Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Emily J. Sharpe; Joshua R. St. Clair; Catherine Proenza

doi:10.3791/54555

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Artigo de método

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

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DOI:

10.3791/54555

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23 de outubro de 2016

Emily J. Sharpe^*¹ , Joshua R. St. Clair^*¹^,² , Catherine Proenza¹^,³

¹Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, ²Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, ³Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Métodos são demonstradas para o isolamento de miócitos do nó sinoatrial (SAM) a partir de ratinhos adultos por patch-clamp electrofisiologia ou imagiologia estudos. As células isoladas podem ser utilizadas directamente ou podem ser mantidas em cultura que permita a expressão de proteínas de interesse, tais como repórteres geneticamente codificados.

Resumo

miócitos nó sinusal (SAMs) atuam como os pacemakers naturais do coração, iniciando cada coração bater através da geração de potenciais de ação espontâneos (APs). Estes APs marcapasso refletem a atividade coordenada de numerosas correntes de membrana e ciclismo de cálcio intracelular. No entanto, os mecanismos precisos que impulsionam a atividade pacemaker espontânea em SAMs ainda imperceptíveis. Agudamente SAMs isolados são uma preparação essencial para experimentos para dissecar a base molecular da pacemaking cardíaca. No entanto, a anatomia indistinta, microdissection complexa, e as condições de digestão enzimática mimado ter evitado o uso difundido de forma aguda isolada SAMs. Além disso, os métodos não estavam disponíveis até recentemente para permitir a cultura de longo prazo de SAM para estudos de expressão proteica. Aqui nós fornecemos um passo-a-passo do protocolo e demonstração de vídeo para o isolamento de SAM a partir de ratinhos adultos. Um método também é demonstrada pela manutenção do rato adulto SAM in vitro e para Expressino de proteínas exógenas via infecção por adenovírus. Agudamente isolados e cultivados SAM preparados através destes métodos são adequados para uma variedade de estudos electrofisiológicos e de imagem.

Introdução

miócitos marcapasso no nó sinusal do coração (miócitos sinoatrial, "SAMs") geram, potenciais espontâneos rítmicas ação (APs) que se propagam através do miocárdio para iniciar a cada batimento cardíaco. Experiências utilizando SAM agudamente isolados a partir de muitas espécies têm sido essenciais para a elucidação dos mecanismos que contribuem para a geração da actividade de pacemaker. SAMs são cardiomiócitos altamente especializados que diferem substancialmente dos seus homólogos na atrial e ventricular miocárdio em termos de morfologia, função e expressão da proteína. A marca da APs espontâneos em SAMs é uma despolarização espontânea durante a diástole que impulsio....