Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

Summary

Este estudo demonstra a preparação cirúrgica do músculo cremaster de rato para a visualização da camada livre de células in vivo. Fatores consideráveis que afetam a precisão da medição da largura da camada livre de células são discutidos neste estudo.

Abstract

A camada livre de células é definida como a camada de plasma parietal no fluxo de microvasos, que é desprovida de glóbulos vermelhos. A medição da largura da camada livre de células in vivo e suas variações espaço-temporais podem fornecer uma compreensão abrangente da hemodinâmica na microcirculação. Neste estudo, usamos um sistema microscópico intravital acoplado a uma câmera de vídeo de alta velocidade para quantificar as larguras das camadas livres de células nas arteríolas in vivo. O músculo cremaster de ratos Sprague-Dawley foi exteriorizado cirurgicamente para visualizar o fluxo sanguíneo. Um script de imagem personalizado também foi desenvolvido para automatizar o processamento de imagens e a análise da largura da camada livre de células. Essa abordagem permite a quantificação das variações espaço-temporais de forma mais consistente do que as medições manuais anteriores. A precisão da medição, no entanto, depende em parte do uso de um filtro azul e da seleção de um algoritmo de limiar apropriado. Especificamente, avaliamos o contraste e a qualidade das imagens adquiridas com e sem o uso de filtro azul. Além disso, comparamos cinco diferentes algoritmos de limiar baseados em histograma de imagem (Otsu, mínimo, intermodo, seleção iterativa e limiar entrópico difuso) e ilustramos as diferenças em sua determinação da largura da camada livre de células.

Introduction

Estudos em animais in vivo são fundamentais para a ciência básica para a compreensão da fisiologia e patologia humanas. Em particular, estudos micro-hemodinâmicos in vivo podem elucidar o potencial comprometimento das funções microcirculatórias alteradas por condições reológicas anormais do sangue. Vários estudos micro-hemodinâmicos anteriores¹ usaram o modelo do músculo cremaster de rato para visualizar o fluxo sanguíneo microvascular. O músculo cremaster é uma fina camada de músculo estriado ao redor dos testículos. Assim, o fluxo sanguíneo no músculo pode ser visualizado com um microscópio de transiluminação por meio de exposição cirúrg....

Protocol

Este estudo está de acordo com a Universidade Nacional de Singapura Institutional Animal Care e Use Committee (protocolo aprovado no. R15-0225).

1. Preparação cirúrgica do Modelo Animal

1. canulações navio
   1. Anestesiar a ratazanas macho Sprague-Dawley (6 - 7 semanas de idade) de pesagem (203 ± 20) g com cetamina (37,5 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) cocktail através de injecção intraperitoneal (ip) de injecção (2 ml / kg) . Não recapitular a agulha ou removê-lo a partir da seringa, após a injecção.
   2. Uma vez que o animal foi anestesiado (confirmado por dedo do pé que comprime a), colocá-la sobre uma....

Results

A visualização da CFL in vivo é largamente dependente das preparações cirúrgicos do animal. perda excessiva de sangue ou duração da cirurgia estendida pode sujeitar o animal ao choque e aberrações do fluxo sanguíneo. Manutenção da temperatura do tecido usando uma almofada de aquecimento, bem como uma plataforma de personalização durante a cirurgia e experiência também é crucial para manter as condições fisiológicas do rato. Por utilização de uma lâmpada de halogéneo de 100 W no sistema de microscópio, sem danos.......

Discussion

A medição da largura CFL é essencial para uma melhor compreensão da hemodinâmica na microcirculação. Em particular, a medição de larguras CFL tem sido realizada em mesentérica ^6, espinhotrapézio ²⁴ e cerebrais ²⁵ microcirculations. Medição convencional de in vivo larguras CFL foi restrita a estimativas por inspeção manual dos quadros de vídeo gravadas. As medições manuais necessários a média de vários quadros de vídeo sucessivas antes de identificar visualmente os limites das ce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio intravital	Olympus	BX51WI	Equipamento
Câmera de alta velocidade	Photron	1024PCI	Equipamento
Filtro azul	HOYA	B390
Equipamento Sensor de pressão e sistema biopac	Sistema Biopac	TSD104A, MP100
Equipamento Controlador de temperatura	Shimaden	SR 1	Equipamento
Plasma Lyte A	Baxter	NDC:0338-0221	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Solução salina 0,9%	Braun
Heparina (5.000 UI/ml)	Tubo
PE-10	Becton Dickinson	427400.024	" OD x .011" ID
Tubo de polietileno PE-50	Becton Dickinson		427411.038" OD x .023" ID
Tubo de polietileno PE-205	Becton Dickinson		427446.082" OD x .062" ID
2-0 sutura de seda não absorvível	Deknatel	113-S
5-0 sutura de seda não absorvível	Deknatel	106-S
Almofada de aquecimento de circulação de água	Gaymar
Banho de água	Fisher Scientific	Isotemp 205	Equipamento
de Algodão Estéril	Fisher Scientific	22-415-468
Aplicadores com ponta de algodão	Fisher Scientific	23-400-124
Pinça Dumont	Scientific	INS14188	Instrumento cirúrgico
Pinça de microdissecação	Kent Scientific	INS15915	Instrumento cirúrgico
Pinça de íris 1 x 2 dentes	Kent Scientific	INS15917	Surgical instrumento
Pinça de canulação de vasos	Kent Scientific	INS500377	Instrumento cirúrgico
Micro tesoura	Kent Scientific	INS14177	Instrumento cirúrgico
Tesoura de íris	Kent Scientific	INS14225	Instrumento cirúrgico
Clipe de vaso	Kent Scientific	INS14120	Instrumento cirúrgico
Sistema de cautério Gemini	Braintree Scientific	GEM 5917	Instrumento cirúrgico