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Artigo de método

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

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DOI:

10.3791/54525

⸱

13 de outubro de 2016

 , 
1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes

Neste artigo

Resumo

Mostramos como preparar fatias oblíquas da medula espinhal em ratos jovens. Esta preparação permite que a estimulação das raízes ventrais.

Resumo

gravações electrofisiológicos a partir de fatias de medula espinal têm provado ser uma técnica valiosa para investigar um grande número de questões, a partir de propriedades da rede celular. Mostramos como preparar fatias oblíquas viáveis ​​da medula espinhal de ratos jovens (P2 - 11). Nesta preparação, os motoneurónios reter os seus axónios que sai das raízes ventrais da medula espinal. A estimulação desses axônios provoca back-propagação potenciais de ação que invadem o somas motoneurônio e emocionantes garantias do motoneurônios na medula espinhal. Gravação de potenciais de ação antidrômicos é uma forma imediata, definitiva e elegante para caracterizar a identidade motoneurônio, que supera outros métodos de identificação. Além disso, estimular as garantias de neurónios motores é uma maneira simples e confiável para excitar os alvos colaterais dos neurónios motores na medula espinhal, como outros neurónios motores ou Renshaw células. Neste protocolo, apresentamos gravações antidrômicos do motoneurônio somas, bem como excitação celular Renshaw, resultante da estimulação da raiz ventral.

Introdução

Historicamente, as gravações de neurónios motores que utilizam afiado-eléctrodo foram realizadas in vivo em animais de grande porte, tais como gatos ou ratos 1, ou por um conjunto isolado da medula espinal em ratos 2. O surgimento da técnica de gravação de patch-clamp durante os anos 1980, chamado para o acesso directo à motoneurônio somas como a selagem necessária para ser alcançado sob a orientação visual. Assim, a preparação fatia da medula espinal foi prontamente alcançado desde o início da década de 1990 3. No entanto, a preparação fatia precoce muitas vezes não permitir a estimulação das raízes ventrais. Para o melhor de nosso conhecimento, apenas dois estudos relataram a estimulação bem sucedida das raízes ventrais em fatias transversais, e nenhuma foi obtido a partir de camundongos 4,5.

Neste artigo apresentamos uma técnica para alcançar fatias de medula espinhal viáveis ​​de ratos neonatal (P2 - P11) em que o agregado neuromotor mantém suas raízes partida axônios ventral. respiradouroestimulação da raiz ral desencadeia potencial de ação antidrômica de volta para as somas do agregado neuromotor sair da mesma raiz ventral. Ele também excita os objectivos de garantia de neurónios motores, outros motoneurônios 6-10 e as células de Renshaw 11-13. Uma vez que apenas neurónios motores enviam seus axônios para baixo as raízes ventrais, usamos o registro de potenciais de ação antidrômicos como uma maneira simples e definitiva para fisiologicamente identificar neurónios motores 10.

Além de usar critérios eletrofisiológicos e morfológicos potencialmente não incluído ou enganosas para confirmar a identidade motoneurônio, estudos recentes sobre neurónios motores da medula espinhal também contou com tediosa e demorada post hoc colorações 16. Esta identificação é normalmente realizado apenas numa amostra das células gravadas. Outras estratégias de identificação dependem de linhas de rato em que os neurónios motores expressar fluorescência endógena 17-19. No entanto, usando marcadores codificados geneticamente pode ser difícil em uma idade jovem, quando a expressão do marcador ainda é variável ou se o estudo já requer o uso de uma linha de rato transgénico. Alternativamente, as gravações de potenciais de acção antidrômica pode ser realizado rotineiramente em todos os ratinhos a partir do início da gravação célula. Experimentadores de trabalho sobre os preparativos da medula espinhal intactas no gato, rato e rato, têm utilizado de forma confiável tais técnicas de identificação desde 1950, 1,2,20,21. Em condições óptimas, fomos capazes de desencadear potenciais de acção antidrômicos a partir de praticamente todos os neurónios motores gravados.

Além disso, a estimulação raiz ventral pode ser usado com fiabilidade para excitar outros motoneurónios 22,23 ou os seus alvos. as células de Renshaw 10,24,25. Apresentamos aqui as aplicações da estimulação raiz ventral na forma de ação antidrômica potenciais gravações de somas motoneurônio, bem como excitação de células de Renshaw.

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Protocolo

Os experimentos foram realizados em conformidade com as directivas europeias (86/609 / CEE e 2010-63-UE) e da legislação francesa, e foram aprovados pelo comitê de ética Paris Descartes University.

1. Spinal Cord Slice Preparação

  1. Prepare as seguintes soluções diárias ou um dia de antecedência. Se mantida durante a noite, bolha, com 95% de O2 e 5% de CO 2 e manter refrigerado em frascos bem fechados.
    1. Prepare baixo Na + fluido artificial cerebrospinal (ACSF): KCl a 3 mM, 1 mM de NaH 2 PO 4, sacarose 230 mM, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM de CaCl 2, 8 mM de MgCl2, glucose 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 1 mM de Na-cinurenato, 2 mM de Na-piruvato. Bolha com 95% de O2 e 5% de CO 2 (pH 7,4). Desde Na-cinurenato é muitas vezes difícil de dissolver-se, certifique-se de comprar o que está listado na tabela de materiais.
    2. Prepare solu K-gluconatoção: mM de K-gluconato 130, KCl 15 mM, EGTA 0,05 mM, HEPES 20 mM, glicose 25 mM, 1 mM de Na-cinurenato, 2 mM de Na-piruvato, ajustado para pH 7,4 com KOH.
    3. Prepare ACSF: 130 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 1 mM de NaH 2 PO 4, 26 mM de NaHCO3, glucose 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 2 mM de Na-piruvato. Bolha com 95% de O2 e 5% de CO 2 (pH 7,4).
    4. Antes do início da dissecção, dissolve-se 2% de agar em 80 ml de solução de K-gluconato, e mantê-lo aquecido a 60 ° C.
  2. intracardíaca perfusão
    1. Executar esta preparação em ratos fêmeas e machos, com idade variando de P2 para P11.
    2. Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de 0,1 ml de 25 mM de pentobarbital sódico (50 mg / kg).
    3. Usando agulhas ou fita, imobilizar o mouse sobre as suas costas em uma grande placa de petri preenchida com silicone. Use um microscop dissecandoe para o resto da dissecção.
    4. Segurando a extremidade do esterno, levantar o peito e corte do diafragma utilizando uma tesoura fina. Em seguida, abra o baú em ambos os lados, cortando as costelas para expor o coração.
    5. Corte o átrio direito antes de perfurar o ventrículo esquerdo com uma agulha 27G.
    6. Perfundir com gelado de baixo Na + ACSF. Depois de 30 segundos, de baixo Na + ACSF deve ser visto que flui para fora do átrio. Baixa quantidade de sódio evitar que as células de spiking e reduzir a morte celular durante a dissecção.
    7. Manter que prende a agulha no coração sob o microscópio de dissecação até que o fígado torna-se amarela quando o sangue é drenada.
  3. Dissecção da medula espinhal
    1. Decapitar o animal e colocá-lo em seu estômago.
    2. Remover rapidamente a pele das costas (Figura 1A1). Faça dois cortes através dos ombros e indo para baixo da caixa torácica (Figura 1A2). Em seguida, corte o cabo como lOW quanto possível na secção de caudal de modo a isolar a coluna vertebral com o início das nervuras a partir da parte inferior do animal. Virar o animal novamente e remover as vísceras ainda ligado às costelas.
    3. Transferir a coluna vertebral para outro, menor placa de Petri cheia de silício e utilizar 4 pinos de insectos para segurá-la dorsal voltada para cima (Figura 1A).
    4. Continuamente perfundir o animal com ACSF borbulhou-carbogénio (a cerca de 4 ° C) durante a execução de uma laminectomia de lado dorsal, e expor a medula espinal a partir da extremidade rostral (Figura 1B). Para fazer isso, insira a ponta de uma tesoura fina entre o osso e da medula espinhal e cortar o osso, pouco a pouco a partir do final rostral, certificando-se de ficar longe da matéria branca. Suplente de cada lado ao usar uma pinça para manter longe a banda do osso já cortadas (Figura 1B1).
    5. Usando as mais pequenas tesouras primavera disponíveis e pinças, levante a dura e cortarem ambos os lados ao mesmo tempo que prende a parte solta da dura-máter de modo a evitar danificar a espinal medula com a tesoura. Corte ao longo do eixo rostro-caudal.
      NOTA: A dura-máter é uma membrana contínua semi transparente; nesta idade a pia-máter é muito frágil e se parta durante a dissecção e corte (Figura 1B2).
    6. Uma vez que a dura-máter é a utilização removeu um vidro sem corte ou a ponta de plástico para empurrar suavemente a cabo no lado esquerdo da ranhura formada pela coluna meia-cortada da coluna vertebral, e cortar as raízes ventrais e dorsais no lado direito, a partir do lado rostral , mais distante, onde eles entram na medula (alguns mm, pelo menos, Figura 1B2).
    7. Repita a operação do lado esquerdo, sempre indo de rostral para caudal. Se canhoto, comece a partir do lado esquerdo e, em seguida, passar para o lado direito.
  4. Incorporação em agar
    1. Deslize o cabo da coluna vertebral. Use um pino de insetos menores de fixar para baixoo cabo com o dorsal superfície para cima e delicadamente remover qualquer pedaço de membrana ainda ligado a ele (Figura 1C1).
    2. Uma vez limpo, cortar ambas as extremidades (Figura 1C2). Insira um pino de insetos dobrado na parte anterior da medula para manipular o cabo e observe a sua orientação (seta na Figura 1C2). Em seguida, transferir a medula espinal a uma solução de K-gluconato gelada.
      NOTA: Esta solução imita a composição intracelular do CSF e impedirá que as células morram de choque osmótico uma vez que os neurónios motores serão cortados 26.
    3. Uma vez que a medula espinal está dentro da solução intra-celular, levar o copo com o ágar para fora do banho seco e arrefece-se para baixo sobre uma mistura de gelo e água.
    4. Manter agitação enquanto se mede a temperatura. Quando a temperatura atinge 38 ° C mergulhe a medula espinhal, segurando-o pelo pino de insetos e colocá-lo lado rostral para baixo. Certifique-se a medula espinhal é como straight possível, longe das paredes, parte caudal ligeiramente para cima (Figura 1D1).
    5. Deixar o copo na mistura de gelo e água, para permitir o agar solidificar mais rapidamente possível. Certifique-se de que fique no lugar e que o cabo é o mais reto possível (Figura 1D1).
  5. Cortando
    1. Após a solidificação, cortar o bloco de agar contendo a medula espinal, de tal maneira que a base do bloco é a um ângulo de 35 ° com a parte lombar da medula (seta na Figura 1D2). A superfície dorsal deve estar voltada para longe da base (Figura 1D2).
      NOTA: Este é um passo crítico no processo, para manter a continuidade das piscinas de neurónios motores para as raízes ventrais de onde eles saem.
    2. Cole o bloco para dentro da câmara do vibratome utilizando de cola de cianoacrilato. Mergulhá-lo na solução de K-gluconato e adicionar solução de K-gluconato congelada slushed para mantero banho frio (abaixo de 2 ° C).
    3. Corte 350 - 400 mm fatias grossas de região lombar (identificável pela sua curvatura e diâmetro maior). Na sua orientação adequada (ver 1.4.1.), Use a lâmina para cortar a partir da dorsal à superfície ventral e fazer fatias continuamente mais rostral. Normalmente, existem 4-5 fatias adequados, com raízes ventrais que se estendem 2 mm ou mais. Utilize os seguintes parâmetros: 10 ° de ângulo, frequência de vibração 70 Hz e 10 mm Velocidade / min de corte.
  6. Incubação
    1. Transferir as fatias para ACSF a 34 ° C. Após cerca de 30 min, arrefecer as fatias até à TA e começar a sessão de gravação.

figure-protocol-1
Figura 1. Dissecção
A1:. A remoção da pele da parte de trás para expor a coluna dorsal A2:Corte dos ombros e costelas para libertar a coluna dorsal B1:. Coluna vertebral fixado na placa de Petri cheia de silício (lado dorsal para cima, lado caudal esquerda) B2:. Mesmo com a medula espinal exposta e dissecados C1:. Medular isolada . (lado rostral esquerda) C2: medular pronto para ser incorporado (lado ventral para cima, lado rostral esquerda). Observe o pino de insetos menores no lado rostral D1:.. Medular no copo de agar (lado rostral dow, lado ventral de frente para a parte inferior) D2: bloco de agar Cut com a medula espinhal incorporado. Nota o ângulo de 35 ° as formas medulares com a base do bloco e do alargamento lombar (Seta). Barras de escala 1 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Colocar a fatia para a Câmara

NOTA: Ventral raízes são de tamanho variável.

  1. Prepara-se uma caixa de várias pipetas com diâmetros ponta variando de 40 a 170 um com antecedência. Para preparar pipetas de sucção, prepare muitos pipetas com um longo cone. Usando uma faca de diamante, fazer um corte em diferentes posições. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, quebrá-lo por bater a ponta com uma pinça.
  2. Retire a câmara do microscópio de gravação e colocá-lo sob um microscópio de dissecação.
  3. Seleccionar uma fatia que contém uma raiz ventral de comprimento suficiente (2 mm ou mais) para ser montado sobre um eléctrodo de estimulação de sucção. Marque a orientação correcta da fatia com as raízes ventrais para cima (Figura 2A) e delicadamente cortar o agar em torno das raízes ventrais, deixando o resto do agar em volta da fatia (Figura 2B).
    Observação: Uma vez que o ágar é mais firme do que a fatia, isto irá permitir que os fios da âncora da fatia para descansar sobre o agar em vez de sobre a fatia e, assim, a umnchor não irá danificar o tecido. Certifique-se os fios da âncora do fatia estão acima do agregado neuromotor (mostrado em vermelho na Figura 2C).
  4. Montar a câmara de volta para o microscópio e continuamente perfundir a câmara de registo com ACSF a uma taxa de 1-2 ml / min, à RT. Usando uma pipeta de vidro preenchido com ACSF e ligado a uma seringa, uma chupar da raiz ventral (seta na Figura 2C). A fim de alcançar uma boa estimulação da raiz ventral, a ponta da pipeta tem de ser apertado em torno da raiz ventral. Um pólo deverá estar no eléctrodo estimulante e o outro no banho (ou ligada ao eléctrodo de referência de fixação adesivo).
  5. Atingir gravação de patch-clamp do tipo de célula desejado e registar o efeito de estimulação da raiz ventral, tal como descrito materialização 10.
    1. Aqui, usar um amplificador para aquisição de dados. Filtrar gravações de célula inteira a 3 kHz. Digitalizar a 10 kHz. Compensar a resistência ponte em curreModo de NT-braçadeira.

figure-protocol-2
Figura 2. Preparação de raiz ventral
A: fatia lombar da medula espinhal incorporado em agar com a raiz ventral para cima B:. Fatia da medula espinal lombar com as raízes ventrais libertados do agar C:. Fatia da medula espinal lombar com um eletrodo estimulante firmemente colocados ao redor das raízes ventrais (seta) . Observe a localização das células que expressam Renshaw fluorescência vermelha na 28 chrna2-Cre rato cruzado com o repórter do mouse R26 Tom 17. Barras de escala de 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Confirmação do motoneurônio Identidade Usando Potenciais antidrômica Ação

segmentação celular

Os motoneurónios são encontrados no corno ventral (no vermelho visível na Figura 2C). Iniciar a partir do feixe de axônios que formam a raiz ventral e ir até o feixe dispersa totalmente e um começa a ver grandes células (eixo...

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Discussão

corte oblíquo da medula espinhal é importante uma vez que permite a estimulação unilateral de piscinas de neurónios motores e células de Renshaw em um único segmento vertebral de uma forma fiável, completo e específico. Além disso, ele permite uma identificação rápida, elegante e não-ambígua de neurónios motores gravados. Em seguida, vamos destacar as vantagens desta técnica em comparação com outros métodos de preparação fatia, e depois vamos forçar para fora das armadilhas mais comuns para evitar durante a realização d...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer por sua ajuda em tomar as fotografias. Os autores agradecem também Arjun Masukar e Tobias Bock pela revisão do manuscrito. apoios financeiros foram fornecidos pela Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), o NIH-NINDS (R01NS077863), a Fundação Latran Thierry (OHEX Projeto), a associação francesa para miopatia ( número de concessão 16026) e Target ALS é reconhecido agradecimento. Felix Leroy foi o destinatário de um "Contrato de Doutorado" da Ecole Normale Supérieure, Cachan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Na-kynurenateABCAMab120256dissolve-se melhor do que outras marcas
KClSigmaP3911
NaH2PO4SigmaP5655
sacarose SigmaS9378
NaHCO3 SigmaS6014
CaCl2 G BiosciencesR040
MgCl2 Qualidade Biológica351-033-721
glicose ÁcidoG5767
SigmaA5960
Na-piruvato SigmaP2250
K-gluconatoSigmaP1847
EGTA SigmaE3889
HEPES SigmaH4034
NaClSigmaS9888
ÁgarSigmaA9799
QX-314AlomoneQ150
Mg-ATPSigmaA9187
CsOHSigma232041
Na-GTPSigma51120
ácido glucônicoSigmaG1951
Solução de hidróxido de césioSigma232041
KOHSigmaP5958
Vannas - 2.5mm FST15000-08só pode ser usado para cortar a dura-máter, pode ser danificado se cortar ossos
EstimuladorA-M SystemsModelo 2100
VibratomeCampdenMicrótomo Vibratório 7000 - Modelo 7000smz-2
ascórbico Sigma Tesoura de mola de Pulso Isolado

Referências

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