Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Resumo

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Resumo

Identificar o(s) alvo(s) molecular(is) de pequenas moléculas é um passo desafiador, mas necessário, para entender seu mecanismo de ação. Embora vários métodos de identificação de alvos tenham sido desenvolvidos e usados para elucidar com sucesso as proteínas de ligação de uma variedade de pequenas moléculas, essas técnicas têm desvantagens que as tornam inadequadas para detectar certos tipos de interações pequenas molécula-alvo. Em particular, as interações não covalentes que dependem de condições celulares nativas, como as de proteínas de membrana cujas estruturas podem ser perturbadas na lise celular, muitas vezes não são passíveis de métodos de identificação de alvos baseados em afinidade. Aqui, demonstramos um método em que uma sonda contendo um grupo fotolábil é usada para reticulação covalente com a proteína de ligação a pequenas moléculas dentro do ambiente da célula viva, permitindo a detecção e isolamento da proteína alvo sem a necessidade de manutenção da interação após a lise celular. Esta técnica é uma ferramenta valiosa para estudar pequenas moléculas biologicamente interessantes com mecanismos desconhecidos, tanto no contexto da biologia básica quanto na descoberta de medicamentos.

Introdução

pequenas moléculas bioactivas fundamentalmente trabalhar por interagir com e alterar a função de uma ou mais moléculas de "alvo", mais comumente proteínas, na célula. Na descoberta de medicamentos, quando um composto activo é descoberto por meio de triagem fenotípica, a identificação do alvo molecular (s) de que o composto é crucial não apenas para a compreensão do mecanismo de acção e os potenciais efeitos colaterais do composto, mas também para potencialmente descobrir nova biologia subjacente ao modelo de doença e preparando o caminho para o desenvolvimento de novas classes mecanicistas de terapêutica ^1. Embora a identificação do alvo não é necessária para um medicamento para ser usado terapeuticamente, nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento de que os novos candidatos a fármacos são mais propensos a ter sucesso em ensaios clínicos, e, portanto, produzir melhores retornos sobre o investimento, se um alvo validado é conhecida ^2. Assim, tem havido um crescente interesse em métodos para a identificação de pequenasproteínas alvo molécula.

Um experimento identificação do alvo clássica tipicamente depende de purificação por afinidade, em que a pequena molécula de interesse é imobilizada sobre uma resina e incubada com lisados ​​de células inteiras, após o que as proteínas não ligadas são lavadas e as proteínas restantes são eluídas e identificados ^3. Embora esta técnica tenha sido utilizada para identificar os alvos de muitas moléculas pequenas ^4, não é adequado como um método de identificação de destino universal para várias razões. Em primeiro lugar, a proteína alvo deve manter a sua conformação nativa após a lise celular, a fim de manter a sua capacidade de se ligar à molécula pequena. Isto pode ser particularmente problemático para proteínas de membrana, o que muitas vezes sofrem alterações conformacionais depois de ser removido do seu ambiente nativo, ou simplesmente agregado e precipitar para fora da solução. Em segundo lugar, a pequena molécula deve ser quimicamente modificado de tal forma que ele pode ser imobilizada na resina enquanto se mantéma sua capacidade de se ligar a proteína alvo. bolsas de ligação profundas podem, por conseguinte, tornam-se inacessíveis a uma molécula pequena, uma vez que é fixado à resina. Em terceiro lugar, a afinidade de ligação deve ser suficientemente elevada para que a interacção é mantido durante os passos de lavagem, tornando a identificação de interacções de afinidade inferiores desafiantes. Em quarto lugar, as condições ambientais tais como pH, concentração iónica ou a presença de outras moléculas endógenas pode variar espacialmente dentro da célula e são, por vezes, os pré-requisitos para a interacções fármaco-alvo. Assim, encontrar as condições correctas para permitir e manter do lado de fora da célula de ligação pode necessitar de uma quantidade significativa de tentativa e erro.

a marcação por fotoafinidade evita estes problemas, permitindo a ligação de uma pequena molécula e o seu alvo no contexto nativo de uma célula covalente. Em vez de imobilizar a molécula pequena a uma grande resina volumosa, em vez da molécula é quimicamente modificados para instalar duas pequenas g funcionalrupos: uma porção fotoactivável que permite a reticulação covalente à proteína alvo quando irradiado com um comprimento de onda particular de luz, e um grupo repórter que permite que a proteína alvo a ser detectada e subsequentemente isolado. As células vivas são tratados com a sonda de fotoafinidade, a sonda liga-se e reticula covalentemente à proteína alvo, e o complexo sonda-proteína é em seguida isolada intacta. A especificidade de ligação ao alvo da sonda é demonstrada através da realização de uma experiência de competição em paralelo, em que um excesso do composto de origem é usada para competir distância de ligação da sonda para a proteína alvo.

O design e síntese de sondas de fotoafinidade varia muito de uma pequena molécula para outra, e não será coberto neste protocolo; no entanto, vários excelentes discussões sobre o assunto foram publicados ^5-9. A consideração principal é que a sonda retém a bioactividade do composto-mãe, por conseguinte presumabLY de ligação para o mesmo alvo (s). relação estrutura-actividade (SAR) estudos devem ser realizados para determinar que partes da molécula podem ser modificados sem perda de bioactividade. Uma variedade de diferentes grupos químicos têm sido utilizados como agentes de ligação cruzada foto-activáveis, incluindo diazirina, benzofenona, e azida de arilo, que cada um tem vantagens e desvantagens ^10. Da mesma forma, existem várias marcações repórter que foram utilizadas para isolar proteínas de ligação à sonda. Os grupos repórter podem ser funcionais por si sós, tais como a biotina utilizada ou etiquetas fluorescentes, ou podem ser precursores que requerem maior funcionalização subsequente ao passo de foto-reticulação, que tem a vantagem de ser mais pequeno e, assim, menos susceptíveis de comprometer bioactividade ^11.

Neste protocolo, utilizou-se uma sonda de fotoafinidade contendo um grupo diazirina fotorreticulação, e um alcino terminal para a ligação de um grupo descritor através de um Cu (I) -catalyzed Azide-Alcino Sharpless-Huisgen cicloadição (ou clique) reacção de ^12-15. Os estudos de SAR, sondar concepção e síntese, e os resultados destes estudos foram publicados em outros lugares ^16-18.

Protocolo

NOTA: Este protocolo foi adaptado do MacKinnon e Taunton ¹⁰ para utilização em células vivas.

1. Preparação de células cultivadas

1. Prepare estéreis 6 cm placas de cultura de células para o número de amostras desejado (ver abaixo).
   NOTA: Uma placa de células é utilizado por condição de tratamento, mas se for necessária mais proteínas 2 ou 3 pratos podem ser preparados por condição e combinadas depois da irradiação UV.
   1. Preparar pelo menos 3 pratos de células; controle negativo com apenas DMSO (D), o tratamento Probe única (P), e sonda + concorrente (C).
   2. Opcionalmente, preparar um prato 4 ^th como um controlo sem UV, a serem tratados com a sonda, mas não sujeita a luz UV.
      NOTA: Se várias moléculas concorrentes estão a ser testada, tais como diferentes análogos da pequena molécula de interesse, preparar as placas concorrente adicionais conforme necessário.
2. Adicionar células HEK293T para placas de cultura em 4 media ml de cultura. Use 3,5 milhões de cells por placa.
   NOTA: O número de células deve ser determinado para cada tipo de célula de modo a que as células são quase 100% confluentes no início da experiência, de modo a atingir o rendimento máximo de proteína. Para HUVEC, use 0,3 milhões de células por placa. Uma boa aproximação é de 10/01 as células confluentes em um prato de 15 centímetros. células HEK293T devem ser cultivadas em Dulbecco Modified Eagles Médium suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina.
3. Devolver as células na incubadora de cultura (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante a noite.

2. Tratamento de células e fotorreticulação

1. No dia seguinte, pré-aliquota os seguintes medicamentos em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga:
   1. Para o primeiro tratamento, adicionar 4 mL de DMSO para 2 tubos e 4 ul de 10 mM de concorrente (isto é, o composto parental não modificada) para um tubo.
   2. Para o segundo tratamento, adicionar 16 ul de DMSO para um tubo e 16 ul de 50 &# 181; M sonda de fotoafinidade a 2 tubos.
      NOTA: A concentração óptima pode ser diferente para sondas diferentes (ver discussão), mas entre 200-500 nm é um bom ponto de partida (aqui nós usamos 200 nM). A concentração do competidor deve ultrapassar o da sonda, pelo menos, 20 vezes (aqui usamos 10 uM). A concentração final de DMSO deve ser igual em todas as placas e não deve ser superior a 0,5% (volume de 20 ul).
2. Trazer as placas celulares na capa de cultura de células e adicionar as drogas pré-alíquotas do passo 2.1.1 do seguinte modo: Aspirar 1 ml de meio de cultura, ressuspensão a droga pré-alíquota na mídia, e adicionando-o suavemente de volta para a queda de placa sensato. Adicione o DMSO à (D) Placa de DMSO e a sonda (P) placa, e adicionar o concorrente para a competição (C) placa. Retornar as placas ao incubador de cultura durante 30 min.
3. Com luzes na capa de cultura esmaecido, adicione a sonda pré-alíquota do passo 2.1.2 para sondar (P) e as placas de concorrência (C) e adicione oDMSO para a placa de DMSO (D), como acima. Retornar as placas ao incubador de cultura durante 1 h.
4. Durante a incubação, preparar os seguintes itens; Uma bandeja de gelo que pode caber todas as chapas; tampão de lise arrefecido com gelo (PBS [pH 8,5] + 1x cocktail inibidor de protease [completo isento de EDTA, diluída a partir da solução estoque 50x feita em água]; 200? l / placa); tubos de microcentrífuga rotulado D, P ou C para cada uma das diferentes condições de tratamento, em gelo.
5. 15 min antes do final da incubação de 1 hora, configurar a lâmpada UV (365 nm) na sala fria e ligá-lo para aquecer a lâmpada.
6. Após 1 horas de incubação com a sonda, coloque pratos no gelo. Lavam-se as células cuidadosamente com 5 ml de PBS arrefecido com gelo (pH 7,4) para remover o excesso de sonda. Re-cobrir as células com 4 PBS ml gelada.
7. Colocar a placa de células centradas 3 cm abaixo da lâmpada de UV no topo de um bloco de gelo para minimizar o aquecimento da lâmpada. Irradiar durante 3 min. Remover o prato para a bandeja de gelo e repetir para todas as amostras.
8. UMAepois irradiação, aspirar o PBS a partir das células e adicionar 200 ul do PBS gelado (pH 8,5) com inibidores de protease para cada placa. Separe as células da placa com um raspador de borracha e transferência para os tubos de microcentrífuga pré-marcado em gelo.
9. Adicionar SDS para uma concentração final de 0,4% (10 ul de SDS a 10% em 250 ul de amostra).
   CUIDADO: SDS pó é perigosa. Evitar a inalação de pó SDS, vestindo uma máscara sobre o nariz ea boca.
10. Lisar as células por sonicação da suspensão para 10 impulsos de saída (1, ciclo de trabalho de 30%) e incubar em gelo durante 1 min antes de um segundo turno de 10 pulsos.
11. Se necessário, retire 2 ul de suspensão e verificar sob um microscópio de luz para assegurar a lise celular completa.
12. Ferver as amostras sobre uma placa quente a 95 ° C durante 5 minutos para completar a lise das células e desnatura todas as proteínas.
13. Medir a concentração de proteína em cada amostra utilizando um ensaio de proteína compatíveis com detergentes espectrofotométrica, tais como thDc e ensaio de proteína de ^19, de acordo com as instruções do fabricante, com um espectrofotómetro ajustado para medir a absorvância a 750 nm.
14. Normalizar a concentração de proteína de 2,5 mg / ml (ou se as concentrações são mais baixos do que 2,5 mg / ml, normalizar para a amostra com a concentração de proteína mais baixa) por adição de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS, conforme necessário (por exemplo, se as amostras são 5 mg / ml em 250 ul, adicionar 250 ul de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS para se obter uma concentração final de 2,5 mg / ml).

3. Fixação de Tag fluorescente por Click Química para a visualização de proteínas marcadas

1. Remover 40 pi de lisado celular e transferência para um novo tubo de microcentrifugação. Manter os lisados ​​restantes para a reacção com biotina-azida (passo 4).
2. Adicionar os seguintes reagentes em ordem: 0,2 ul fluor-azida (solução de reserva 1 mM em DMSO), 0,58 mL TCEP (estoque 100 mM em água com 4 equivalentes NaOH adicionado, elaborada fresco), e 3,38 TBTA ul (1.estoque 7 mM em uma proporção de 4: 1 de t-butanol a DMSO). Vortex para misturar.
3. Adicionar 1,14 ul de CuSO ₄ -5H ₂ O (50 mM em água) para iniciar a reacção. Vortex brevemente e incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro.
4. Adicionar 50 ul de tampão de amostra 2x SDS para extinguir a reacção. Neste ponto, executar as amostras directamente sobre um gel de SDS-PAGE ²⁰ para obter os melhores resultados, ou armazenar a -20 ° C durante a noite se necessário.
5. Se congelação amostras, aquecer durante 5 min a 95 ° C antes do carregamento para o gel.
   Observação: Uma vez que o peso molecular da proteína alvo tipicamente não é conhecida nesta fase, é aconselhável para executar 2 géis com diferentes concentrações de acrilamida (isto é, 8% e 15%), ou um gel de gradiente molecular gama de peso de largura (isto é, 4-15%), para assegurar a cobertura completa do peso molecular.
6. Quando a frente do corante atingiu a extremidade do gel, continuar a executar o gel durante mais 5 minutos para garantir que todo o excesso de unreacted fluor-azida saiu completamente o gel.
7. Remover o gel para um recipiente com _ddH2O e incubar durante 10 min com agitação suave, para lavar o excesso de fluor-azida.
8. Colocar o gel para uma placa de vidro e digitalização do gel utilizando um scanner de gel Typhoon fluorescente de acordo com as instruções do fabricante.

4. Fixação de Biotina Tag por Click Química por afinidade Purificação de proteínas marcadas

1. Dos lisados ​​restantes do passo 3.1, utilizar a quantidade máxima após a normalização da proteína de tal modo que todas as amostras são o mesmo volume (por exemplo, se após a normalização para 2,5 mg / mL os volumes de amostra resultantes são 500, 550, e 600 ul, utilizar 500 ul de cada).
2. Pré-limpar os lisados ​​pela adição de 50 ul de alta capacidade grânulos de agarose estreptavidina, 2x pré-lavada com PBS (pH 7,4). Incubar 1 h a 4 ° C com rotação.
3. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 1000 xg durante 3 min. Retirar tele sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação em gelo e descartar os grânulos.
4. Remover 1-2% da amostra de DMSO para um novo tubo marcado "entrada". Adicionar um volume equivalente de 2x tampão de amostra SDS e armazenar a -20 ° C.
5. Por 500 mL de lisado, adicione os seguintes reagentes: 1,38 mL biotina-azida (estoque 10 mM em DMSO), 5,5 ul TCEP, e 32,5 ul TBTA. Vortex para misturar.
6. Adicionar 11 ul CuSO ₄ 5H ₂ O por 500 mL de lisado e vortex brevemente. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
7. Adicionar 4 volumes de amostra de acetona arrefecida a -20 ° C. Agitar as amostras e incubar durante a noite a -80 ° C para precipitar as proteínas e completamente remover a biotina que não reagiu-azida.
8. Centrifugar as amostras a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as proteínas precipitadas.
9. Aspirar o sobrenadante completamente, e ressolubilizar as proteínas por sonicação em 150 ul de PBS (pH 7,4) + 1% de SDS.
10. Adicionar 600 ul de PBS (pH 7,4) para diluir a concentração de SDS a 0,2%.
11. Adicionar as amostras de 30 ul de pré-lavado com estreptavidina de alta capacidade esferas de agarose e incubar durante 1 hora a 4 ° C com rotação.
12. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 1000 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante contendo proteínas não ligadas e descarte.
13. Adicionar 1 ml de tampão de lavagem (NaCl 400 mM, Tris 50 mM, SDS a 0,2%, pH 7,4) às pérolas e incubar 5 minutos à temperatura ambiente com rotação.
14. Repita os passos de 4.12 e 4.13 3 vezes.
15. Aspirar o tampão de lavagem completamente a partir dos grânulos, e adicionar 30 ul de tampão de amostra 2x SDS.
16. Incubar durante 5 min num bloco de calor a 95 ° C para libertar as proteínas a partir das esferas.
17. Centrifugar os grânulos durante 1 min a 13.000 x g à temperatura ambiente.
    NOTA: neste momento, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até estar pronto para ser executado por SDS-PAGE. Se congelação amostras, aquecer durante 5 min a 95 ° C antes da utilização.
18. Cuidadosamentepipetar o tampão de amostra contendo proteínas fora dos grânulos, e carregar em SDS-PAGE ²⁰ (ver considerações importantes abaixo). Os grânulos podem ser guardadas para fervura do mais tarde, se necessário.
    NOTA: Para a detecção de proteínas por coloração com prata, melhores resultados são obtidos usando um gel espesso de 1 mm. Se uma banda está a ser cortada para fora do gel corado com prata para análise de espectrometria de massa (MS), preparar todos os reagentes frescos a partir de soluções estéreis e deixar um poço vazio entre amostras no gel. Para cada faixa de corte da pista sonda, uma fatia paralelamente devem ser tomadas a partir da pista de DMSO de modo que as proteínas do fundo podem ser subtraídos. Para a validação de identificação de proteínas por transferência de western, é também crítico para carregar a amostra de entrada a partir do passo 4.4 durante a execução do gel de SDS-PAGE.
19. Seguir um protocolo padrão para qualquer coloração com prata ou Western blot, ^{21, 22} para detectar a proteína (s) alvo.

Resultados

Os resultados aqui apresentados foram obtidos com uma sonda de foto-afinidade do itraconazol droga antifúngica, cuja utilização tem sido publicado anteriormente ^16. Estes resultados demonstram a utilização da técnica de marcação por fotoafinidade-de células vivas para identificar com sucesso uma grande proteína de ligação de itraconazol como a de 35 kDa de proteína de membrana de tensão dependente de aniões Canal 1 (VDAC1).

Discussão

Diferentes abordagens para identificar os alvos de pequenas moléculas podem ser agrupadas em duas categorias: de cima para baixo, onde o fenótipo celular da droga é usada para diminuir seus alvos potenciais com base em suas funções conhecidas, ou bottom-up, onde o alvo é identificada directamente por meios químicos ou genéticos ^3. De cima para baixo ou estudos fenotípicos podem identificar certos processos celulares afectados pela droga (por exemplo, a transcrição / tradução / síntese do ADN, bloquei...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	Life Technologies	20490	Faça um dia fresco de uso. Preparar o stock de 100 mM em água com 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil] amina (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Prepare estoque de 1,7 mM em uma proporção de 4:1 de t-butanol para DMSO, armazene a -20  °C.
Sulfato de Cobre (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Prepare o estoque de 50 mM em água e armazene em temperatura ambiente.
Ferramentas de Química de Biotina-azida	Click	AZ104-100	Prepare estoque de 10 mM em DMSO, armazene a -20  °C.
Alexa Fluor 647-azida	Life Technologies	A10277	Prepare 1 mM de estoque em DMSO, armazene a -20  °C.
Lâmpada UV de 365 nm	Spectroline	FC100	devem ser usados durante a operação.
Comprimidos inibidores de protease, sem EDTA	Roche Life Science	11873580001	Prepare a solução 50x em água e armazene a -20  °C.
Sonifier Sonicator	Branson	250	Definido para saída 1, duty 30%.
Scanner de gel fluorescente	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Use laser vermelho para detectar Alexa-fluor 647.
Kit de ensaio de proteína Dc compatível com detergente	Bio-Rad	5000112
Contas de Estreptavidina Agarose de Alta Capacidade	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Médio, baixo teor de glicose	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Bovine Serum, qualificado	ThermoFisher Scientific	26140079
Solução de penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
SDS Sample Buffer (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676