Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

Summary

Este estudo demonstra a preparação cirúrgica do músculo cremaster de rato para a visualização da camada livre de células in vivo. Fatores consideráveis que afetam a precisão da medição da largura da camada livre de células são discutidos neste estudo.

Abstract

A camada livre de células é definida como a camada de plasma parietal no fluxo de microvasos, que é desprovida de glóbulos vermelhos. A medição da largura da camada livre de células in vivo e suas variações espaço-temporais podem fornecer uma compreensão abrangente da hemodinâmica na microcirculação. Neste estudo, usamos um sistema microscópico intravital acoplado a uma câmera de vídeo de alta velocidade para quantificar as larguras das camadas livres de células nas arteríolas in vivo. O músculo cremaster de ratos Sprague-Dawley foi exteriorizado cirurgicamente para visualizar o fluxo sanguíneo. Um script de imagem personalizado também foi desenvolvido para automatizar o processamento de imagens e a análise da largura da camada livre de células. Essa abordagem permite a quantificação das variações espaço-temporais de forma mais consistente do que as medições manuais anteriores. A precisão da medição, no entanto, depende em parte do uso de um filtro azul e da seleção de um algoritmo de limiar apropriado. Especificamente, avaliamos o contraste e a qualidade das imagens adquiridas com e sem o uso de filtro azul. Além disso, comparamos cinco diferentes algoritmos de limiar baseados em histograma de imagem (Otsu, mínimo, intermodo, seleção iterativa e limiar entrópico difuso) e ilustramos as diferenças em sua determinação da largura da camada livre de células.

Introduction

Estudos em animais in vivo são fundamentais para a ciência básica para a compreensão da fisiologia e patologia humanas. Em particular, estudos micro-hemodinâmicos in vivo podem elucidar o potencial comprometimento das funções microcirculatórias alteradas por condições reológicas anormais do sangue. Vários estudos micro-hemodinâmicos anteriores¹ usaram o modelo do músculo cremaster de rato para visualizar o fluxo sanguíneo microvascular. O músculo cremaster é uma fina camada de músculo estriado ao redor dos testículos. Assim, o fluxo sanguíneo no músculo pode ser visualizado com um microscópio de transiluminação por meio de exposição cirúrgica. Isso nos permite adquirir as imagens do fluxo sanguíneo in vivo sem o uso de qualquer fluorescência ou agentes de contraste. Além disso, toda a perfusão sanguínea da rede muscular pode ser controlada pela redução do fluxo sanguíneo a montante com a oclusão da aorta^abdominal2. Devido a essas vantagens, o modelo do músculo cremaster tem sido amplamente utilizado para investigar a formação de camada livre de células (CFL) em microvasos^1,3.

A largura da CFL é um parâmetro hemodinâmico proeminente na microcirculação, que tem sido de grande interesse por seus importantes papéis na regulação das funções microcirculatórias. O LFC é formado pela migração transversal para dentro de glóbulos vermelhos (RBCs) induzida por cisalhamento em direção ao centro de fluxo⁴. Consequentemente, essa migração leva à depleção de hemácias próximas às paredes dos vasos, resultando em uma camada de plasma livre de células. Consequentemente, o CFL parietal torna-se naturalmente uma barreira de difusão para a entrega de oxigênio (O₂) do núcleo das hemácias para os tecidos e para a eliminação de óxido nítrico (NO) pelas hemácias^5,6. Além disso, a produção de NO também pode ser modulada pelas variações dinâmicas da largura da CFL^7,8. Portanto, os papéis do CFL no transporte de gás e na regulação da homeostase na microcirculação precisam ser totalmente determinados para entender melhor o fluxo sanguíneo na microcirculação. Estudos recentes têm se concentrado em unir as funções hemodinâmicas e de transporte de gás do CFL na microcirculação^9-12. Além disso, um conjunto separado de estudos também investigou como a elevação patológica na agregação de hemácias modula a formação de CFL e seu efeito na biodisponibilidade de O₂ e NO nos tecidos^13,14.

Os papéis da CFL tornam-se mais significativos na microcirculação, onde o tamanho relativo da largura da CFL ao diâmetro do vaso é proeminente. Isso requer uma abordagem eficaz de quantificar o CFL no fluxo sanguíneo in vivo. Particularmente, a aquisição e a análise de imagens são os dois principais componentes que determinam a precisão da medição da largura da CFL. A visualização bem-sucedida do fluxo sanguíneo tecidual deve ser precedida por uma preparação cirúrgica apropriada do modelo animal. Além disso, uma técnica adequada de análise de imagem é necessária para superar as limitações das medições manuais convencionais que são induzidas principalmente por erros humanos^15,16. Com os avanços na instrumentação óptica e no poder de computação para processamento de imagem digital, agora é possível obter uma medição mais precisa e consistente da largura da CFL^17-19. No entanto, a precisão dessas medições, sendo baseadas em imagens, ainda depende, em última análise, da qualidade das imagens.

Portanto, este estudo explora os fatores que influenciam a medição da largura da CFL in vivo. Nós nos concentramos particularmente em demonstrar a preparação cirúrgica e a análise de imagem digital para medidas da largura da CFL em arteríolas do músculo cremaster de ratos.

Protocol

Este estudo está de acordo com a Universidade Nacional de Singapura Institutional Animal Care e Use Committee (protocolo aprovado no. R15-0225).

1. Preparação cirúrgica do Modelo Animal

1. canulações navio
   1. Anestesiar a ratazanas macho Sprague-Dawley (6 - 7 semanas de idade) de pesagem (203 ± 20) g com cetamina (37,5 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) cocktail através de injecção intraperitoneal (ip) de injecção (2 ml / kg) . Não recapitular a agulha ou removê-lo a partir da seringa, após a injecção.
   2. Uma vez que o animal foi anestesiado (confirmado por dedo do pé que comprime a), colocá-la sobre uma almofada de aquecimento para manter a sua temperatura do corpo a 37 ° C. Delicadamente raspar o cabelo na escápula, colo do útero anterior, abdômen, perna medial e saco escrotal. Gentilmente conter as pernas usando fitas de papel adesivas.
   3. Executar todos os procedimentos cirúrgicos com uma tesoura de microdissecção e pinças angulares durante a visualização atravésum estereomicroscópio. Coloque todos os instrumentos cirúrgicos afiados em uma bandeja resistente a perfurações para evitar lesões durante a cirurgia.
   4. Esfregue todos os locais cirúrgicos 3 vezes com alternância de iodo e álcool 70% antes de realizar a incisão. Lave todos os cateteres com 30 solução de heparina salina UI / ml.
   5. Faça de 1 - 1,5 centímetros incisão na pele na linha média sobre as escápulas usando um par de tesouras cirúrgicas sobre a veia jugular direita. Separa-se a fáscia por dissecção cega para expor a veia jugular e canular-lo com um tubo de polietileno (PE-50) cheio com heparina-solução salina utilizando 5-0 suturas de seda. Infundir anestesia suplementar quando necessário (1/3 a 1/2 da dose inicial, por via intravenosa (iv)) ao longo do curso da experiência e cirurgia.
   6. Realização da traqueostomia para manter a desobstrução das vias aéreas. Adicione de 1 - 1,5 centímetros incisão na área cervical anterior. Canular a traqueia usando um tubo de polietileno (PE-205) com fio de seda 2-0 para fixar o cateter no local.
   7. Monitor de pressão arterialatravés de punção na artéria femoral. Faça de 1 - 1,5 centímetros incisão na face medial esquerdo da perna traseira. Separar a artéria femoral por dissecção romba. Canular a artéria femoral, com um tubo de polietileno (PE-10) cheio com heparina-solução salina utilizando 5-0 suturas de seda.
2. Cremaster Muscle Preparação and Flow Visualization
   1. Insira uma sutura 5-0 seda através do ápice do saco escrotal para estendê-lo. Realizar uma incisão ao longo da superfície ventral do saco escrotal. Regularmente aplicar a solução isotónica quente (37 ° C; pH 7,4) para o músculo exposta.
   2. Remover circundante tecidos conjuntivos com cuidado e profundidade usando um aplicador com ponta de algodão.
   3. Insira uma sutura 5-0 seda através do ápice do músculo cremaster. Corte a sutura em duas partes de igual comprimento e faça um nó em cada lado. Corte o músculo entre os dois nós e esticá-la em uma plataforma transparente de acrílico personalizado puxando suavemente a sutura. Consertara extremidade do fio de sutura para a plataforma com a aderência azul.
      NOTA: a remoção completa de cercar tecidos conjuntivos é crucial na obtenção de contraste de imagem ideal.
   4. 1.2.3 Repita o passo até 5 a 6 fixações são feitas. Remova cuidadosamente o músculo cremaster do epidídimo usando alta cautério temperatura. Superfuse solução isotónica quente para o músculo exposta para evitar a desidratação do tecido.
      1. Cerque o músculo cremaster com peças dobradas de gaze. Cobrir o músculo exposta com uma película de polivinil. Os pedaços de gaze com o filme formar uma bacia rasa para segurar solução isotônica quente para o objetivo de imersão em água microscópio (Figura 1A).
   5. Transferir o animal para a fase de animais de um microscópio intravital (Figura 1C). Ligue a punção arterial a um sistema de aquisição de dados fisiológica para monitorização da pressão contínua (Figura 1E).
   6. Manter a temperat muscularure a 35 ° C com um elemento de aquecimento ligado por baixo da plataforma do animal (Figura 1B). Coloque um sensor de temperatura junto ao músculo para fornecer feedback negativo para o controlador de energia do elemento de aquecimento (Figura 1D).
   7. Deixar o animal no estágio durante 15 minutos para equilibrar com o ambiente.
   8. Visualizar o fluxo sanguíneo ao microscópio intravital com um objetivo de imersão em água 40X e um condensador de funcionamento longa.
   9. Escolha uma arteríola não ramificado (<60 um), com base em um foco de imagem clara e contraste entre o núcleo de RBC, CFL e dos vasos paredes, a fim de focar o microscópio sobre o plano diametral do vaso sanguíneo. Rodar a câmara montada no microscópio para alinhar verticalmente a parede do vaso.
   10. Grave o fluxo de sangue usando uma câmera de vídeo de alta velocidade com uma taxa de quadros de 3.000 / seg por 1 segundo. Salvar o vídeo gravado em formato AVI em tons de cinza não-comprimido de 8 bits para preservar a qualidade da imagem.
       NOTA: Recomenda-se uma velocidade mínima do quadro de gravação de 3.000 quadros / seg para assegurar que a medição de CFL pode ser realizada pelo menos uma vez por RBC sob condições de fluxo fisiológicas arteriolar.
   11. Usar um filtro azul com pico de transmissão em comprimento de onda de 394 nm, e passa-banda espectral de 310 - 510 nm, para aumentar o contraste entre as hemácias e plasma.
       NOTA: Certifique-se de que o espectro de luz que passa através do filtro azul da fonte de luz microscópica (lâmpada de halogéneo de 100 W) é de baixa intensidade de luz para evitar qualquer dano tecidual potencial.
   12. No final da experiência, os animais a eutanásia com uma sobredose de pentobarbital de sódio.

Análise 2. Imagem

1. Pré-processamento para a medição da largura do CFL
   1. Abra MATLAB e execute o arquivo 'CFL_pre.m'. (Este e outros arquivos MATLAB pode ser encontrado noip "> Suplementar MATLAB Arquivo.)
   2. Clique em "Abrir arquivo" para selecionar o arquivo de vídeo para analisar.
   3. Ajuste o controle deslizante de "rotação" para alinhar as paredes dos vasos verticalmente.
      NOTA: Os usuários podem exibir as linhas de grade de apoio para o alinhamento navio, selecionando o botão de opção 'Grid On' e ajuste o nível de zoom da imagem deslizando o controle deslizante 'Zoom'.
   4. Clique no botão 'Confirmar Editar' para confirmar o alinhamento navio.
   5. Clique no botão 'Definir ROI para a cultura' para definir a região de interesse (ROI). A imagem alinhada será exibido em uma janela pop-up. Ajustar o objetivo rectangular na imagem e clique duas vezes para confirmar a ROI. Pule esta etapa se o corte de imagem não é necessária.
      NOTA: Apenas incluem um único recipiente na ROI para analisar a largura do recipiente de CFL. Clique no botão "Reiniciar Imagem 'para restaurar a imagem à sua forma original, se necessário.
   6. Clique no9; Extrato 'botão para extrair todos os quadros de vídeo editados em imagens de mapas de bits consecutivos (8-bit em tons de cinza "Imagens BMP'). As imagens extraídas podem ser encontrados na pasta com o mesmo nome do arquivo de vídeo selecionado.
2. Medição da largura CFL
   1. Abra MATLAB e execute o arquivo 'CFL_measure.m'.
   2. Clique em "Selecionar Pasta" para selecionar a pasta que contém as imagens extraídas.
   3. Clique na pasta que contém as imagens e clique em "Selecionar Pasta". O primeiro quadro de imagem na pasta será carregado e mostrado no painel 'Tons de cinza imagem', juntamente com o seu cinza histograma de intensidade no painel 'Imagem Histograma'.
   4. Selecione o quadro de imagem desejada na caixa de lista para realizar a análise, caso contrário, o primeiro quadro de imagem será selecionado.
   5. Clique "Encontrar navio Paredes 'para identificar o interior da parede do vaso na imagem, que é determinada no local onde oluz perfil de intensidade de pico trânsitos de escuro para claro ao longo de dois pixels.
   6. Verificar 'filtro mediano' para aplicar um filtro de média para a imagem para reduzir o ruído de "sal e pimenta".
   7. Check 'Auto Contraste' para ajustar as intensidades de imagem digital para aumentar o contraste da imagem.
   8. Selecione um algoritmo de limiarização na caixa de listagem que determina automaticamente um valor limiar (τ) que divide os níveis de cinza em duas classes - pixels brancos com níveis de cinza acima τ (CFL), e pixels pretos com níveis de cinza abaixo τ (RBC core).
      NOTA: Como um método alternativo, use limiar manual se nenhum dos algoritmo de limiarização automatizado proporciona um limiar de imagem apropriado. Clique no botão de opção 'Manual' e ajuste o controle deslizante para definir o valor de limiar manual.
   9. Para medir a variação espacial das larguras CFL, digite a resolução de pixels na caixa de 'pixels de resolução' (a resoluçãoCom esta configuração experimental foi de 0,42 mm / pixel).
   10. Clique no botão "Calcular" para obter a variação espacial das larguras CFL. Clique em '.csv Exportar' para exportar os dados de largura CFL em um formato de tabela.
   11. Para medir a variação temporal das larguras CFL em uma linha de análise específica ao longo do vaso, clique no botão de opção 'Temporal Variação "e insira as informações taxa de quadros (a taxa de quadros usada nesta configuração experimental foi 3.000 frames / seg).
   12. Digite o primeiro quadro e último quadro das imagens para a análise nas caixas 'Iniciar Frame' e 'Última frame', respectivamente.
   13. Seleccione a posição da linha de análise ao longo do vaso deslizando barra deslizante da "Linha Análise '. Confirmar a posição da linha de análise, o qual é ilustrado em ambos os 'imagem em escala de cinza "e" imagem binária'.
   14. Clique em "Calcular" para obter a variação temporal das larguras CFL. click 'Export .csv' para exportar os dados de largura CFL em um formato de tabela.

Results

A visualização da CFL in vivo é largamente dependente das preparações cirúrgicos do animal. perda excessiva de sangue ou duração da cirurgia estendida pode sujeitar o animal ao choque e aberrações do fluxo sanguíneo. Manutenção da temperatura do tecido usando uma almofada de aquecimento, bem como uma plataforma de personalização durante a cirurgia e experiência também é crucial para manter as condições fisiológicas do rato. Por utilização de uma lâmpada de halogéneo de 100 W no sistema de microscópio, sem danos...

Discussion

A medição da largura CFL é essencial para uma melhor compreensão da hemodinâmica na microcirculação. Em particular, a medição de larguras CFL tem sido realizada em mesentérica ^6, espinhotrapézio ²⁴ e cerebrais ²⁵ microcirculations. Medição convencional de in vivo larguras CFL foi restrita a estimativas por inspeção manual dos quadros de vídeo gravadas. As medições manuais necessários a média de vários quadros de vídeo sucessivas antes de identificar visualmente os limites das ce...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio intravital	Olympus	BX51WI	Equipamento
Câmera de alta velocidade	Photron	1024PCI	Equipamento
Filtro azul	HOYA	B390
Equipamento Sensor de pressão e sistema biopac	Sistema Biopac	TSD104A, MP100
Equipamento Controlador de temperatura	Shimaden	SR 1	Equipamento
Plasma Lyte A	Baxter	NDC:0338-0221	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Solução salina 0,9%	Braun
Heparina (5.000 UI/ml)	Tubo
PE-10	Becton Dickinson	427400.024	" OD x .011" ID
Tubo de polietileno PE-50	Becton Dickinson		427411.038" OD x .023" ID
Tubo de polietileno PE-205	Becton Dickinson		427446.082" OD x .062" ID
2-0 sutura de seda não absorvível	Deknatel	113-S
5-0 sutura de seda não absorvível	Deknatel	106-S
Almofada de aquecimento de circulação de água	Gaymar
Banho de água	Fisher Scientific	Isotemp 205	Equipamento
de Algodão Estéril	Fisher Scientific	22-415-468
Aplicadores com ponta de algodão	Fisher Scientific	23-400-124
Pinça Dumont	Scientific	INS14188	Instrumento cirúrgico
Pinça de microdissecação	Kent Scientific	INS15915	Instrumento cirúrgico
Pinça de íris 1 x 2 dentes	Kent Scientific	INS15917	Surgical instrumento
Pinça de canulação de vasos	Kent Scientific	INS500377	Instrumento cirúrgico
Micro tesoura	Kent Scientific	INS14177	Instrumento cirúrgico
Tesoura de íris	Kent Scientific	INS14225	Instrumento cirúrgico
Clipe de vaso	Kent Scientific	INS14120	Instrumento cirúrgico
Sistema de cautério Gemini	Braintree Scientific	GEM 5917	Instrumento cirúrgico