Viabilidade imagens de células em Scaffolds não-transparentes - usando o exemplo de um Titanium Implant Novel malha

Summary

Aqui nós apresentamos uma técnica de imagem fluoróforo base para detectar a viabilidade celular em um andaime de titânio não-transparente, bem como para detectar vislumbres das impurezas de andaime. Este protocolo soluciona o problema de imagiologia de interacções célula-célula ou célula-metal em andaimes não transparentes.

Abstract

A degeneração do disco intervertebral e a hérnia de disco são uma das principais causas de dor lombar. A depleção da matriz extracelular, culminando na extrusão do núcleo pulposo (NP), leva à destruição do disco intervertebral. Os tratamentos cirúrgicos atualmente disponíveis reduzem a dor, mas não restauram a funcionalidade mecânica da coluna. A fim de preservar as características mecânicas da coluna vertebral, a substituição total do disco ou núcleo tornou-se um grande interesse. No entanto, essa era da artroplastia ainda está em um estado imaturo, uma vez que nenhum dos produtos existentes foi avaliado clinicamente.

Este estudo pretende testar a biocompatibilidade de um novo implante de núcleo feito de fios de titânio tricotados. Apesar de todas as vantagens mecânicas, o material tem seus limites para a análise óptica convencional, pois o implante resultante não é transparente. Aqui apresentamos uma estratégia que descreve a visualização in vitro, rastreamento e teste de viabilidade de células osteocondro-progenitoras no andaime. Este protocolo pode ser usado para visualizar a eficiência do protocolo de limpeza, bem como para investigar a biocompatibilidade desses e de outros andaimes não transparentes. Além disso, este protocolo pode ser usado para mostrar o padrão de adesão das células, bem como a viabilidade celular e as taxas de proliferação no andaime. Este ensaio de teste de biocompatibilidade in vitro fornece uma ferramenta propícia para analisar a interação célula-material em scaffolds não transparentes e opacos.

Introduction

dor lombar crônica é uma doença multifatorial. O interesse em uma opção de tratamento minimamente invasivo para a doença degenerativa do disco tem crescido desde a década de 1950. Até hoje, a fusão de múltiplos segmentos da coluna vertebral é o tratamento mais amplamente utilizado. Desde então, este método muitas vezes leva a limitações na mobilidade do segmento acometido ^1,2, exploração da era artroplastia tornou-se um grande interesse. Avanços significativos em substituição total substituição do disco e do núcleo tornou-se uma boa alternativa para o tratamento da dor lombar crônica ^1. Apesar do enorme progresso, nenhum dos métodos foi clinicamente avaliada. Os implantes de núcleo menos rígidas representam uma alternativa promissora para a substituição total do disco, desde que o anel fibroso está intacta ^3,4. No entanto, os presentes atualmente implantes núcleo no mercado são muitas vezes associada a complicações como alterações no corpo vertebral, deslocamento, perda de altura vertical do disco e tele falta de necessária rigidez mecânica associada ^5. A fim de ultrapassar os inconvenientes actuais, um novo implante núcleo feito de fios de malha de titânio foi desenvolvido com êxito ^6. Devido à estrutura única de malha, este andaime desenvolvido recentemente demonstrou características biomecânicas distintos, por exemplo, característica de amortecimento, dimensão do poro, a capacidade de carga e de fiabilidade ^7. Com o objetivo de testar a biocompatibilidade desta novela implante núcleo, representado severas limitações nas técnicas de análise (óptico) atribuídos à natureza não-transparente do implante.

A fim de testar a biocompatibilidade, interacção célula-de metal desempenha um papel proeminente ^8-10. Uma interacção entre as células e o andaime é necessária para a estabilização e, consequentemente, para uma melhor integração do implante dentro do sistema hospedeiro. No entanto, uma profundidade crescente crescimento interno pode alterar as propriedades mecânicas do andaime. Com o objetivo de investigar se a superfície de andaime fornece uma base para a fixação das células, proliferação e diferenciação ou se o metal afeta a viabilidade das células, é importante para solucionar o problema comum bem conhecida de imagiologia células na / em andaimes não-transparentes e opacas. A fim de superar esta limitação vários fluorescente foram exploradas técnicas baseadas. Empresas oferecem uma grande variedade de fluoróforos para visualizar as células vivas, compartimentos celulares, ou mesmo estados celulares específicos ^11. Fluoróforos para esta experiência foram escolhidos com a ajuda da ferramenta de visualizador espectral on-line, a fim de melhor atender nosso microscópio fluorescente.

A estratégia desenvolvida para a análise do comportamento de células aderentes em / no andaime de titânio malha não transparente envolve o seguinte: 1) fluorescente (proteína fluorescente verde / GFP) rotulagem das células osteochondro-progenitoras para permitir o rastreamento das células na andaime, 2) a medição da viabilidade (Mitoactividade condral) das células, e 3) a visualização de célula-célula e as interacções das células-prima dentro do andaime. O procedimento tem a vantagem de que ele pode ser facilmente transferido para outras células aderentes e outras andaime não transparente ou opaca. Além disso, a viabilidade e crescimento interno do padrão pode ser monitorizada ao longo de vários dias, assim, ela pode ser usada com quantidades limitadas de material de andaime ou células.

O presente estudo demonstra o uso bem sucedido do nosso protocolo atual para medir a viabilidade celular e visualizar padrão no crescimento de células progenitoras osteochondro-on / no não-transparente scaffold titânio malha. Além disso, os protocolos desenvolvidos pode ser utilizado a fim de determinar as impurezas de andaime e para verificar os protocolos de limpeza.

Protocol

NOTA: imortalizado células precursoras do estroma mesenquimal humana (células SCP-1) foram utilizadas para as experiências. As células SCP-1 foram fornecidas pelo Prof. Matthias Schieker ^12.

1. Expansão da SCP-1 Células

1. Antes de trabalhar com células as SCP-1, limpar corretamente a área de trabalho (designado biossegurança gabinete I) com luvas de 70% de etanol (v / v) usando.
2. No armário de segurança biológica limpos preparar um volume adequado de meio de cultura celular por mistura dos componentes necessários, tal como indicado na Tabela 1. A fim de manter a esterilidade do meio de base, adicionar suplementos por passagem através de filtros estéreis com um tamanho de poro de 0,22 um.
   1. Para evitar a contaminação, preparar o meio, pelo menos, 24 horas antes do uso. A fim de testar a sua esterilidade, incubar 1 mL de meio numa placa de cultura de células, sem células na incubadora de cultura celular padrão: 37 ° C, 5% de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade. Depois de24 horas, verifique meio de microscópio utilizando uma ampliação de pelo menos 200X.
3. Manter SCP-1 células numa incubadora de cultura de células padrão com a condição de suporte: 37 ° C, 5% de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade.
4. Para a manutenção e expansão, crescem as células SCP-1 até atingirem 80-90% de confluência. Durante este período de tempo de cultura, mudança de meio cada 2-3 dias. Ao atingir 80-90% de confluência, divididas células SCP-1 (em geral uma proporção de 1: 2) para a próxima passagem para a expansão ou a placa para as experiências (como indicado).
5. Para dividir as células SCP-1, aquecer o meio de cultura a 37 ° C e descongelar a tripsina / EDTA utilizando um banho de água a 37 ° C.
6. Completamente aspirar o meio de cultura das células confluentes 80-90% e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
7. Lavar as células, pelo menos, duas vezes com DPBS (fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina sem magnésio e cálcio, pH 7,2).
   1. Pipetar um volume apropriado deDPBS para as células (5 ml de DPBS para um balão de cultura T75 e 12 ml para um frasco de cultura T175).
   2. Aspirar DPBS com cuidado e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
8. Pipetar um volume adequado de 0,25% de tripsina / EDTA sobre as células (1 mL de DPBS para um balão de cultura T75 e 2 ml para um frasco de cultura T175) e incubar durante 5-10 min a 37 ° C na incubadora de cultura celular padrão com 5 % de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade.
9. Desalojar as células tocando no recipiente e assegurar que todas as células são separadas da cultura de plástico (tripsinização), observando as células flutuantes sob o microscópio.
10. Inactivar a tripsina reacção por adição de 10 ml de meio de cultura. Misture a tripsina e células com o meio cuidadosamente por pipetagem repetida.
11. Transferir a suspensão de células para um tubo de reacção e centrifugar a 600 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
12. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de culturamédio.
13. Contar as células por método de exclusão Trypan Blue conforme descrito no protocolo 2.
14. Semear as células, dependendo do delineamento experimental.

2. Contagem do SCP-1 Células

1. Executar uma contagem de células viáveis ​​(método de exclusão de azul de tripano) das células ressuspensas utilizando um hemocitómetro.
2. Antes da contagem de células, limpar o hemocitómetro utilizando água da torneira. Seque os componentes hemocitômetro utilizando um tecido sem fiapos. Montá-lo humedecendo o vidro de cobertura e pressionando-o para inversamente os dois corredores de vidro de cada lado da área de contagem. Certifique-se de que os anéis newtonianos são vistas nos corredores de vidro (Figura 1).
3. Tomar 10 ul das células ressuspensas e misturar-se com 10 ml de solução de azul de tripano a 0,1% para se obter um factor de diluição de 2.
4. Carga de 10 ul da amostra total na câmara de hemocitómetro pré-limpos e montados.
5. Contar o número de vivo (branco / células transparentes) e mortos(azul núcleos) células nas praças 4x4 (ver Figura 1B).
6. Calcular o número total de células a seguir a fórmula dada:
   

3. GFP Transfecção de Células SCP-1

NOTA: A fim de observar o crescimento de células SCP-1 sobre e para o scaffold titânio malha ao longo de um determinado período de cultura que marcou as células com a proteína fluorescente verde (GFP). A sobre-expressão de GFP é conseguida pela infecção com partículas de adenovírus que codificam para GFP. Replicação incompetente (-E1 / -E3) partículas de adenovírus que codificam para a proteína verde fluorescente (GFP) foram utilizados para infectar células SCP-1. As partículas de vírus foram obtidos a partir de Prof. Steven Dooley ¹³ através da recolha de sobrenadante de cultura de adenovírus recombinante (Ad5-GFP) As células HEK293T transfectadas (Segurança Biológica laboratório II). Três repetidos de congelação (-80 ° C) e descongelação (37 ° C em banho de água) ciclos assegurado que nenhum HEcélulas K293T permanecer viável para a produção de novas partículas virais. Usando este estoque de sementes adenovírus pode infectar eficientemente as células SCP-1 sem produzir novas partículas virais. Assim, as células infectadas podem ser manuseados de Segurança Biológica I. Lab

1. Ressuspender as células alvo (células SCP-1) com uma densidade de sementeira de 50.000 células / ml em meio de cultura. Pipetar 2 ml por poço numa placa de cultura de tecidos de 6 poços.
2. Incubar a 37 ° C na incubadora de cultura celular padrão; 5% de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade, até células SCP-1 atingir uma confluência de 70-80%.
   NOTA: confluência depende da densidade de sementeira das células. As condições acima indicadas, as células SCP-1 atingir uma confluência de 70-80% em 1,5-2 dias.
3. A uma confluência de 70-80%, sem aspiração do meio de cultura adicionar 100 uL de stock de sementes adenovírus por 1 ml de meio de cultura.
   1. Determinar a gama de concentrações individualmente, dependendo da quantidade de partículas de vírus em cada vírus SEpreparação de massa ed. No caso de a eficiência de infecção é muito baixo, purificar e concentrar as partículas de vírus, utilizando vários kits disponíveis comercialmente.
4. Incuba-se durante uma hora na incubadora de cultura celular padrão, a 37 ° C (5% _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade).
5. Remova o meio de cultura contendo o estoque de sementes de vírus e recolhê-la para eliminação. Adicionar meio de cultura fresco 2 ml por poço de um de 6 poços de cultura de placa para reabastecer.
   1. Certifique-se que antes da eliminação, partícula do vírus contendo meio é autoclavado.
6. Avaliar a expressão de GFP intracelular (eficiência de infecção) 24 h após a infecção usando um microscópio de fluorescência com uma GFP LED conjunto cubo / filtro.
   1. Observar a morfologia celular (Figura 2). Células destacados do plástico cultura pode dar resultados falsos positivos.

4. Lavagem de malha Scaffolds Titanium

1. Prendas até 5 andaimes em um tubo de ensaio de 50 ml.
2. Lavar o andaime (6-7 mm de espessura) com três vezes 30 ml de água destilada-desionizada durante 20 min à temperatura ambiente, utilizando condições de rotor (8 xg).
3. Substituir a água destilada-desionizada, com 30 ml 1% (w / v) de Triton-X-100 a solução (dissolvido em água destilada-desionizada) e, em seguida, lavar os andaimes, uma vez durante 20 min a temperatura ambiente, usando condições de rotor (8 xg) .
4. Descartar a solução de Triton-X-100, seguido por lavagem com 30 ml de água destilada-desionizada, duas vezes (5 minutos cada à temperatura ambiente) mantendo condições de rotor (8 xg).
5. Substitua a água destilada-deionizada. Lavar sequencialmente andaimes com grau de reagente 99% de acetona, 99% de isopropanol e 99% de etanol (30 ml cada) durante 2 x 5 min cada em banho de ultra-sons (~ 50 Hz, a 50 W, 220-240 V).
6. Lavar novamente três vezes com 30 ml de água destilada-desionizada, durante 5 min, mantendo-se a ultra-sons de banho de tratamento constante.
7. Coloque o ScaffoLDS em um tecido que não solte fiapos, a fim de expor as secar durante a noite à temperatura ambiente.
8. Autoclave a andaime durante 15 min a 121 ° C com 15 psi.
9. Confirme o protocolo de limpeza por fluorescência indireta como descrito no protocolo 5.

5. Estruturas de imagem Andaime por fluorescência indireta

NOTA: O presente protocolo descreve a imagem das estruturas de andaime por fluorescência indireta usando o fluoróforo sulforhodamina B que dá uma fluorescência vermelha brilhante em um comprimento de onda ex / em de 565/586 nm. No entanto, o fluoróforo pode ser alterado para melhor ajuste, para determinadas configurações de microscópio ou possível auto-fluorescência do andaime.

1. Preparar a solução sulforhodamina B coloração (0,04%) em ácido acético 1% e armazenar a temperatura ambiente ao abrigo da luz.
2. Aqui uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades e mergulhar o andaime feita em 500 ul da solução corante sulforrodamina B, colocando-insIDE bem usando uma pinça.
3. Capturar as imagens negativas do andaime usando microscópio de fluorescência.
   1. Tire fotos com uma RFP LED cubo / conjunto de filtros com um comprimento de onda de excitação de 531/40 nm e um comprimento de onda de emissão de 593/40 nm. Alternativamente, escolher o comprimento de onda de excitação e emissão adequados com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência ^20. Sulforodamina B tem o seu pico de excitação a 578 nm e o seu pico de emissão a 593 nm.
   2. A fim de visualizar a estrutura de andaime, tirar fotos em ampliações inferiores, por exemplo, 4X ou 10X (Figura 3). Usando estas imagens, determinar as características, por exemplo, o tamanho dos poros e forma com a ajuda do ImageJ.
   3. A fim de detectar impurezas de andaime, tirar fotos com ampliações superiores, por exemplo, 20X ou 40X, considerando que isso irá limitar a profundidade da análise. Certifique-se de que a sujeira partículas / substâncias não são vistos (ver resultados representativos; FigUre 3).

6. Ensaio In Vitro A biocompatibilidade

1. Pré-aquecer o meio de cultura a 37 ° C num banho de água.
2. Aqui uma placa de cultura de tecidos de 24 poços usando uma pinça e, colocar os suportes limpos e esterilizados em cada poço de teste assepticamente. Trabalhar sob a cabine de segurança biológica pré-limpeza I!
3. Soak / incubar os andaimes com um meio de cultura durante cerca de 15 min (500 ul por poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços), a fim de remover o ar do interior do andaime.
4. Enquanto isso, ressuspender 500.000 células SCP1 Ad-GFP-infectadas em 1 ml de meio de cultura.
5. Após 15 minutos de imersão andaime, aspirar o meio completamente fora do andaime.
6. Para semear as células no andaime, dispensar 100 ul de suspensão de células cuidadosamente no andaime (que é colocado na placa de 24 poços) de superfície. Manter um volume mínimo de suspensão celular durante a sementeira das células, de modo a garantir que não haja o meio fluiut do andaime.
7. Incubam-se as células durante 30 min a 37 ° C na incubadora de cultura de células padrão (5% de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade).
8. Adicionar mais 500 ul de meio de cultura e incuba-se durante 24 horas na incubadora de cultura celular padrão (37 ° C, 5% de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade).
9. Avaliar o padrão de aderência e célula se espalhando na superfície do andaime usando um microscópio de fluorescência.
   1. Tire fotos com uma GFP LED cubo / conjunto de filtros com um comprimento de onda de excitação de 470/22 nm e um comprimento de onda de emissão de 510/42 nm. Alternativamente, escolher a excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. GFP tem o seu pico de excitação a 488 nm e o seu pico de emissão a 507 nm.
   2. Para visualizar aderência celular captura de padrão de imagens em ampliações inferiores, por exemplo, 4X ou 10X (Figura 4). A fim de observar células espalhando uma revista de maiornification (pelo menos 100x) é necessária - limitar a profundidade de foco.
10. Para avaliar ainda se espalhando na superfície do andaime celular, corrigir as células com 4% de formalina e prosseguir com coloração convencional de fluorescência das estruturas celulares, por exemplo, filamentos de actina (faloidina). No entanto, os tempos de incubação e adaptar marcação fluorescente dos anticorpos, a fim de ajustar as características de andaime individuais, por exemplo, tempos de difusão ou auto-fluorescência ^14.
11. No dia seguinte, mudar o meio de cultura para remover as células não-aderentes.
12. Calcular a percentagem de células aderentes no cadafalso por resazurina medição de conversão, conforme descrito no protocolo 7.

Figura 5: O espaço temporal de ensaio in vitro (A) Instalação experimental para células plaqueamento.. (B Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

medição 7. Conversão resazurina

NOTA: Ensaio de conversão resazurina é usado para medir a atividade mitocondrial e proliferação celular, assim, indiretamente. Redução Resazurina a resorufina gera um sinal de fluorescência, que se baseia na actividade mitocondrial associada com o número de células viáveis ​​(Figura 7A).

1. Completamente aspirar o meio de cultura de células as SCP-1 e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
2. Lavam-se as células SCP-1 uma vez com DPBS para remover as células destacadas. Adicionar 500 de DPBS ul por poço da placa de cultura de tecidos de 24 poços contendo células SCP-1 sobre o andaime.
3. Cobrir as células com um am necessárioount solução de resazurina trabalho estéril (0,25% de resazurina em meio de cultura) e incubar a 37 ° C na incubadora de cultura de células padrão (5% de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade) durante 30 min.
   1. Fazer uma nota que; tempo de incubação depende do tipo de célula e a densidade de células. Ela pode variar entre 10 min e 6 h. tempo de incubação otimizado para células SCP-1 é de 30 min.
4. Como um controlo de fundo, incluem, pelo menos, um bem com a solução de trabalho de resazurina, mas sem células, que foi incubada a 37 ° C na incubadora de cultura de células padrão (5% de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade) para a mesma quantidade de tempo.
5. Transferir 100 ul de sobrenadante condicionado de cada poço da placa de cultura de tecidos de 24 cavidades em uma placa de 96 microcavidades.
6. Lavar as células restantes três vezes com 1 ml de DPBS durante 5 min à temperatura ambiente a fim de remover a solução de trabalho resazurina residual. Após a terceira lavagem adicionar meio de cultura tS os implantes com células SCP-1 (500 ul por poço da placa de cultura de tecidos de 24 poços) e continuar a incubação a 37 ° C na incubadora de cultura de células padrão (5% de _CO2, 20% de _O2 e 90% de humidade) para outras medições curso de tempo.
   1. Certifique-se de configurar repetições neste passo (2-4), a fim de minimizar os erros de pipetagem.
7. No entanto, colocar a placa de micropoços de 96 para o leitor de microplacas e medir a fluorescência da resorufina formado.
   1. A fim de reduzir o sinal de fundo, medir a fluorescência num comprimento de onda de excitação de 545 nm e um comprimento de onda de emissão de 585 nm.
   2. Alternativamente, escolher a excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. Resorufina tem o seu pico de excitação a 572 nm e o seu pico de emissão a 585 nm. A intensidade do sinal é dada uma média de 25 leituras individuais (25 flashes por poço).
8. Medir a Fluorescence de resorufina formado em meio condicionado, utilizando uma óptica de fundo.
   1. Tome nota que, o ganho depende da quantidade média de resazurina convertida e pode variar entre 10 e 4.000. Ajustar o ganho para o leitor de microplacas indivíduo utilizado por pipetagem de uma curva padrão resorufina, de tal modo que o sinal fluorescente é inferior a 80% da intensidade máxima do sinal detectável (neste caso, 20000). O ganho otimizado para células SCP-1 é de 800.
9. Subtrair o sinal de fundo (resazurina solução de trabalho sem células) a partir do sinal das amostras de ensaio.
10. Dependendo da configuração experimental / propósito, prosseguir com novas medidas:
11. Calcula-se a percentagem de viabilidade das células na andaime utilizando uma curva padrão. Fazer uma curva padrão, separadamente para cada linha celular utilizada.
12. Analise crescimento / proliferação celular através da estimativa do aumento relativo na conversão resazurina em todo o tempo de cultura. Para este cálculo, definidoa conversão resazurina no dia 1 como referência. Recém preparar a solução de trabalho resazurina para este tipo de análise. Além disso, os tempos de incubação tem que ser igual entre as diferentes medições.
13. Repita todo o protocolo de medida de conversão resazurina pelo menos três vezes para obter resultados consistentes.

8. Coloração vivo-morto

1. Placa as células SCP1 no cadafalso com uma densidade de semeadura de 50.000 células / andaime e permitir que ela cresça no cadafalso mantendo as condições de cultura de células padrão (consulte o protocolo 1 e 2).
2. Depois de 24-48 h, aspirar completamente o meio de cultura de células as SCP-1 e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
3. Lavam-se as células SCP-1 uma vez com DPBS para remover as células destacadas. Adicionar 500 ul DPBS por poço da placa de cultura de tecidos de 24 cavidades e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
4. Mancha SCP-1 utilizando fluoróforos (todos os três manchas ao mesmo tempo):
   1. De agora em diantemanter os andaimes no escuro, a fim de proteger o branqueamento fluoróforos de luz!
   2. Definir um tempo de incubação de 30 min a fim de permitir a distribuição igual em todo o andaime. Se a transferência para outros suportes, certifique-se de otimizar os tempos de incubação para se adequar às características de andaime individuais (tamanho dos poros, profundidade de andaime, etc.).
   3. A fim de detectar células viáveis ​​no andaime, corar as células com calceína AM a uma concentração final de 2 ^ M (em meio de cultura).
   4. A fim de detectar todas as células no andaime, corar as células com Hoechst 33342 a uma concentração final de 0,002 mg / mL (em meio de cultura).
   5. A fim de detectar as células mortas, incubar o andaime com homodímero de etídio para uma concentração final de 4 | iM (em meio de cultura).
5. Após o tempo de incubação, lavagem das células 3 vezes com DPBS (1 mL por cavidade) para cada 5 min à temperatura ambiente.
6. Imediatamente tirar uma fotos usando um microscópio de fluorescência.
   1. Tire fotos da calceína (células vivas) com uma GFP LED conjunto cubo / filtro (excitação e emissão de comprimentos de onda de 470/22 nm e 510/42 nm, respectivamente). Alternativamente, escolher uma excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. Calceína tem o seu pico de excitação a 488 nm e o seu pico de emissão a 507 nm. Nota: Certifique-se de não usar células transfectadas GFP para a coloração de fluorescência com calceína ou outras manchas verdes fluorescentes.
   2. Tire fotos da Hoechst 33342 com um LED DAPI cubo / conjunto de filtros com um comprimento de onda de excitação de 357/44 nm e um comprimento de onda de emissão de 447/60 nm. Alternativamente, escolher a excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. Hoechst 33342 tem a sua excitação de pico a 347 nm e o seu pico de emissão a 483 nm.
   3. Tirar fotos do homodímero de etídio com uma RFP LED cube set / filtro (excitação e comprimento de onda de emissão oF 531/40 nm e 593/40 nm, respectivamente). Alternativamente, escolher a excitação adequada e comprimento de onda de emissão, com a ajuda do visualizador espectral de fluorescência. Homodímero de etídio tem o seu pico de excitação a 530 nm e o seu pico de emissão a 618 nm.

Results

Os resultados preliminares mostraram que o romance implante núcleo descrito não só tem boas características de amortecimento, mas também é biocompatível com células SCP-1. Durante o processo de produção do implante, ele entra em contato com substâncias fortes corrosivos e tóxicos (lubrificante, solução mordente, polimento electro). Com a ajuda de técnicas de coloração fluorescente indirecta fomos capazes de visualizar as impurezas restantes e consequentemente otimizar um protocolo de lim...

Discussion

A superfície andaime desempenha um papel importante na sua interacção com o tecido circundante in vivo, determinando assim implantes durabilidade funcional. Assim, a bio-compatibilidade do andaime é estudada por ensaios in vitro utilizando células (linha de células SCP1), quando plaqueadas sobre os andaimes.

técnicas de microscopia que funcionam bem com andaimes finas e opticamente transparentes são pouco adequados para andaimes não transparentes para estudar a biocompatibi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de 6/24/48 poços, frasco de cultura T25/ T75	Greiner Bio-One GmbH	*
* Placas de 24 poços	Greiner Bio-One GmbH	CELLSTAR 662 Placas de 160
* 48 poços	Corning Incorporated USA	3548
* Placas de 6 poços	Falcon	353046
* T25	Greiner Bio-One GmbH	690 175
* T75	Greiner Bio-One GmbH	658 175
Ácido acético, purum ≥ 99.0%	Carl Roth	3738.4
Acetona	Carl Roth	5025.1
Axioplan-2	Carl Zeiss, Alemanha
Armários de segurança biológica	Thermo Scientific	safe 2020
Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM)	Sigma	17783
Cell Culture Incubtator	Binder, Tuttlingen, Germany	9040-0078
Unidade de filtro (0.22 µ m)	Millipore, IRL	SLGP033RS
Centrífugas 5810 R e 5417 R	Thermo Fisher Scientific, NY	Megafuge 40R
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Carl Roth	4720.2
Dulbecco ' s PBS sem Ca & Mg	Sigma	H15-002
Etanol 99%	Produto líquido SAV. GmBH	475956
Homodímero de etídio	Sigma	46043
EVOS Sistema de imagem de fluorescência	Life technologies AMF4300
Fetal Bovine Serum (FCS)	Gibco	10270-106
Hemocitômetro	Hausser Scientific, PA, EUA
Hoechst 33342	Sigma	14533-100MG
Implante de núcleo de titânio tricotado	Buck co & KG, Alemanha
MEM Alpha Modificação com Glutamina sem nucleosídeo	Sigma	E15-832
Omega microplate Reader	BMG Labtech, Alemanha	FLUOstar Omega
Penicilina / Estreptomicina	Sigma	P11-010
Resazurin sal de sódio	Sigma	199303-1G
Sulforhodamina B sal de sódio	Sigma	S1402-1G
Rotador de tubo de ensaio	Labinco BV, Holanda	Modelo LD-76
TRIS (hidroximetil) aminometano	Carl Roth	AE15.1
Triton	Carl Roth	3051.2
Trypan Blue 0.5%	Carl Roth	CN76.1
Tripsina / EDTA	Sigma	L11-004