Artigo de método

Criação e transplante de uma folha de células-tronco adiposo-derivado (ASC) em um modelo de cicatrização de feridas diabética

DOI:

10.3791/54539

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4 de agosto de 2017

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1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Células-tronco adiposo-derivado (ASCs) são facilmente isoladas e colhidas a partir da gordura de ratos normais. ASC as folhas podem ser criadas usando a célula-folha engenharia e podem ser transplantadas Zucker ratos diabéticos gordos, exibindo a espessura total da pele defeitos com osso exposto e então coberto com uma BICAMADA de pele artificial.

Resumo

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Pele artificial tem alcançado resultados terapêuticos consideráveis na prática clínica. No entanto, tratamentos de pele artificial para feridas em pacientes diabéticos com fluxo sanguíneo impedido ou com grandes feridas podem ser prolongados. Terapias baseadas em células surgiram como uma nova técnica para o tratamento de úlceras diabéticas e célula-folha engenharia melhorou a eficácia do transplante de células. Um número de relatórios sugeriram que derivado de adiposo as células-tronco (ASCs), um tipo de células estromais mesenquimais (MSC), apresentam potencial terapêutico devido a sua abundância relativa no tecido adiposo e sua acessibilidade para coleção quando comparados com MSCs de outros tecidos. Portanto, ASCs parecem ser uma boa fonte de células-tronco para uso terapêutico. Neste estudo, folhas ASC do epidídimo gordura adiposa de ratos normais de Lewis foram criadas com êxito usando pratos de cultura temperatura-responsiva e normal meio de cultura contendo ácido ascórbico. As folhas do ASC foram transplantadas em ratos diabéticos gordos (ZDF) de Zucker, um modelo do rato de diabetes tipo 2 e obesidade, que apresentam diminuição de cicatrização. Uma ferida foi criada na superfície craniana posterior, folhas do ASC foram transplantadas para a ferida, e uma pele artificial de BICAMADA foi utilizada para cobrir as folhas. Ratos ZDF que receberam folhas ASC tinham melhor cicatrização de feridas que ratos ZDF sem o transplante de folhas ASC. Esta abordagem foi limitada porque folhas ASC são sensíveis às condições de seca, que exigem a manutenção de um ambiente de ferida húmido. Portanto, pele artificial foi usada para cobrir a folha ASC para impedir a secagem. O transplante alogênico de folhas ASC em combinação com pele artificial pode também ser aplicável a outras úlceras intratáveis ou queimaduras, tais como os observados com a doença arterial periférica e doença do colágeno e pode ser administrado a pacientes que estão desnutridos ou estiver usando esteroides. Assim, este tratamento pode ser o primeiro passo para melhorar as opções terapêuticas para diabético ferida cura.

Introdução

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A população de pacientes diabéticos está aumentando em todo o mundo e chegou a 400 milhões em 20151; um estimado de 15-25% dos pacientes com diabetes estão em risco da progressão de uma úlcera diabética de extremidade inferior2. Baixo-extremidade úlceras diabéticas são intratáveis e podem exigir um período prolongado de terapêutico com treinamento de reabilitação após a completa recuperação. Um período de tempo terapia muitas vezes resulta em uma redução significativa no paciente qualidade de vida. Assim, novas terapias que diminuem ou evitar o agravamento devem ser desenvolvidas para o tratamento de feridas diabéticas. Para avaliar a cicatrização de feridas diabéticas, nós aperfeiçoamos um úlcera diabética cicatrização modelo em ratos, que imita condições práticas clínicas, e avaliada se transplante de células-tronco adiposo-derivado (ASC) folhas usando célula-folha engenharia acelerado cicatrização de feridas.

Células estromais mesenquimais (MSCs) apresentam um potencial excelente para acelerar a cicatrização de feridas por causa de sua capacidade de auto-renovação, seus efeitos imunomoduladores e sua capacidade de se diferenciar em várias linhagens de célula3. ASCs são um tipo de MSC derivada de tecido adiposo, e eles apresentam várias vantagens sobre o MSCs derivadas de outros tecidos, incluindo o seu potencial angiogênico e parácrina atividade4,5. Tecido adiposo é relativamente abundante no corpo humano, e sua acessibilidade permite coleção usando procedimentos minimamente invasivos. Portanto, ASCs foram usados experimentalmente para cicatrização da ferida aplicações6,7.

Relatórios anteriores mostraram que a injeção direta de suspensões de célula única MSC em áreas ao redor de feridas pode acelerar8,9de cicatrização de feridas. No entanto, apesar dos relatos da aceleração da cicatrização de feridas em modelos de úlcera diabética após a injeção de suspensões de célula única, o tempo de sobrevida das células transplantadas no local da ferida não é claro.

Neste estudo, aplicamos engenharia de celular-folha usando pratos de cultura temperatura-responsivo. Estes pratos têm a temperatura-responsivo polímero de N- isopropylacrylamide ligados covalentemente em sua superfície10. A camada de polímero transplantado permite aderência de célula de temperatura controlada de ou o destacamento da superfície do prato cultura. A superfície do prato se torna hidrofóbica a 37 ° C, permitindo que as células para aderir e proliferar, Considerando que as células espontaneamente desanexar da superfície quando se torna hidrofílica em temperaturas abaixo de 32 ° C. Culturas de células podem ser colhidas como uma folha de células contíguas com cruzamentos de célula para célula intactos e matrizes extracelulares (ECMs) simplesmente reduzindo a temperatura; assim, as enzimas proteolíticas que danificam o ECM, tais como a tripsina, não são necessários11. Portanto, célula-folha engenharia pode preservar ligações de celular para celular e melhorar a eficácia do transplante de células.

Além disso, transplante de células-folha aumenta as taxas de sobrevivência de células quando comparado com injeção de célula12. Neste protocolo, Zucker ratos diabéticos do gordo (ZDF) foram selecionados como um modelo de obesidade e diabetes tipo 2 com cicatrização retardada. Ratos ZDF espontaneamente desenvolvem obesidade em aproximadamente 4 semanas. Eles então desenvolver diabetes tipo 2 com obesidade entre 8 e 12 semanas de idade, altura em que eles apresentam hiperglicemia associada com insulina resistência, dislipidemia e hipertrigliceridemia13. Retardada ferida cura, redução do fluxo sanguíneo nos vasos sanguíneos periféricos e nefropatia diabética são também observadas14,15,16. Além disso, ratos ZDF podem ser um modelo adequado para estudar a cicatrização de úlceras cutâneas intratáveis, tais como úlceras diabéticas.

As diferenças entre os seres humanos e roedores em mecanismos de cicatrização de feridas são associadas com diferenças anatômicas na pele. Ferida em ratos normais de cura baseia-se na contração da ferida, Considerando que a cicatrização de feridas em humanos baseia-se na formação de tecido de granulação e re epitelização. Normalmente, ferida imobilização usado em modelos de roedores ajuda a minimizar a contração da ferida e permite a formação gradual do tecido de granulação17, apesar de feridas em ratos não-diabéticos são quase completamente fechadas pela contração. No entanto, diabético ferida contração na ZDF ratos é prejudicada, e ferida cura principalmente ocorre através de re-epitelização e a formação de tecido de granulação; assim, este processo é mais semelhante à humana ferida cura14.

Feridas diabéticas com osso exposto após desbridamento são frequentemente encontrados clinicamente. Estudos prévios examinaram, feridas de pele de espessura total de 12 mm de diâmetro nas costas do modelo camundongos18,19 e feridas de pele de espessura total de 10 mm de diâmetro nas costas dos ratos normais20. Para desenvolver um modelo clínico para feridas diabéticos graves, maiores defeitos de pele de espessura total (15 x 10 mm2) com expostos osso e sem o periósteo foram criados, como descrito anteriormente,21, em ratos com diabetes tipo 2 e obesidade.

Folhas ASC (rASC) rato das ASCs de ratos normais de Lewis foram criadas através do transplante alogênico de folhas ASC. Na prática clínica, o transplante autólogo é inviável porque pacientes diabéticos com úlceras, muitas vezes, apresentam graves complicações do diabético, como glicemia alta não controlada e os índices de massa corporal elevada e estes distúrbios cicatrização de causa complicações que aumentam a dificuldade de obtenção de tecido adiposo destes pacientes. Além disso, ASCs de animais com exposição de diabetes alteraram Propriedades e prejudicada a função22. Portanto, o protocolo aqui apresentado descreve o transplante alogênico de rASC folhas de ratos normais e a aplicação de pele artificial para ratos diabéticos.

A pele artificial de BICAMADA utilizada neste protocolo impede a contração espontânea das feridas, promove a síntese de uma nova matriz de tecido conjuntivo e assemelha-se a derme verdadeiro23. Neste protocolo, pele artificial é colocado sobre uma folha de rASC e fixado com fios de nylon para evitar a contração da ferida ou alargamento resultantes de pele de rato solto. Além disso, a pele artificial fornece uma estrutura tridimensional para as folhas ASC, mantém um ambiente úmido para o transplantado folhas ASC e feridas e protege as feridas de infecção e forças externas. Finalmente, um curativo não-adesivo é colocado sobre a ferida para protegê-lo contra impacto externo, manter um ambiente de ferida húmido e absorver o exsudato.

Uma folha de rASC é fino, flexível e deformável e pode ser aderida a mover sites destinatários, como uma batida de coração24. Célula-folha engenharia tem sido usada para a reconstrução de vários tecidos e pode gerar efeitos curativos25,26. Folhas ASC que apresentam potencial clínico terapêutico podem acelerar a cicatrização de muitos tipos de feridas. Além disso, o transplante alogênico de folhas ASC, combinado com o uso de pele artificial, pode ser aplicável para o tratamento de úlceras intratáveis ou queimaduras, tais como aquelas observadas na doença arterial periférica ou doença do colágeno, ou eles podem ser administrados a pacientes que estão desnutridos ou estiver usando esteroides. Esta abordagem aumenta a eficiência do transplante de ASCs. O modelo de rato ZDF-cicatrização produz uma condição de ferimento grave que se assemelha a ferida humana, processo de cura e imita condições clínicas em um animal experimental de pequeno porte.

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Protocolo

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Todos os protocolos experimentais apresentados abaixo foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal da Escola de Medicina da Universidade Médica Feminina de Tóquio e cumpriram todos os requisitos das Diretrizes para a Condução Adequada de Experimentos com Animais.

1. Preparação de animais, instrumentos, meios de cultura e pratos

  1. Prepare o meio de cultura completo usando o meio essencial alfa mínimo contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina. Armazene-o por vários meses a 4 °C até o uso.
  2. Use ratos ZDF machos adultos como modelo de obesidade diabética tipo 2. Use a almofada de gordura de ratos Lewis machos para isolar o tecido adiposo para preparar as folhas de células.

2. Isolamento e cultura de rASCs

  1. Obtenha tecido adiposo de ratos Lewis (8 a 33 semanas de idade, machos) sob anestesia geral usando isoflurano.
    1. Prepare um ventilador mecânico para roedores e isoflurano a 4%. Prepare várias pontas de algodão estéreis, gazes limpas, um bisturi, um porta-agulhas, uma tesoura de operação, um par de pinças e uma sutura de náilon 5-0. Esterilize os instrumentos e suprimentos cirúrgicos.
    2. Prepare uma placa de Petri de 100 mm com 10 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) para preservar temporariamente o tecido adiposo obtido. Pese a placa de Petri com PBS usando uma balança antes de iniciar a cirurgia para medir o tecido adiposo coletado. Disponha os instrumentos e suprimentos cirúrgicos em uma cortina estéril.
    3. Anestesiar os ratos usando isoflurano a 3 a 4% por meio de um ventilador mecânico para roedores e manter os ratos a 2 a 3% de isoflurano durante a cirurgia. Monitore a profundidade da anestesia observando a profundidade e a frequência respiratória de cada rato.
    4. Enquanto estiver usando luvas estéreis, posicione o rato em decúbito dorsal em uma cortina estéril. Raspe a área operatória com um barbeador elétrico e limpe a seção abdominal do rato com gaze estéril embebida em etanol a 70%.
    5. Faça uma incisão na pele de aproximadamente 5 cm de comprimento com um bisturi na parte inferior lateral do abdômen do rato. Exponha e disseque o músculo oblíquo externo. Em seguida, exponha o tecido adiposo do epidídimo ao redor do epidídimo. Puxe suavemente o tecido adiposo epididimal para fora.
      NOTA: O tecido adiposo pode ser obtido em ambos os lados do abdômen do rato.
    6. Extirpar apenas o tecido adiposo do epidídimo, evitando danos ao epidídimo, testículo e vasos sanguíneos do epidídimo (Figura S1). Mergulhe o tecido adiposo excisado no PBS na placa de Petri para evitar o ressecamento e pesar o tecido.
    7. Feche o músculo abdominal com VICRYL 5-0 e a pele com uma sutura de nylon 5-0. Em seguida, retorne cada rato que foi submetido à cirurgia para uma gaiola separada (um rato por gaiola).
      NOTA: Monitore os ratos até que eles se recuperem totalmente.
  2. Isolar rASCs de 2 a 3 g de tecido adiposo (excisados de um rato de Lewis e processados de acordo com um método relatado anteriormente) 27. Resumidamente, digerir enzimaticamente o tecido adiposo excisado com colagenase tipo A a 0,1% a 37 °C por 1 h para obter a fração estromal-vascular (SVF; Figura S2).
    1. Prepare vários filtros de células de 100 μm, vários tubos de 50 mL, vários tubos de 15 mL e dois bisturis em uma bancada biológica limpa. Ligue uma centrífuga e aqueça um banho-maria a 37 °C. Além disso, prepare aproximadamente 50 mL de PBS estéril em um tubo de 50 mL com 0,1% (concentração final) de colagenase tipo A.
    2. Pique o tecido adiposo em pequenos pedaços usando dois bisturis.
    3. Mova todo o tecido adiposo picado para um tubo de 50 mL e adicione PBS para trazer o volume total para 15 mL.
    4. Descanse o tubo de 50 ml na posição vertical durante 5 min. Elimine a camada superior e recolha a camada inferior, exceto os detritos.
    5. Adicionar 0,1% de solução de colagenase tipo A ao tubo de 50 mL com PBS contendo a camada superior para digerir enzimaticamente o tecido adiposo.
      NOTA: Aqueça aproximadamente 20 mL de PBS por 2 a 3 g de tecido adiposo em banho-maria a 37 ° C.
    6. Incline e agite suavemente o tubo de 50 ml a 120 - 130 rpm durante 1 h em banho-maria a 37 °C.
    7. Descanse o tubo de 50 mL na posição vertical por 5 min após agitar.
    8. Filtrar a solução com um filtro de células de 100 μm e deitar a solução num novo tubo de 50 ml. Dispense a solução filtrada em dois tubos de 15 mL.
    9. Centrifugue a solução nos tubos de 15 ml durante 5 min a 700 x g. Remova cuidadosamente a camada superior do sobrenadante e deixe 5 mL da camada inferior da solução. Não aspire o pellet.
    10. Adicione aproximadamente 5 mL de meio de cultura completo a cada tubo de 15 mL, até 10 mL por tubo de 15 mL e ressuspenda cuidadosamente o pellet.
    11. Repita as etapas 2.2.8 a 2.2.9. Em seguida, obtenha o SVF.
  3. Prepare dois pratos de60 cm 2 culturas. Colete o SVF após duas centrifugações a 700 × g por 5 min. Suspenda o SVF e coloque 10 mL de solução SVF em cada placa de cultura2 de 60 cm.
  4. Cultive os pratos por 24 h a 37 ° C em uma incubadora de CO5% 2
    5. .
  5. Prepare PBS e ácido tripsina-etilenodiamina tetracético (EDTA) a 0,25%, armazenáveis por vários meses a 4 ° C até o uso.
  6. Após o plaqueamento inicial (24 h), lave as células com PBS 3 vezes para remover as células soltas e detritos. Adicione o meio completo fresco.
  7. Passe as células que são quase subconfluentes no dia 3. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% e incube as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% por 3 a 5 min.
    NOTA: Conclua a etapa de tripsinização em 10 minutos para evitar danos às células.
  8. Observe as células sob um microscópio óptico após a tripsinização para confirmar que todas as células se separaram completamente dos pratos. Em seguida, adicione 9 mL de meio de cultura completo aos pratos.
  9. Conte o número de células usando um hemocitômetro.
  10. Subcultive as células a uma densidade de 1,7 x 103 células/cm2 a cada 3 dias até a passagem 3. Cultivar as células subcultivadas a 37 °C na atmosfera humidificada de uma incubadora de CO2 a 5%.

3. Criação de planilhas rASC

  1. Prepare várias placas de cultura adaptáveis à temperatura de 35 mm de diâmetro. Pré-cubra os pratos com FBS (ou meio completo contendo FBS) a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 por mais de 1 h.
    NOTA: Uma placa de cultura sensível à temperatura de 35 mm de diâmetro é um produto disponível comercialmente.
  2. Preparar uma termoplaca e incubar a 37 °C para os seguintes procedimentos experimentais.
    NOTA: Execute todos os procedimentos usando placas de cultura responsivas à temperatura em uma placa térmica a 37 ° C para evitar que as células se desprendam espontaneamente da placa.
    1. Aquecer o meio de cultura completo utilizado nos procedimentos a 37 °C antes da experimentação.
    2. Passagem de sementes 3 rASCs derivadas de ratos Lewis para uma placa de cultura sensível à temperatura de 35 mm de diâmetro a uma densidade de 1,5 x 105 células/placa por 3 dias usando um volume total de 2 mL de meio de cultura completo.
      NOTA: Quando os rASCs são colocados em uma nova placa de cultura, a placa deve ser balançada lentamente para frente e para trás e para a esquerda e para a direita em uma incubadora para obter uma semeadura uniforme de rASC e uma folha de rASC uniformemente espessa.
    3. Troque 2 mL do meio por 2 mL de meio de cultura completo contendo 16,4 μg/mL de sal de fosfato de ácido L-ascórbico e magnésio n-hidratado (AA) no dia 3 após a semeadura nas placas de cultura responsivas à temperatura incubadas em uma placa térmica a 37 °C.
      NOTA: O AA dissolvido pode ser armazenado a -30 °C por meses.
    4. Cultive as células por mais 4 a 5 dias e substitua o meio a cada 2 dias por meio fresco contendo AA.
    5. Confirme a proliferação e geração de ASCs sob um microscópio óptico para determinar se ocorreram lacunas entre as células em uma folha de células contígua.
  3. Transfira as folhas de células da incubadora para a bancada por 15 a 20 minutos para resfriá-las à temperatura ambiente; observe as células se desprenderem espontaneamente como uma folha de células contíguas. Colha a folha de rASC da superfície do prato com uma pinça.
    NOTA: Normalmente, as folhas rASC podem ser manuseadas com um par de pinças. Se necessário, uma membrana de transferência pode ser usada para transferir uma folha de células da placa de cultura para o local da ferida se a folha de células for quebradiça e frágil.

4. Preparação do Modelo de Ferida de Defeito Cutâneo de Espessura Total e Transplante de Folhas rASC

  1. Prepare um ventilador mecânico para roedores e isoflurano a 4%. Prepare várias pontas de algodão estéreis, gaze limpa, sutura de náilon 5-0, bisturi, raspatório periosteal, porta-agulha, tesoura de operação e uma pinça. Esterilize os instrumentos e suprimentos cirúrgicos. Disponha os instrumentos e suprimentos cirúrgicos em uma cortina estéril.
  2. Prepare o PBS e mantenha-o em temperatura ambiente, junto com um pouco de pele artificial e um curativo não adesivo. Pré-corte a pele artificial (15 x 10 mm) e o curativo não adesivo (20 × 15 mm). Mergulhe a camada interna de esponja de colágeno da pele artificial em solução salina antes de usar a pele artificial.
    NOTA: A pele artificial é feita de duas camadas: uma camada externa de folha de silicone e uma esponja interna de colágeno.
  3. Use ratos ZDF (16 - 18 semanas de idade, machos, 500 - 600 g) como modelo de cicatrização de feridas para diabetes tipo 2 e obesidade.
  4. Anestesiar os ratos ZDF por inalação de isoflurano a 4% usando um ventilador mecânico para roedores. Induza a anestesia usando isoflurano a 4 a 5% por meio de um ventilador mecânico para roedores e mantenha-o a 3 a 4% durante a cirurgia. Monitore a profundidade da anestesia observando a profundidade e a taxa de respiração de cada rato por meio de uma pitada no dedo do pé.
  5. Enquanto estiver usando luvas estéreis, posicione o rato em decúbito ventral em uma cortina estéril. Limpe a cabeça do rato com gaze estéril embebida em etanol a 70%, raspe a área operatória com um barbeador elétrico e limpe a pele após o barbear com gaze estéril embebida em etanol a 70%.
  6. Crie um defeito cutâneo quadrado de espessura total (15 x 10 mm2) na cabeça dos ratos ZDF anestesiados, removendo o tecido cutâneo da epiderme para o periósteo. Extirpar a pele e o tecido cutâneo com um bisturi e remover o periósteo com um raspatório periosteal.
  7. Mova os rASCs na placa de cultura responsiva à temperatura de 35 mm da incubadora para um ambiente em temperatura ambiente imediatamente antes do transplante.
  8. Observe os rASCs na placa de cultura sensível à temperatura de 35 mm se desprenderem espontaneamente como uma folha da superfície da placa após a formação de uma ferida. Colha as folhas de rASC após 7 dias de cultivo em placas de cultura responsivas à temperatura. Remova o meio cultivado e lave a folha de rASC com PBS três vezes. Mergulhe a folha de rASC em PBS até o transplante para evitar a dessecação.
  9. Coloque a folha rASC imediatamente sobre o defeito do crânio usando uma pinça. Se a folha de células for quebradiça e frágil, uma membrana pode ser usada como um andaime para transferir a folha de células da placa de cultura para o local da ferida.
  10. Cubra a folha e o defeito do rASC com a pele artificial (15 x 10 mm2) e feche a ferida com aproximadamente 10 pontos usando a sutura de náilon 5-0. Para proteger a ferida, coloque um curativo não adesivo (20 x 15 mm2) sobre a pele artificial, usando pontos de náilon 5-0 para manter o ambiente da ferida úmido e absorver os exsudatos.
    NOTA: Os curativos não adesivos serão removidos pelos ratos ZDF dentro de alguns dias após a aplicação. Portanto, é necessário monitorar regularmente os ratos após o transplante. Normalmente, o curativo não adesivo é substituído a cada 2 dias sob anestesia geral.
  11. Devolva cada rato que foi submetido a cirurgia para uma gaiola separada até que esteja totalmente recuperado (um rato por gaiola). Após um período de observação, eutanasiar os ratos usando o método aprovado de overdose de isoflurano.

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Resultados

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Este protocolo tentou estabelecer uma nova terapia baseada em células para feridas diabéticas intratáveis. Brevemente (como ilustrado na Figura 1), folhas de rASC alogênico foram criadas a partir de ratos normais usando a célula-folha engenharia e então foram transplantadas usando uma BICAMADA de pele artificial para um defeito de pele de espessura total em um rato diabético. Imagens de microscópio de luz de um bom exemplo de uma folha de rASC (Figura 2A)...

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Discussão

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Os passos mais críticos para cultivo com sucesso uma folha rASC são as seguintes: 1) a temperatura deve ser mantida a aproximadamente 37 ° C durante o cultivo sobre os pratos de cultura temperatura-responsivo. Durante a criação de uma folha de rASC, cada procedimento foi realizado em um thermo-prato de 37 ° C, e cada reagente foi aquecido a 37 ° C, para impedir que as células espontaneamente desanexação do prato31. 2) os destinatários ratos ZDF devem ser monitorados para evitar a remoção do curati...

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Divulgações

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Os seguintes autores divulgar relações financeiras relevantes para esta publicação: Teruo Okano é fundador e diretor do Conselho da célula Seed Inc., que licencia a tecnologia e patentes da universidade médica de Tokyo feminino, e Teruo Okano e Masayuki Yamato são partes interessadas na Universidade de medicina de célula semente Inc. Tokyo feminino recebe fundos de pesquisa de célula semente Inc. Outros autores a declaram que não têm relações financeiras relevantes para essa publicação.

Agradecimentos

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Os autores agradecer Dr. Yukiko Koga do departamento de plástico e cirurgia reconstrutiva, Juntendo University School of Medicine, fornecendo conselhos práticos. Agradecemos também o Sr. Hidekazu Murata do centro de Tóquio diabéticas do Medical University School of Medicine para excelente suporte técnico. Este estudo foi suportado pela criação de centros de inovação para avançado programa de áreas de investigação interdisciplinar do projeto em desenvolvimento para sistemas de inovação "célula folha de tecido Engineering Center (CSTEC)" do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Soro fetal bovino (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies15140-122
Colagenase ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Alemanha
60 cm2 Placa de cultura de tecidos PrimariaBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS)Life Technologies1490-144
0,25% de ácido tripsina-etilenodiamina tetracético (EDTA)Life Technologies25200-056
L-ácido ascórbico fosfato sal de magnésio n-hidratoWako013-19641
Placa de cultura responsiva à temperatura de 35 mm (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tóquio, Japão
Placa microquente (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Stoelting#50206Wood Dale, IL
4% isofluranoPfizer Japan114-13340-3Tóquio, Japão
Pele artificial (Pelnac® )Smith & SobrinhoPN-R40060  Tóquio, Japão
Curativo não adesivo (Hydrosite plus® )Smith & Sobrinho66800679conhecido como Allevyn não-aderente® nos Estados Unidos
5-0 sutura de nylonAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESgreiner bio-one227 261
15 mL Tubo de CentrífugaCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHu-FriedyP14Chicago, IL
Ventilador mecânico para roedores

Referências

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