A principal modelo lesões repetitivas Concussive em Ratos

Resumo

A concussão apresenta o tipo mais comum de lesão cerebral traumática. Portanto, um modelo animal de concussão repetitiva, que replica as características importantes de uma lesão em pacientes, pode fornecer um meio de estudar a concussão de maneira rigorosa, controlada e eficiente.

Resumo

Apesar da concussão/traumatismo cranioencefálico leve (mTBI) ser a ocorrência mais frequente de traumatismo cranioencefálico, ainda há falta de conhecimento sobre a lesão e seus efeitos. Para desenvolver uma melhor compreensão das concussões, os animais são frequentemente usados porque fornecem um modelo controlado, rigoroso e eficiente. Estudos adaptaram modelos animais tradicionais para realizar mTBI para estimular a gravidade leve da lesão, alterando os parâmetros da lesão. Esses modelos têm sido usados porque podem produzir lesões cerebrais morfologicamente semelhantes à condição clínica e fornecer um espectro de gravidade das lesões. No entanto, eles são limitados em sua capacidade de apresentar as características idênticas de lesões em pacientes. Usando um sistema de impacto tradicional, um modelo de lesão concussiva repetitiva (rCHI) pode induzir concussão humana leve a moderada. O grau de lesão pode ser determinado medindo o período de perda de consciência (LOC) com um sinal de término transitório da respiração. O modelo rCHI é benéfico para uso por sua precisão e simplicidade na determinação dos efeitos do mTBI e possíveis tratamentos.

Introdução

Concussão, também chamado de leve lesão cerebral traumática (mTBI), é a ocorrência mais frequente de lesão cerebral traumática (TBI) e afeta milhões de pessoas em Estados Unidos. Concussões podem ser difíceis de diagnosticar e não há nenhuma cura específica para concussão. Há um crescente reconhecimento e alguma evidência de que trauma mecânico leve resultante de lesões desportivas, combate militar, e outras atividades fisicamente atraentes podem ter consequências neurológicas cumulativos e crônicos ^1,2. No entanto, ainda há uma falta de conhecimento sobre concussões e seus efeitos. metodologia atual restringe os estudos de patologia e tratamento em seres humanos uma vez que apenas a avaliação neurológica e avaliação por imagem estão disponíveis para o diagnóstico clínico. Os modelos animais proporcionam um meio para estudar abalos de uma maneira eficiente e rigoroso, controlado e com a esperança de ainda mais o diagnóstico e tratamento de mTBI.

Estudos têm adaptado TCE tradicionalmodelos como o impacto cortical controlado (CCI), o impacto por percussão fluida (FPI), lesão queda de peso e lesão física por explosão de realizar mTBI e estimular gravidades baixos de ferimento, alterando os parâmetros de lesão. Estes modelos são benéfico de usar devido à sua capacidade de se replicar trauma cerebral morfologicamente semelhante à condição clínica; no entanto, eles também têm as suas próprias limitações. A gravidade da lesão induzida por uma lesão aceleração (queda de peso) é muitas vezes altamente variável. Os dois resultados do CCI leve - hemorragia subaracnóide e contusão focal - não são comparáveis ​​com os abalos humanas típicas. CCI e FPI exigem uma craniotomia, que não é clinicamente relevante, enquanto a lesão física por explosão é um modelo mais controversa no que diz respeito à posição da exposição e da pressão de pico diferentes medidas, bem como a lesão secundária variável durante a exposição ^_3-6. Um modelo animal de concussão atualizada que podem traduzir a investigação pré-clínica no setti clínicang é necessário em investigação.

A questão-chave na modelagem de TCE leve é ​​definir a gravidade da lesão experimental, que replica mais se aproxima da lesão em um ambiente clínico. Recentemente, diferentes grupos de pesquisa desenvolveu o traumatismo craniano fechado ou ferimento na cabeça de concussão (CHI) modelo ^7-10. CHI é uma modificação de ICC sem uma craniotomia, mas ainda utiliza um sistema electrónico de impacto magnética tradicional para gerar um impacto da cabeça. A CHI pode induzir uma concussão variando de leve a moderada, ajustando os parâmetros de impacto. A perda de consciência (LOC) pode ser observado imediatamente após o impacto através da detecção de uma diminuição na taxa de respiração ou a cessação temporária da respiração. O período de LOC é utilizada para determinar a gravidade da lesão. Este trabalho inclui uma versão ligeiramente melhorada e actualizada de um modelo repetitivo CHI (rCHI) em ratos, juntamente com um protocolo detalhado passo-a-passo e resultados representativos. O rCHI estratégias modelo de investigação are benéfica para determinar efeitos mTBI e tratamentos potenciais, especialmente porque não existe um modelo animal individual capaz de imitar todas as alterações patológicas induzidas por concussão.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados sob protocolos # 201207692 aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade da Flórida e de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Animal Care

1. Use 3-4 meses de idade, machos C57BL / 6J. Fornecer roupa de cama, material de nidificação, alimentação e água ad libitum. Mantenha os ratos em ambientes com temperaturas controladas a 20 - 22 ° C com 12 horas de luz / 12 horas ciclos escuros constantes.

2. Pré-impacção Preparação

1. Anexar uma ponta de metal de silicone revestido de borracha feitos sob medida para um dispositivo de impacto estereotáxica eletromagnética. Certifique-se a parte inferior plana da ponta é paralela à superfície da ponta da sonda (Figura 1A).
2. Anestesiar o mouse com 4% de isoflurano seguido de anestesia de manutenção de 2,5% de isoflurano. Verifique a anestesia através do medidor de vazão. monitor o nível de anestesia até que o animal atinge um nível cirúrgico de anestesia, mostrando a perda do reflexo interdigital.
3. Coloque o mouse em uma posição de bruços em uma almofada de aquecimento. Use um cone de nariz em forma de funil para manter o rato sob anestesia. Completamente raspar a cabeça, usando um aparador. Use vaselina pomada oftálmica nos olhos do rato para evitar a secura e sob anestesia.

3. Parâmetros de Impacto Ambiente

NOTA: O sistema de impacto inclui uma caixa de controle para definir os parâmetros de impacto, um actuador para realizar a impactação, e um quadro estereotáxico digital com 3 eixos de movimento.

1. Pré-definir a velocidade do dispositivo de impacto a 4 m / s e o tempo de paragem de 240 ms sobre a caixa de controlo.

4. Posicionamento do Centro de Impacto

1. Coloque uma almofada de aquecimento suave sob o corpo do animal para manter a temperatura corporal próximo de 39 ° C. Montar o mouse em um quadro estereotáxico em um prone posição com as barras de ouvido blunt-end.
2. Abaixe a ponta impacto perto da cabeça do rato movendo o Z-motorista. Ajuste a ponta impacto plana (9 mm de diâmetro), movendo o X e Y motoristas meio caminho para as coordenadas do alvo acima da sutura sagital.
3. Certifique-se de uma extremidade da ponta de impacto é verticalmente paralelo a uma linha horizontal imaginária desenhada entre as duas orelhas (Figura 1C). O centro de impacto corresponde ao meio do caminho sutura sagital central, entre suturas interfrontal e lambdóide (interaurais 9 mm para interaurais 0 mm, lateral 4,5 mm).

5. Impacto ajuste de profundidade

1. Para configurar correctamente a profundidade do impacto, use ponta da sonda adicional para substituir a ponta impacto revestido de borracha de silicone isolados.
2. Para se certificar de que não há deslocamento do centro de impacto após dicas de comutação, definir o X e Y canal no painel de controle estereotáxico digitais para zero antes de mudar as pontas.
3. Mova o prove ponta para o centro da área de impacto movendo manualmente os X e Y.-drives.
4. sensor de contato clipe para a cauda do rato.
5. Mova o pêndulo (unidade Z) para baixo até a ponta da sonda toca a superfície do local do impacto.
6. Defina o canal Z no painel de controle estereotáxico para zero.
7. Mova a ponta impacto de volta para a área de impacto ajustando manualmente X e Y drivers (não os botões de zero no painel de controle estereotáxico digital) até que X e Y motoristas são zero (onde a ponta impacto foi posicionado anteriormente).
8. Retrair o atuador movendo a chave de retração na caixa de controle. mover manualmente o pêndulo para baixo (driver Z) por 4 mm.

6. Impacto

1. Desencadear o impacto clicando no botão impacto sobre a caixa de controle e atingir uma profundidade de deformação de 4 mm.

7. Pós-impactação

1. Medir o tempo do impacto, até a primeira respiração do mouse usando um temporizador.
2. Remover o animal do instrumento e colocá-los em uma almofada quente para manter a temperatura corporal. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
3. Permitir a recuperação antes de retornar o animal de volta em uma gaiola limpa. Não devolva um animal para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
4. Observe e pesar os ratos diariamente. Se os ratos mostram sinais de dor, por via intraperitoneal com meloxicam injecta-a ​​1 - 2 mg / kg a cada 12-24 horas.

8. Impactação repetitivo

1. Dê os ratos lesões adicionais nos dias 4, 7 e 10 após a lesão inicial (intervalo de 72 horas entre os impactos).

9. Imuno-histoquímica (IHC)

1. perfusão transcardial
   1. Anestesiar os ratos por meio de injecção intraperitoneal com 200 m / kg de pentobarbital.
   2. Avaliar e assegurar a anestesia cirúrgica plano por uma pitada dedo do pé. Secure o mouse na posição supina gravando suavemente as patas dianteiras e as patas traseiras para uma superfície de trabalho de isopor dentro de uma Cobertura de vapores químicos.
   3. Faça uma incisão através da pele ao longo da linha média torácica a partir de apenas abaixo do apêndice xifóide até a clavícula. Faça duas incisões na pele adicionais no processo xifóide e prossiga ao longo da base da caixa torácica ventral lateralmente.
   4. Abrir a cavidade torácica e expor o coração, cortando através da musculatura torácica e caixa torácica.
   5. Fixe o coração batendo com uma pinça sem corte e fazer uma 1 - incisão de 2 mm de ventrículo esquerdo.
   6. Imediatamente insira uma agulha de borboleta para o átrio direito. Comece a infusão de solução salina 20 ml, empurrando a seringa lentamente.
   7. Mudar de solução salina a 4% paraformaldeído. Continue a perfusão com 20 ml de paraformaldeído.
   8. Decapitar o mouse e remover a pele com uma tesoura. Isolar o cérebro do crânio utilizando um cortador de osso.
2. Cryostat seccionamento
   1. tecidos cerebrais incorporar em temperatura de corte (OCT) formulação e congelamento ideal a -80 ° C. Colocar o cérebro no criostato com uma orientação sagital. seções do cérebro corte de 5 mm de espessura.
3. coloração
   1. Secam-se as secções congeladas à temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Incubar as lâminas com 100 ul de soro de cabra 2% e 0,1% de Triton X-100 em fosfato salino tamponado (PBS) durante 1 h à TA.
   3. Lavar as lâminas 3 vezes com 300 ul de PBS. Em seguida, as lâminas incubar com anti-GFAP (1: 200) ou anticorpo anti-ferritina (1: 200) em separado durante a noite a 4 ° C.
   4. Lavar as lâminas 3 vezes com 300 ul de PBS. Em seguida, as lâminas incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com biotina.
   5. Lavar as lâminas 3 vezes com 300 ul de PBS. Em seguida, incubar as lâminas com solução de complexo avidina-biotina (ABC) (01:50) à temperatura ambiente durante 30 min.
   6. Lavar as lâminas 3 vezes com 300 ul de PBS. Em seguida, incuba-se 3,3'-diaminobenzidina solução (DAB) de substrato (50 ml de PBS, 10 ul de H ₂ O _2, 10 mg de DAB pílula, filtro antes de usar) para 5-8 min. Observe as lâminas sob o microscópio até as células positivas aparecem.
   7. Lavar as lâminas em lenta água corrente da torneira durante 5 min. lâminas limpas com um laboratório-wipe. Em seguida, montar as seções com meio de montagem e lamela.

Resultados

Neste modelo (Figura 1 AC), houve breves períodos de respiração ofegante e rasas. A perda de consciência (inconsciente) é definida como uma diminuição na taxa de respiração ou cessação temporária da respiração antes de retomar a respiração normal. Um impacto no centro da cabeça provocada inconsciência de curto prazo (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 seg a cada impacto separadamente, Figura 1D). Cérebro do rato apresentaram morfologia normal, H...

Discussão

Para imitar lesões cerebrais morfologicamente semelhantes ao quadro clínico, os sintomas pós-concussão são esperadas. sintomas pós-concussão geralmente incluem dores de cabeça, tonturas, vertigens, fadiga, problemas de memória e de sono, dificuldade de concentração, bem como a ansiedade e humor deprimido. Como os sintomas somáticos pode ainda não ser mensurável em modelos animais, as mudanças da função motora e cognitiva e comportamento emocional são usados ​​como critérios para avaliar racionalmente concussão em modelo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
máquina de anestesia	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Modelo 150	anestesia
Impactor Eletromagnético	LeicaBiosystems	Impact One Impactor Estereotáxico	realizar impactação
Instrumento estereotáxico digital	LeicaBiosystems	39462501	montar mouse e pontas de posicionamento
Ponta de metal revestida de borracha Sicilone	Ferramenta de precisão e Engenharia, Aparador	feito sob medida	ponta do impacto da ponta do impacto
	Produtos 9854-600		papel do cabelo do rato
	de prova feito-à-medida
Algodão derrubou a cabeça dos aplicadores	MEDLINE	MDS202055	esfrega a cabeça com soro fisiológico
Tecido Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583
anti-GFAP anti-GFAP	Dako	CA93013	anticorpo para IHC
anti ferritina	Sigma	F6136	IHC
VECTASTAIN Elite ABC  kit	Vector laboratories	PK-6100	Sistema de detecção IHC
Permount Montagem Média	Fisher Scientific	SP15-100
Aperio XT Scanner ScanScope	Leica Microsystems Inc,		lâminas de digitalização
Leica AutoStainer XL	Leica a patologia Empresa	ST2010	H & Coloração E
DAB	Sistema de detecção sigma	D3939	IHC

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