O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Resumo

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

Resumo

A marca da imunidade humoral é gerar ASC funcionais, que sintetizam e segregam Abs específica para um antigénio (Ag), tal como um agente patogénico, e são usados ​​para a defesa do hospedeiro. Para a determinação quantitativa do estado funcional da resposta imune humoral de um indivíduo, tanto Abs circulantes no soro e ASC são geralmente medidos como leituras funcionais. Nos seres humanos, o sangue periférico é a amostra mais conveniente e facilmente acessível e que pode ser utilizado para a determinação da resposta imune humoral induzida por células hospedeiras B. subconjuntos distintos de células B, incluindo ASC, podem ser isolados directamente a partir de sangue periférico por meio de selecção com micropérolas Ab-conjugados específicos de linhagem ou através de separação de células com citometria de fluxo. Além disso, as células B naive e de memória purificados podem ser activadas e diferenciadas em cultura em ASC. As actividades funcionais de ASC para contribuir para a secreção de Ab pode ser quantificada por ELISpot, que é um ensaio de enzima que convergeensaio -Conectado imunoabsorvência (ELISA) e tecnologias de transferência Western para permitir a enumeração de ASC individuais no nível de uma única célula. Na prática, o ensaio ELISpot tem sido cada vez mais utilizadas para avaliar a eficácia da vacina por causa da facilidade de manuseamento de um grande número de amostras de sangue. Os métodos de isolamento de células B humanas a partir de sangue periférico, a diferenciação de células B em ASC in vitro, e o emprego de ELISpot para a quantificação de um total de IgM e IgG-ASC serão descritos aqui.

Introdução

As células B desempenham um papel central no desenvolvimento da imunidade humoral. Eles inicialmente se desenvolvem na medula óssea e entram na corrente sanguínea como células naive B, que podem migrar para os tecidos linfóides, tais como o baço, nódulos linfáticos, amígdalas, e para um maior desenvolvimento. Após a Ag encontro, algumas células B naïve migrar para folículos linfóides, onde as células de centro germinal B podem se diferenciar em células B de memória e plasmablasts (PBS) / células plasmáticas (PCs). Enquanto a maioria dos computadores PBS / egressos para a corrente sanguínea, alguns, eventualmente, residem na medula óssea a sofrer diferenciação termina....

Protocolo

sangue periférico humano deve ser obtido a partir de dadores saudáveis ​​sob consentimento informado, bem como a utilização de amostras de sangue devem estar em conformidade com as orientações aprovadas estabelecidas por conselhos de revisão institucionais individuais. Neste estudo, o protocolo de usar sangue humano em uma demonstração dos resultados de citometria de fluxo (Figura 1) e ensaios ELISPOT (Figura 3) foi aprovado pelo Conselho de Revisão Interna do National Taiwan University Hospital (número de protocolo 201307019RINB).

1. Isolamento e purificação de células B de sangue periférico humano

1. Desenhar ~ 10 m....

Resultados

PBMCs foram depletados de glóbulos vermelhos e células aderentes (passos 1.2 a 1.7). Uma alíquota (2 X 10 ⁶⁾ de células foram submetidos a uma análise por citometria de fluxo para ilustrar as populações de células B naive, as células B de memória, e PBS / PCs no sangue periférico (Figura 1). Em PBMCs de dadores este, cerca de 10% dos linfócitos foram células B CD19 ^+. No compartimento de células B, a percentagem de CD19 ⁺ CD27 ^-

Discussão

Isolamento e Purificação de Células de Sangue Periférico Humano B

Normalmente, os glóbulos vermelhos podem ser eficientemente rompido e afastada pelo tampão de lise (passo 1.2). É importante que não se incubar PBMCs com o tampão de lise dos glóbulos vermelhos mais do que 5 minutos, como a viabilidade das células pode ser afectada pelo cloreto de amónio. Alternativamente, os glóbulos vermelhos e as plaquetas podem ser removidos simultaneamente por o protocolo seguinte.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	tubo de 10 mL
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	solução livre de endotoxinas
Trypan blue 0,5%	Biological Industries	03-102-1B
Conjunto de enriquecimento de linfócitos B humanos IMag	BD Biosciences	558007
Biotinilated CD27 mAb	Biolegend	302804	clone O323
Microesferas magnéticas de estreptavidina	BD Biosciences 9000810
15 mL Tubos Falcon	Falcon	352196
Filtro de células de malha de nylon azul, 40 μ m	BD Falcon	352340
Anti-humano CD19-APC	Biolegend	302212	clone HIB19
Anti-humano CD27-eFluor 450 eBioscience		48-0279-42	clone O323
Anti-humano CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	clone HIT2
Anti-humano CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	clone HIT2
Anti-humano CD45-FITC	Biolegend	304006	clone HI30
Anti-humano CD45-FITC	BD Biosciences	555482	clone HI30
Anti-camundongo/rato/humano CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	clone LG.3A10
Anti-humano CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	clone L128
Anti-humano CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	clone LT19
Anti-humano CD19-FITC	GeneTex	clone GTX75599	LT19
Anti-humano CD20-FITC	BD Biosciences	555622	clone 2H7
biotinilado anti-humano CD27	Biolegend	clone 302804	O323
biotinilado anti-humano CD27	eBioscience	13-0279-80	clone O323
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	tipo B CpG
IL-2 humana recombinante	PeproTech	200-02
IL-10 humana recombinante	PeproTech	200-10
IL-21 humana recombinante	PeproTech	200-21
recombinante de
S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitogen (PWM)	Placas de filtro Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen, 0.45 µ tamanho dos poros m	Merck Millipore	MSIPS4510	placa filtrante transparente de 96 poços com membrana PVDF hidrofóbica
Solução BCIP/NBT	Reagente único Sigma-Aldrich	B6404
BCIP/NBT, substrato de fosfatase alcalina	Merck Millipore	ES006
IgG humana	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
IgG humana, fragmento Fc	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F(ab')2 fragmento de Ig anti-humano de cabra (IgG + IgM + IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
IgG-fosfatase alcalina anti-humana de cabra, Fcγ específico do fragmento	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Fosfatase alcalina IgM-humana de cabra, Fcµ específico do fragmento	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
IgG-peroxidase anti-humana de cabra, Fcγ específico do fragmento	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
IgM-peroxidase anti-humana de cabra, Fcµ específico do fragmento	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
Kit de substrato BD ELISPOT AEC BD	Biosciences	551951
C.T.L. Analisador ImmunoSpot	C.T.L.

BD Proteína A humana