do grão ultrafino (1000/3000).
2. Prepare 2,5 mM Rose Bengal (RB) em pH 7,4 tampão fosfato salino (PBS) com antecedência, filtro de esterilização com um filtro de seringa de 0,45 micron e armazenamento de alíquotas de 1 ml em -20 ° C num recipiente à prova de luz até 6 meses.
   NOTA: O uso de animais machos exogâmicas albinos, como Sprague Dawley minimiza as diferenças de resposta dependentes de tensão, permite maior facilidade de indução e reduz a variabilidade que pode ocorrer com cycli estrofeminino ng.
3. Configurar a frequência duplicou granada de alumínio de neodímio-ítrio (Fd-YAG) laser médico oftalmológico, o que gera uma luz laser de 532 nm. Montar o laser sobre uma lâmpada de fenda oftálmica Haag-Streit usando um adaptador de laser oftalmológico padrão. Este dispositivo disponível comercialmente permite a visualização simultânea de aplicação mancha olho e laser do animal. O laser médico também tem um feixe de mira para a focagem adequada e centragem utilizando mesmo tamanho de ponto como indução laser. parâmetros de potência do laser são os seguintes:
   1. Para a indução rNAION rato: use 500 um ponto de tamanho / 50 do laser mW de potência / 1.000 ms duração / 1.000 intervalo ms.
   2. Para a indução rNAION mouse: alterar o tamanho do ponto a 300 mm para disco óptico menor e deixar outros parâmetros o mesmo que a configuração do rato.
   3. Rotineiramente usar um medidor de potência do laser para assegurar a potência do laser.

2. Procedimento Experimental

1. Ligue a potência do lasere configurar o parâmetro do laser apropriado. Aquecer a laser para, pelo menos, cinco minutos antes da utilização.
2. Pesa-se o animal para determinar a dose apropriada para a cetamina / xilazina e corante RB. Anestesiar o animal por injecção intraperitoneal de uma mistura de 1 ml / kg de 80 mg / ml de cetamina e 4 mg / ml de xilazina.
3. Deixe o animal em uma gaiola aquecida até que esteja totalmente anestesiado. Verifique se há nenhuma resposta a estímulos aversivos (cauda ou pitada dedo do pé). Verifique animais para a profundidade da anestesia a cada 10 min.
4. Dilatar as pupilas do animais com tropicamida a 1% e anestesiar a superfície do olho com 0,5% de proparacaina. Se o uso de animais pigmentados, como Long Evans, um 2,5% gotas oculares neosynephrine vai aumentar a dilatação da pupila.
5. Use a tesoura para cortar os bigodes perto do focinho do lado para ser induzido para evitar o bloqueio a vista.
6. Coloque uma gota de 1% de metilcelulose ou outra gota de acoplamento oftálmica para o interior da lente de contato feito por encomenda, e depois aplicar a lente em tele olho de rato.
7. Colocar o animal sobre uma plataforma ajustada para a altura da lâmpada de fenda. Definir a cabeça do animal em um ângulo de 45 °, de modo que o olho é perpendicular à lâmpada de fenda e feixe de laser.
8. Visualize no olho através da lâmpada de fenda oftálmica. Verifique se o feixe de mira é o tamanho certo, bem como focado e centrado diretamente sobre o nervo óptico visualizado. Fotografar o fundo da retina usando uma câmera digital com alta ASA (1.200 - 2.000) Velocidade montado em uma das peças oculares da lâmpada de fenda com um adaptador personalizado feito.
   NOTA: A capacidade de ver os vasos da coróide revela a transparência da retina. Este é um sinal importante, a fim de ser capaz de detectar a isquemia retiniana mais tarde, que podem confundir a interpretação, se ocorrer. rNAION é a isquemia do nervo óptico, o que resulta na perda de CGR isolado, enquanto isquemia retinal resulta em danos na retina que afecta todas as células das camadas internas da retina.
9. Opcionalmente, ainda mais a imagem da retina enervo óptico usando um domínio de óptica espectral coerência tomógrafo ^(SD-08 de outubro) para avaliar o olho induzida por un. Digitalizar en face (Figura 3B), bem como 7 varreduras em corte transversal através da retina (Figura 3C). O SD-OCT imagem usa a mesma lente de contato usado para indução laser.
10. Injectar 1 ml / kg RB por via intravenosa através da veia da cauda, ​​e aguarde 30 segundos, em seguida, ativar o poder do laser. Este atraso de tempo permite que a RB para distribuir uniformemente por toda a circulação. Nós usamos um pulso de laser de 50 mW em um seg / pulso. energias maiores (≥ 60 mW) pode danificar a retina ou causar isquemia vascular da retina.
    Cuidado: Certifique-se de toda a gente tem um par de óculos de filtragem de segurança do laser do comprimento de onda de bloqueio adequada para evitar a luz do laser de rua entrando olho do investigador.
    NOTA: A administração de laser deve ser administrado rapidamente após a injecção IV RB desde que o corante é rapidamente eliminado da circulação. Quanto mais tempo a indução de laser, quanto mais grave a isquemia do nervo óptico. Geralmente, os animais são dadas 7 - 12 s impulsos numa sucessão rápida. O contacto da luz laser com o corante circulante dá os vasos do nervo óptico uma bela brilho de ouro que pode ser visto através da lâmpada de fenda (Figura 4B). Isto prova que o corante foi injectada sistemicamente e distribuída para a corrente sanguínea. Se o brilho é fraco, ou nenhum (Figura 4A), o corante não foi injetado por via intravenosa. Neste caso, não dão uma segunda injecção imediatamente, uma vez que o animal vai necessitar de recuperar durante pelo menos dois dias antes da reinjecção.
11. Imediatamente após a indução, retire a lente de contato. Cubra os dois olhos com pomada oftálmica antibiótica triplo (Neosporin / polimixina / bacitracina) com dexametasona, e colocar o animal em uma almofada de aquecimento de 37 ° C em uma única gaiola alojados sob observação até a recuperação completa.
    1. Limpe a lente de contato com água destilada water e seque com um pano de limpeza não abrasivo para uso futuro.
    2. Dois dias após a indução avaliar o edema do nervo óptico por ambos cor fotografia fundo e SD-OCT análise ^8.
       NOTA: Comparando o grau de edema do nervo óptico dá uma estimativa da gravidade da isquemia do nervo óptico. Em dois dias, a margem de disco nervo óptico é turva, e as veias da retina são ligeiramente dilatada, em comparação com o olho contralateral (induzida por un). Execute eletrorretinografia (ERG) e flash potencial evocado visual (VEP ¹¹⁾ em duas e quatro semanas após a indução para análise de eletrofisiologia.

Resultados

A visualização da lente de contato habilitado central de retina (Figura 1). O ponto de laser focal ilumina o disco óptico na parte posterior da retina (Figura 2). A retina normal, induzida por un é mostrado fotografada pela lâmpada de fenda bio-microscópio (Figura 3A) e pela SD-OCT (Figura 3B e 3C). Durante a indução do laser, quando não está presente corante está presente na circulação, de luz laser não resulta em...

Discussão

Embora haja um certo número de modelos de lesão do nervo óptico (esmagamento do nervo óptico ^12, a transecção do nervo óptico ^13, e PION ^14), o modelo rNAION é humano, adaptável a ambos os ratos e ratinhos. Assemelha-se mais de perto a situação clínica humana de NAION. Esta condição inclui anterior progressiva edema do nervo óptico, uma síndrome do compartimento anterior do nervo óptico, isquemia focal axonal, isolado lesão axonal de células ganglionares da retina e perda de mais de um c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Laser de 50 mW 532 nm	Iridex		Laser oftálmico padrão
0 - 100 mW Laser de 532 nm	Tecnologias		Substituto do adaptador de
lâmpada de fenda a laser	iridex Adaptador acoplado Iridex		SMA para saída de laser
Medidor laser Coherent Fieldmate com sensor de termopilha	Coerente		outros também apropriados
Exame oftálmico Lâmpada de fenda biomicroscópio	Vários		Haag-Streit é o melhor; versões mais baratas disponíveis no ebay
Rose Bengal	Sigma	330000-1G	Agente fotoindutor Lente de
contato de fundo ou lamínula de vidro	personalizada / Cantor e Nissel (Reino Unido)		Lente plástica planoconvexa projetada sob medida para exame oftalmológico e indução
Tropicamida 1%
Composto de polimento Tamiya	Tamiya, INC	87068	lente de contato de polimento
2,5% Hipromelose (Goniovisc)/1% Metilcelulose	HUB Agente	de acoplamento
2,5% Neosinefrina Gotas oftálmicas	Alcon labs		agente dilatador de pupila
Tropicamida 1%	Agente dilatador de pupila	Alcon labs
0,5% Proparacaína	Alcon labs		anestésico tópico
30 G seringa de insulina de agulha fundida	Vários	Vários	para injeção intravenosa de rosa bengala
Pomada antibiótica oftámica com dexametasona adicionada (pomada antibiótica tripla)	Vários	Vários	Aplicar após indução para minimizar cicatrizes na córnea
Heidelberg Corporation Tomógrafo de coerência óptica de domínio espectral	Heidelberg Corporation		For Optical coerence measurements baseline e post-induction; não essencial para indução

Laserglow de lentes de contato farmacêutico