Aqui apresentamos um protocolo que facilita a caracterização funcional de médio a alto rendimento de construções de genes e promotores em tecidos secundários de árvores em prazos comparativamente curtos. É eficiente, fácil de usar e amplamente aplicável a uma variedade de espécies de árvores.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste
Neste artigo
Resumo
Resumo
crescimento do caule secundário em árvores e formação da madeira associada são significativos tanto a partir de perspectivas biológicas e comerciais. No entanto, pouco se sabe sobre o controle molecular que regula o seu desenvolvimento. Isto é em parte devido à física, recursos e limitações de tempo, muitas vezes associada ao estudo dos processos de crescimento secundários. Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados envolvendo qualquer parte da planta ou planta inteira em sistema tanto espécies lenhosas e plantas não-lenhosas. No entanto, as perguntas sobre a sua aplicabilidade para o estudo dos processos de crescimento secundária da haste, a recalcitrância de determinadas espécies e intensidade de trabalho são muitas vezes proibitivos para médias e aplicações de alto débito. Além disso, quando se olha para a formação de desenvolvimento do caule e madeira secundário as características específicas sob investigação só poderia tornar-se mensurável no final do ciclo de vida de uma árvore depois de vários anos de crescimento. Em resposta a estes desafios alternativa in vivo protocols foram desenvolvidos, com o nome Induced Somatic Análise Sectorial, que envolvem a criação de setores de tecidos somáticos transgênicos diretamente no secundária da haste da planta. O objectivo do presente protocolo é o de proporcionar um meio eficiente, simples e relativamente rápido para a criação de tecido de planta transgénica secundário para o gene e o promotor de caracterização funcional que pode ser utilizado numa gama de espécies de árvores. Os resultados aqui apresentados mostram que os sectores secundária da haste transgénicas podem ser criados em todos os tecidos vivos e de tipos de células em hastes secundárias de uma variedade de espécies de árvores e que a madeira características morfológicas como também os padrões de expressão do promotor em hastes secundárias pode ser facilmente avaliada facilitar média a alta caracterização funcional de transferência.
Introdução
Árvore de caules compreendem uma quantidade significativa de biomassa planetas e são de grande importância biológica, cultural e comercial. Hastes secundárias criar habitat, fornecendo recursos e abrigo para muitas outras formas de vida. Eles oferecem muitos outros serviços aos ecossistemas que habitam e agem como um recurso renovável para a produção de madeira, papel e celulose e outros produtos madeireiros e não-madeireiros. desenvolvimento secundária da haste e, mais especificamente, a formação da madeira é regulada pelo sistema complexo molecular que regulam o desenvolvimento de tipos específicos de células, a composição bioquímica das suas paredes celulares e como eles estão dispostos para formar tecidos e órgãos. Dissecando a base molecular do desenvolvimento secundária da haste e formação da madeira é confundida por muitos fatores, incluindo a variabilidade das propriedades da madeira e tronco dentro e entre as hastes, longos tempos de geração, sistemas de Cruzamento de acasalamento, alta heterozigosidade, alta carga genética, dormência sazonal, a longo maduroperíodos estabelecimento traço e o tamanho físico absoluto de árvores maduras. Como resultado, a compreensão do desenvolvimento secundária da haste em relação ao conhecimento detalhado da maioria dos outros aspectos do controle molecular do desenvolvimento da planta, ainda está em sua infância.
Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados para estudar o desenvolvimento e compreender secundária da haste, em especial de madeira e a formação da parede celular secundária. Esses protocolos envolvem a utilização de sistemas de parte de planta ou planta inteira, em que ou as plantas transgénicas são criadas ou células ou tecidos específicos secundários são transformados para o estudo de aspectos específicos de madeira e / ou desenvolvimento de uma haste secundária. As plantas transgénicas podem ser recuperados transformação pós genética a partir de uma ampla variedade de tecidos de plantas e tipos de células, no entanto, o progresso é lento, especialmente quando se analisa os traços de fibras de madeira devido à longa regeneração e haste tempos de maturação (na ordem de anos), alta técnica e Deman de trabalhods, baixa taxa de transferência de genes candidatos, bem como dificuldades na propagação de algumas espécies de plantas lenhosas. Técnicas similares têm sido desenvolvidos no sistema de modelo não-lenhoso, como Arabidopsis que com sucesso superar algumas destas limitações, mas nem todos os tipos de células-tronco secundárias um presente nestes caules e caracteres relacionados à sazonalidade ou a longevidade não pode ser estudada em tais espécies 2. Alternativamente, sistemas de parte da planta, tais como Pinu s radiata calos 3 reduzir os prazos associados. Estes métodos são, no entanto restringida ao estudo de um tipo de célula individual e sofrem restrições semelhantes como observado em experiências in vitro. Da mesma forma, as culturas-tronco apicais 4 envolvendo explantes-tronco inteiros mostraram-se promissores, mas ainda não foram aplicadas para o estudo de genes ou promotores de interesse específicos. Mais recentemente, um protocolo alternativo envolvendo culturas de raízes peludas tem sido desenvolvido para o eucalipto e tem sido êxitoaplicada 5, no entanto, este método ainda requer cultivo in vitro, envolve raízes secundárias em vez de hastes e até hoje ela é limitada a uma única espécie de árvore.
Induzida análise do sector somáticas (ISSA), conforme descrito aqui, foi desenvolvido para superar alguns desses problemas fornecendo um meio de alto rendimento ferramenta de triagem funcional para genes e promotores com papéis suspeitos na formação da madeira e desenvolvimento do tecido secundária da haste. ISSA é uma transformação e rastreio sistema in vivo que foi desenvolvido para reduzir o tempo necessário para a produção de células transgénicas e o tecido de uma haste secundária intacta, enquanto a superação de trabalho, limitações técnicas e taxa de transferência de rotina usado em métodos in vitro. Os protocolos aqui descritos permitem a criação simultânea de centenas de sectores tecido transformado de forma independente e células em hastes secundárias dentro de um curto período de tempo, nas espécies de árvores e tecido de interesse sem gvariação enetic e / ou ambiental dentro de prazos relativamente curtos e de baixo custo de trabalho. ISSA em técnicas in vivo foram primeiramente descrita por secundária da haste 6 e botão 7 tecidos e desde então foi refinado no tecido secundária da haste através de estudos de genes e / ou promotores envolvidos na diferenciação cambial e incluem: tubulina (TUB) 8, a fasciclina-like arabinogalactan ( FLA) 9, sintase celulose (CESA) 10, célula domínio NAC associada a parede secundária (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e realmente proteína interessante novo gene (ANEL) H2 13. Estes estudos foram realizados no secundário caules de plantas de álamo e de eucalipto e fornecidos insights sobre a morfologia das células, química da parede celular e expressão gênica.
Os protocolos descritos aqui têm a intenção de reunir a experiência de umnd conhecimento adquirido através do desenvolvimento e aplicação de ISSA de uma série de estudos publicados e não publicados durante a última década. Eles se concentram na transformação in vivo de tecidos secundária da haste 6 e concentrar-se em estudos envolvendo clone Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus, bem como 11 Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento leva pesquisadores através do protocolo a partir do cultivo de plantas e bactérias, a transformação de tecidos do caule, crescimento e colheita de tecido, de identificação das células transgénicas e tecidos, de preparação para as avaliações fenotípicas e métodos para a recolha e análise de dados. Embora as técnicas de sucesso têm sido aplicados para medir a composição monosaccharide parede celular também 9,11, devido a limitações de espaço, este documento concentra-se em técnicas utilizadas para medir celular e morfologia do tecido e compreender os padrões de expressão de genes em r secundárioems somente. Assim, o protocolo como descrito é ideal para quem procura obter mais insights sobre o papel e / ou expressão de genes ligados ao secundário hastes usando um baixo custo, tecnicamente fácil, e médio e método de alto rendimento.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação de material vegetal
- Antes da experimentação, levantar novas mudas das espécies de árvores preferenciais a partir de sementes ou o corte e crescer árvore / s até que o diâmetro da haste na área destinada para a experimentação é de aproximadamente 1 cm de diâmetro.
Nota: O tempo necessário pode variar devido a, por conseguinte, as taxas de crescimento de plantas permitem que entre três a nove meses para esta etapa.
2. Binário Vector Creation
- Realizar trabalhos a partir desta secção para secção 7 em um laboratório ou estufa onde Agrobacterium pode ser manuseado e que os equipamentos de protecção individual adequados prescritos para o laboratório é usado.
- Preparar um vector binário contendo ou um gene de interesse ou knockdown cassete sobre-expressão e uma cassete do gene repórter β-glucuronidase (GUS) ou um promotor de interesse fundida com um gene de GUS, dependendo do tipo de estudo.
Nota: Há uma série de BAC vector bináriokbones que podem ser obtidos comercialmente ou através de redes de investigação, bem como inúmeras técnicas disponíveis para inserir genes e promotores de interesse em vetores binários. No âmbito deste protocolo é até o experimentador para tomar a decisão sobre como criar um vetor binário. - Transformar vetor binário para uma estirpe desarmada de A. tumefaciens utilizando eletroporação ou calor choque 14 e armazenar adequadamente até que sejam necessários para a experimentação.
- Repita o passo 2.2 para qualquer positiva e / ou controlos negativos.
Nota: Os controlos negativos devem incluir um vetor binário que contém nenhum gene de interesse para um gene de interesse de estudo e uma GUS sem promotor para um promotor de estudo juros. controle positivo para um promotor de estudos interesse deve incluir um mosaico da couve 35s vírus promotor (CaMV35S) fundido a um repórter GUS.
3. Preparação de A. tumefaciens para inoculação
- Pelo menos uma semana antes da experimentation, dê uma pequena quantidade (cerca de 1 ul) de A. tumefaciens preparada durante o passo 2.2 e 2.3 e espalhada pouco em meio LB separado com agar 14 placas contendo antibióticos apropriados para a seleção bacteriana. Crescer a 28 ° C em uma incubadora para formar colónias pequenas e, em seguida, armazenar a 4 ° C até ser necessário.
- 48 horas antes da experimentação, transferir uma colónia de A. Agrobacterium a partir de cada placa em separado, a 50 ml de parafuso superior tubos contendo 5 ml de pré-aquecido (28 ° C) meio LB 14 contendo os antibióticos apropriados para a selecção bacteriana e agitar a 200 rpm num incubador agitador de tapete durante aproximadamente 48 horas a 28 ° C até mistura é muito nebuloso.
- Entre 4-6 horas antes da inoculação de caules de plantas (secção 4) adicionar 1 ml de LB / A. mistura Agrobacterium em um fresco 50 ml parafuso tubo superior contendo 19 ml (diluição de 1:20) de fresco quente (28 ° C) media LB com os antibióticos apropriados paraselecção bacteriano. Se a densidade óptica (DO) a 600 nm (OD 600, tal como medido por espectroscopia) é superior a 0,1, ainda mais dilua com LB quente até que isto é conseguido.
- Coloque diluída LB / A. mistura Agrobacterium para trás no incubador agitador e agitar sob as mesmas condições (200 rpm, 28 ° C) até DO600 está entre 0,4-0,6 e remover.
- Centrífuga LB / A. Agrobacterium mistura durante 15 min a 1000 xg e 4 ° C.
- Decantar o líquido e ressuspender imediatamente A. Agrobacterium pellet em 1 ml de refrigeração meio MS 15, a transferência para 2 ml microtubo e armazenar em gelo até ser necessário para inoculação (secção 4). Esta solução é referida como inoculação mídia.
4. A inoculação de Caule com A. Agrobacterium
- Comece a experimentação durante o final da primavera ou início do verão usando plantas criadas na seção 1 que têm um câmbio ativo e em crescimento rápido. Um bom para um diagnósticocâmbio crescimento activo e rápido é que o floema pode ser facilmente descascada do xilema.
- Encontrar um trecho reto clara do tronco perto da base da planta e remover quaisquer folhas e ramos.
- Usando um bisturi afiado (de preferência, N ° 11) ou a lâmina de barbear, criar de 1 cm 'janela cambial' 2 numa secção de haste clara mediante a introdução de dois incisão vertical paralelo através do floema de 20 mm de comprimento e um 5 milímetros à parte, em seguida, uma corte horizontal que liga os dois cortes verticais na sua extremidade de base.
- Descasque a tira criada pelo floema incisão para cima, expondo o tecido do xilema desenvolvimento e adicionar suficiente Meios de inoculação a partir do passo 3.6 para molhar a superfície do xilema desenvolvimento exposta usando uma pipeta (tipicamente 5-10 ul). recoloque imediatamente a tira floema.
- Vincular a tira floema para o tronco firmemente com Parafilm.
- Repita os passos de 4,2 a 4,5 para todas as janelas do câmbio adicionais para o gene (s) ou promotor (s) de interesse a criação de umNY New cambiais janelas menos 1 cm acima ou abaixo de outras janelas do câmbio e com um 90 ° offset.
- Complete as etapas de 4,2 a 4,5 para os vetores de controlo positivo e negativo (passo 2.4), assegurando que cada vetor é adicionado à mesma raiz de cada planta utilizada no experimento.
- Monitorar o crescimento da haste diâmetro periodicamente e colheita para ensaio de GUS (seção 5), quando o crescimento radial de pelo menos 5 mm foi observado em hastes.
Nota: A quantidade de crescimento radial necessário é dependente da quantidade de tecido necessário para análise a jusante.
5. Colheita por GUS histológica Assay
- Excise a "janela cambial 'a partir do tronco de remover qualquer tecido que não faz parte de um novo crescimento dentro da janela de cambial.
- Para os estudos relativos a amadurecer xilema e morfologia das células / tecidos do floema, descasque o floema do xilema.
- Para os estudos em que a zona cambial é obrigado a permanecer intactas ou os padrões de expressão de promotor são para ser avaliarEd, a fatia de janela cambial transversalmente usando uma lâmina de barbear ou outra lâmina afiada em discos de entre 0,5 e 1 mm de espessura.
- Coloque tecidos janela do câmbio transformados em 14 ml redondos tubos inferiores e lavar duas vezes em tampão de fosfato 0,1 M a pH 7 14. Assegurar que o tecido está completamente submerso, permanece em solução durante pelo menos cinco minutos, e toda a solução em excesso é removido no final do a segunda lavagem.
- Adicionam-se 5 ml de reagente de GUS (mm x-gluc 0,5 (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico), 10 mM de EDTA, 0,5% de Triton X-100 v / v, de potássio 0,5 mM ferricianeto (III), 0,05 mM de ferrocianeto de potássio (II), fez-se o volume final com 0,1 mM de tampão fosfato de pH 7.; ver Hawkins et al 16) para cada tubo. Se o tecido não está completamente submerso, adicione o reagente GUS adicional.
- Incubar os tubos durante 10 min a 55 ° C no escuro.
- Incubar os tubos para uma nova 12-16 horas numa incubadora com agitação a 37 ° C no escuroutilizando agitação suave (entre 30 e 60 rpm) para permitir a mistura.
- Após remoção a partir incubador agitador vá aleatoriamente o pH do reagente de GUS em um pequeno subconjunto dos tubos usando papel de tornassol com uma gama de pH 0-7.
- Se qualquer um dos tubos tem um pH abaixo de 6, em seguida identificá-los. Continue a verificar o restante dos tubos para confirmar o pH e rotular se o pH é de 6 ou abaixo.
Nota: As amostras com um pH inferior a 6 podem não ser adequadas para a análise. Estas amostras devem ser excluídos da análise posterior.
- Se qualquer um dos tubos tem um pH abaixo de 6, em seguida identificá-los. Continue a verificar o restante dos tubos para confirmar o pH e rotular se o pH é de 6 ou abaixo.
- Decantar reagente GUS e substituir com suficiente de etanol a 70% para cobrir o tecido.
- Armazenar a 4 ° C até ser necessário.
6. Identificação de Tecido Transgenic
- Utilizando uma pinça, retire todo o tecido janela cambial de um tubo e coloque na bandeja pequena ou placa de Petri para permitir a visualização microscópica.
- Usando um microscópio de dissecação entre 1X e uma ampliação de 4X, identificar e contar o número de células ou tecidosque têm uma coloração azul brilhante. Azul células ou tecidos manchados são referidos como um sector a partir deste ponto em diante. Tally-los das seguintes maneiras.
- Para amostras onde o floema tem sido removidos (passo 5.1.1), contar o número de sectores em tecido cambial encontrada na superfície do xilema desenvolvimento (sector cambial, Figura 1a).
- Para as amostras que foram cortados em discos (passo 5.1.2), contar os sectores número encontrado nos diferentes tipos de células ou de tecidos (Figura 1b, 1c, 1d). Sectores podem ser encontrados nos seguintes tipos de tecidos: o periderme (sector periderme, Figura 1E), floema (sector floema, Figura 1F), tecido cambial Sector parênquima (sector Cambial, Figura 1g, 1h, 1I), o parênquima de feridas (de feridas, Figura 1-J) e em tilos (sector Tylose, Figura 1k).
- Durante microscópica umaAVALIAÇÃO garantir que ambos os lados de um disco ter sido visto e que setores que ocorrem em dois discos são combinados de modo que os números não são superestimados.
- Coloque sectores somente o tecido contendo de volta para o tubo contendo 70% de etanol e armazenamento até serem necessários.
- Repita o passo 6.1 a 6.3 para quaisquer janelas cambiais adicionais, incluindo o controlo positivo e / ou negativo.
- Calcule a eficiência média de transformação para cada tipo de sector para cada gene ou promotor de interesse e os controles separadamente pela divisão do número total de setores pelo número total de 1 cm 2 janelas cambiais para obter um número médio de eventos de transformação por cm 2 de Cambium inoculadas (ATScm -2).
- Avance para o passo 7.2 e 8 para análise dos padrões de expressão do promotor e do passo 7.1, 7.2 ou 7.3 para técnicas para avaliar celular e morfologia do tecido no tecido cambial.
7. Análise deCelular e Tecidual Morfologia em tecido cambial
Nota: Estes são uma variedade de técnicas que têm sido usadas com êxito para a análise de amostras ISSA derivado.
- Análise da área xilema celular, área de lumen, espessura da parede celular e área de parede celular usando microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Nota: Este protocolo requer preparação da amostra mínima e permite relativamente alta taxa de transferência de análise sectorial relativa às características morfológicas descritas.- A partir desta etapa em diante certifique jaleco, proteção para os olhos e as luvas são utilizadas sempre tecido lenhoso está sendo manuseados e tratados.
- Identificar um sector cambial para análise e fazer uma incisão de aproximadamente 0.5 mm para ambos os lados do mesmo, utilizando uma única lâmina de borda de lâmina para criar um disco (Figura 2a).
- Aparar tecido do xilema excesso deixando aproximadamente, 1 mm de tecido do xilema para o lado tangencial do sector (Figura 2b).
- CuidadoLY cortado transversalmente através do centro do sector usando uma lâmina de barbear de borda dupla fresco (Figura 2c).
- Fazer duas incisões radiais adicionais raso no plano de cada lado transversal do sector para demarcar o tecido transgénico (Figura 2d). Como coloração de GUS não penetram profundamente no tecido acompanhar os ficheiros de células radiais para ambos os lados do tecido manchado encontrada na superfície do câmbio.
- Anexar rosto sector cambial preparado até à fase de um pino de suporte de SEM montagem usando SEM fita condutora (Figura 2e) e manter em dessecador até ser necessário para a visualização SEM.
- Repita os passos 7.1.2 a 7.1.6 para todos os setores adicionais, incluindo os do controle negativo.
- Usando um SEM em um modo de baixo vácuo (energia 5 kV, spot 3,0 nm), visualizar e tirar fotos de células / tecido dentro do sector, bem como a células / tecidos diretamente junto do sector (Figura 2F). A quantidade de ampliaçãoestá dependente das características de interesse. No caso das fibras do xilema, 2,000X é adequado (Figura 2G).
- Uma vez que um sector cambial foi visualizado e fotografias tiradas com uma ampliação apropriado, medir xilema de células / tecidos características morfológicas de interesse usando software de medição de imagem.
- Para a análise estatística, realizar múltiplos pares análises usando testes t pareados para comparar a diferença entre morfológica medida no sector transgênicos e as adjacentes não-transgênico células controle / tecido (medido no espaço de 0,5 mm de borda sector) para cada setor para determinar um p -valor.
- Repita o passo 7.1.10 para o controlo negativo.
- Nos casos em que o controlo positivo mostra um p-valor baixo (α <0,05), calcular a diferença entre o transgénico e adjacente células não transgénicas / tecido para uma característica morfológica. Utilizar esta 'valor de diferença' em um teste t desemparelhado para comparar o efeito do gene de interesse com o negative controlo para determinar um valor de p.
- histoquímica dos padrões de morfologia celular cambial / tecido ou de expressão promotor-tronco células / tecidos utilizando microscopia de luz.
Nota: Apesar de mais demorado, este método permite mais opções de análise, incluindo aspectos da dinâmica do câmbio, por exemplo, largura cambial, bem como padrões de expressão promotor. Além disso, se não for possível aceder a um SEM, este protocolo pode ser utilizado como uma alternativa para o passo 7.1.- Sector especial de consumo de interesse utilizando lâmina de barbear e algum tecido circundante como pequenos blocos (não superior a 1 mm3) e lugar directamente em 1-3 ml de etanol a 100% em um frasco de amostras com tampa de rosca por pelo menos 2 dias a 4 ° C num agitador. Prepara-se o pequeno bloco de uma forma que vai permitir que para a superfície de interesse para ser acedido por um micrótomo.
- Repita o procedimento para todos os setores adicionais, incluindo os do controle negativo.
- Remover o líquido e substituir com 25% de etanol: 75% de mistura de LR branco durante 2 dias, mantendo condições.
- Repita o passo 7.2.3 com 50% de etanol: 50% de brancos LR, 25% de etanol: 75% LR branco e, finalmente, duas vezes, com 100% de brancos LR.
- Coloque pequeno bloco na Incorporação Mold com a superfície de interesse alinhado à extremidade curta e cuidadosamente cobrir com branco LR fresco e polimerização de acordo com as instruções do fabricante.
- Corte de 5 mm seções da superfície de juros sobre um micrótomo rotativo e montar em uma lâmina de vidro. Use coloração safranina O (0,01%) para visualizar parede celular e / ou outras características.
- Adicione meios de montagem, coloque uma lamela e deixar solidificar durante a noite.
- Vista sob um microscópio de luz entre a imagem de captura de 100X e 600X ampliação e.
- Capturar características morfológicas de imagens que usam software de medição de imagem.
- Para a análise estatística de traços morfológicos quantitativos, no seguimento da etapa 7.1.10.
- Para a análise qualitativa de características morfológicas,comparar e descrever padrões observados para o gene ou promotor de interesse e o negativo e / ou controlo positivo.
- Análise de microfibrila Angle (MFA) em Fibras macerado Usando Microscopia de Luz.
- Especial de consumo transgénico xilema tecido directamente a partir de um sector, bem como a partir de tecido não-transgénica adjacente à mesma (dentro de 0,5 mm, A Figura 2 h) e no lugar separadas tubos de 1,5 ml. Repita o procedimento para todos os setores adicionais, incluindo os do controle negativo.
- Complete as etapas 7.3.3 a 7.3.5 em um exaustor.
- Adicionar 250 ul de peróxido de hidrogénio e 250 ul de ácido acético glacial a cada tubo.
- Coloque o tubo num bloco de calor a 90 ° C durante 2 h em hotte.
- Remover o tecido a partir de tubos e cuidadosamente lavar com água destilada pelo menos duas vezes.
- Usando um meio de montagem solúvel em água, montagem de tecido sobre uma lâmina de vidro e provocar uma separação com uma pinça afiada antes de aposição uma lamela.
- Visãosob um microscópio de luz e capturar as imagens das fibras individuais a ampliação superior a 400X.
- Para determinar o ângulo de microfibrilas de fibras, medir o ângulo entre as aberturas de poço e / ou estrias da parede celular e o eixo longo da fibra (Figura 2i) utilizando software de medição da imagem.
- Para a análise estatística, surgem na sequência do passo 7.1.10.
8. Análise de Promotor padrões de expressão
- Análise do promotor de padrões de expressão em tecidos secundária da haste.
- Tally a frequência de cada tipo de sector para o promotor de interesse, bem como os controlos positivos e negativos como observado na etapa 6.2.2.
- Comparar a frequência dos diferentes tipos do setor para o promotor de interesse com o controlo positivo utilizando testes de qui-quadrado para estabelecer valores de p. Uma análise mais aprofundada da especificidade de células / tecidos podem ser realizadas usando o passo 7.2, conforme necessário.
- Se mais do que um promotorde interesse está sendo investigado em seguida, repita esta comparação tomada de análise entre todos os promotores de interesse e do controlo positivo.
- Se sectores ou coloração azul são observadas no controlo negativo, em seguida, adicione à análise ou abandonar dependendo da amplitude ou se coloração endógena é suspeito (ver discussão).
- Análise dos padrões de expressão do promotor Durante Desenvolvimento Derivative Cambial e Diferenciação.
- Usando um microscópio de dissecação, visualizar todos os sectores do câmbio (Figura 1G, 1H, 1i) identificados na etapa 6.2 e determinar a presença / ausência de coloração azul em três tipos de tecidos derivados do câmbio vascular; o floema (P), o desenvolvimento de xilema (X1) ou do tecido do xilema desenvolvido (X2) (ver Figura 3a).
- Como por etapa 8.1.2, comparar a frequência de presença / ausência de coloração GUS nas regiões P, X1 e X2 de promotor de interest com o controlo positivo utilizando testes de qui-quadrado para estabelecer valores de p. Uma análise mais aprofundada da especificidade de células / tecidos podem ser realizadas usando o passo 7.2, conforme necessário.
- Veja os passos 8.1.2.1 e 8.1.2.2 para considerações adicionais.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Usando este protocolo todos os tipos de células estaminais e de tecidos vivos secundárias têm sido mostrados para ser susceptíveis a A. tumefaciens e transformações foram definidos em tipos sector com base no tipo de células inicialmente transformada e que o padrão de crescimento subsequente desenvolvimento. Tipos sector incluem periderme, floema, cambial, parênquima de feridas e tilose (Figura 1b, 1c, 1d) e podem ser encontrado...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo ISSA é um método relativamente simples e eficiente para a criação de tecidos estaminais transgénicas em espécies de árvores, no espaço de alguns meses por análise de genes e promotores de interesse envolvido na madeira e haste formação. Pouco de esforço, além de manter as plantas vivas, é necessária a crescer tecido do caule transgênica após a inoculação, que está em contraste com métodos in vitro em que é necessária extensa cultura de manter tecido ou plantas, onde a produção de madeira pode levar ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro para aspectos do trabalho por meio de Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) e LP0211919 (GB) e parceiros da indústria Sappi e Mondi, bem como Australian Postgraduate Award (EM) do Australian Research Council e Young Innovators and Scientist Award através do Departamento Australiano de Agricultura (LT). Também gostaríamos de agradecer a Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan e Simon Southerton pelas muitas discussões e ideias que apresentaram durante o desenvolvimento deste protocolo e a Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel e Noemie Defaix pela assistência no trabalho relacionado ao laboratório.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Plantas | NA | NA | Consulte os fornecedores locais de viveiros para plantas, conforme necessário |
| Cepa de Agrobacterium | NA | NA | Existem muitos caminhos possíveis para obter cepas de Agrobactrium. Sugerimos que você faça o acompanhamento em sua comunidade de pesquisa local, pois pode haver restrições na obtenção da bactéria em seu país e região. |
| Vetor binário (gene e promotor) | NA | NA | Desenvolvemos uma gama de vetores para atender ao protocolo ISSA usando um sistema Gateway Recombinase. Isso inclui superexpressão, nocautes de RNAi e vetores de fusão de promotores baseados em vetores pCAMBIA modificados e felizes em fornecer conforme necessário. Além disso, existem muitos vetores disponíveis para a comunidade de pesquisa. |
| Mídia LB | Sigma | L3022 | O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa |
| Mídia LB com ágar | Sigma | L2897 | Um produto semelhante pode ser obtido de outra empresa |
| Antibióticos | Sigma | NA | O número de catálogo dependerá do antibiótico que você precisa, pois uma variedade de antibióticos é usada para seleção bacteriana em vetores binários. Este produto pode ser proveniente de um gama de empresas |
| 50 ml Tubos com tampa de rosca | Fisher Scientific | 14-432-22 | O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa |
| MS Media | Sigma | M9274 | O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa |
| Lâmina de bisturi nº 11 | Sigma | S2771 | O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | Este é o melhor produto para usar para ligar a criação do poste da janela cambial |
| Tubos de fundo redondo de 14 ml | Thermo Scientific | 150268 | O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa |
| EDTA | Sigma | E6758 | O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa |
| Triton | Sigma | X100 | O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa |
| X-Gluc | X-GLUC direto | Você precisará ir ao site para fazer o pedido - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Ferricianeto de Potássio (III) | Sigma | 244023 | O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa |
| Ferrocianeto de Potássio (II) | Sigma | P9387 | O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa |
| Papel de tornassol | Sigma | WHA10360300 | O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa |
| Lâmina de barbear de borda única | ProSciTech | L055 | O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa |
| Lâmina de barbear de borda dupla | ProSciTech | L056 | O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | O mesmo produto pode ser proveniente de outra empresa |
| Frasco de amostra com tampa de rosca | ProSciTech | L6204 | O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa |
| Etanol | sigma | E7023 | O mesmo produto pode ser proveniente de outra empresa |
| LR branco | ProSciTech | C025 | O mesmo produto pode ser proveniente de outra empresa |
| Molde de Incorporação | ProSciTech | RL090 | Recomendamos esta variedade, no entanto, há muitas opções disponíveis |
| Água Mídia de montagem Soulable | ProSciTech | IA019 | Um exemplo de mídia de montagem que poderia ser usada, no entanto, existem outras opções e podem ser exploradas. |
| Peróxido de hidrogênio | Sigma | 216763 | Um produto semelhante pode ser adquirido de outra empresa |
| Ácido acético glacial | Sigma | A9967 | Um produto semelhante pode ser adquirido de outra empresa |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | Um produto semelhante pode ser adquirido de outra empresa |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | Este é o instrumento usado em parte deste estudo, mas qualquer outro SEM que tenha um modo de baixo vácuo pode ser utilizado, | |
| imagem ImageJ | pode ser obtido no seguinte URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Referências
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
