Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Summary

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Abstract

Identificar o(s) alvo(s) molecular(is) de pequenas moléculas é um passo desafiador, mas necessário, para entender seu mecanismo de ação. Embora vários métodos de identificação de alvos tenham sido desenvolvidos e usados para elucidar com sucesso as proteínas de ligação de uma variedade de pequenas moléculas, essas técnicas têm desvantagens que as tornam inadequadas para detectar certos tipos de interações pequenas molécula-alvo. Em particular, as interações não covalentes que dependem de condições celulares nativas, como as de proteínas de membrana cujas estruturas podem ser perturbadas na lise celular, muitas vezes não são passíveis de métodos de identificação de alvos baseados em afinidade. Aqui, demonstramos um método em que uma sonda contendo um grupo fotolábil é usada para reticulação covalente com a proteína de ligação a pequenas moléculas dentro do ambiente da célula viva, permitindo a detecção e isolamento da proteína alvo sem a necessidade de manutenção da interação após a lise celular. Esta técnica é uma ferramenta valiosa para estudar pequenas moléculas biologicamente interessantes com mecanismos desconhecidos, tanto no contexto da biologia básica quanto na descoberta de medicamentos.

Introduction

pequenas moléculas bioactivas fundamentalmente trabalhar por interagir com e alterar a função de uma ou mais moléculas de "alvo", mais comumente proteínas, na célula. Na descoberta de medicamentos, quando um composto activo é descoberto por meio de triagem fenotípica, a identificação do alvo molecular (s) de que o composto é crucial não apenas para a compreensão do mecanismo de acção e os potenciais efeitos colaterais do composto, mas também para potencialmente descobrir nova biologia subjacente ao modelo de doença e preparando o caminho para o desenvolvimento de novas classes mecanicistas de terapêutica ^1. Embora a identificação do alvo não é necessária p....

Protocol

NOTA: Este protocolo foi adaptado do MacKinnon e Taunton ¹⁰ para utilização em células vivas.

1. Preparação de células cultivadas

1. Prepare estéreis 6 cm placas de cultura de células para o número de amostras desejado (ver abaixo).
   NOTA: Uma placa de células é utilizado por condição de tratamento, mas se for necessária mais proteínas 2 ou 3 pratos podem ser preparados por condição e combinadas depois da irradiação UV.
   1. Preparar pelo menos 3 pratos de células; controle negativo com apenas DMSO (D), o tratamento Probe única (P), e sonda + concorrente (C).
   2. Opcionalmente, preparar um prato 4 ^t....

Results

Os resultados aqui apresentados foram obtidos com uma sonda de foto-afinidade do itraconazol droga antifúngica, cuja utilização tem sido publicado anteriormente ^16. Estes resultados demonstram a utilização da técnica de marcação por fotoafinidade-de células vivas para identificar com sucesso uma grande proteína de ligação de itraconazol como a de 35 kDa de proteína de membrana de tensão dependente de aniões Canal 1 (VDAC1).

Discussion

Diferentes abordagens para identificar os alvos de pequenas moléculas podem ser agrupadas em duas categorias: de cima para baixo, onde o fenótipo celular da droga é usada para diminuir seus alvos potenciais com base em suas funções conhecidas, ou bottom-up, onde o alvo é identificada directamente por meios químicos ou genéticos ^3. De cima para baixo ou estudos fenotípicos podem identificar certos processos celulares afectados pela droga (por exemplo, a transcrição / tradução / síntese do ADN, bloquei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	Life Technologies	20490	Faça um dia fresco de uso. Preparar o stock de 100 mM em água com 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil] amina (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare estoque de 1,7 mM em uma proporção de 4:1 de t-butanol para DMSO, armazene a -20  °C.
Sulfato de Cobre (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare o estoque de 50 mM em água e armazene em temperatura ambiente.
Ferramentas de Química de Biotina-azida	Click	AZ104-100	Prepare estoque de 10 mM em DMSO, armazene a -20  °C.
Alexa Fluor 647-azida	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM de estoque em DMSO, armazene a -20  °C.
Lâmpada UV de 365 nm	Spectroline	FC100	devem ser usados durante a operação.
Comprimidos inibidores de protease, sem EDTA	Roche Life Science	11873580001	Prepare a solução 50x em água e armazene a -20  °C.
Sonifier Sonicator	Branson	250	Definido para saída 1, duty 30%.
Scanner de gel fluorescente	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use laser vermelho para detectar Alexa-fluor 647.
Kit de ensaio de proteína Dc compatível com detergente	Bio-Rad	5000112
Contas de Estreptavidina Agarose de Alta Capacidade	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Médio, baixo teor de glicose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualificado	ThermoFisher Scientific	26140079
Solução de penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676