O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

As células B desempenham um papel central no desenvolvimento da imunidade humoral. Eles inicialmente se desenvolvem na medula óssea e entram na corrente sanguínea como células naive B, que podem migrar para os tecidos linfóides, tais como o baço, nódulos linfáticos, amígdalas, e para um maior desenvolvimento. Após a Ag encontro, algumas células B naïve migrar para folículos linfóides, onde as células de centro germinal B podem se diferenciar em células B de memória e plasmablasts (PBS) / células plasmáticas (PCs). Enquanto a maioria dos computadores PBS / egressos para a corrente sanguínea, alguns, eventualmente, residem na medula óssea a sofrer diferenciação terminal em PCs ¹ de vida longa. As células B em circulação são heterogêneos, e no estado estacionário, PBS / PCs são raros no sangue periférico ^2. Como resultado da disponibilidade de marcadores de superfície específicos da linhagem, citometria de fluxo tornou-se um método popular para a identificação e caracterização das subpopulações de células B no sangue periférico. Uma aplicação alargada dos cytometr fluxoy é a adição de uma função de separação de células, que permite a separação e isolamento de subconjuntos individuais de células B com elevada pureza. Com base na expressão de receptores de superfície específicos em diferentes fases de desenvolvimento, as células B circulantes humanos são geralmente classificados em três subpopulações principais: células B virgens (CD19 ⁺ CD27 ^- CD38 ^-), células B de memória (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), e PBS / PCS (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figura 1). células B virgens, por natureza, não encontrei Ags. No entanto, eles podem ser diferenciadas em células CD27 ⁺ IgM ⁺ B de memória. Embora as células B virgens são homogêneos em expressar receptor do antigénio das células B (BCR) moléculas -associated (por exemplo, CD19, CD20 e CD22) eles são heterogêneos em seu repertório imunoglobulina ^5. A maioria das células CD27 ⁺ B de memória podem ser diferenciados em CD27+ / CD38 ⁺ oi PBS / PCs ^6. Além disso, as células B de memória e PBS / PCs são policlonais e exibem desenvolvimento e funcionais heterogeneidade ^4-7. PBS / PCs em circulação são normalmente de curta duração e não expressam CD138, mas aqueles feitos para se estabelecer na medula óssea irá terminal diferenciar e se tornar longa duração. Terminalmente PCs diferenciadas expressam CD138 e para baixo-regular moléculas CD27 em suas superfícies ^8. Uma vez que tanto PBS e PCs são capazes de secretar Abs, em muitas ocasiões, eles são colectivamente denotado como ASC. Em contraste, nem as células B naive nem células B de memória pode produzir quantidades apreciáveis de Abs ^9-10. No entanto, quando isolados, tanto em células B naive e de memória podem ser diferenciadas em ASC em 3 - 10 dias, quando colocado em condições de cultura adequadas ^{6, 11-15.} Na verdade, ASC derivado in vitro compartilhar diferenciação expressões superficiais semelhantes de CD27 e CD38 com os fr diretamente isoladosangue periférico om ^6. Além disso, as ASC diferenciadas in vitro expressam um baixo nível de superfície CD20, semelhante que circula de PBS / PCs ^6. Embora as ASC derivado de cultura são todos de curta duração, podem secretar Abs, indicando que eles são funcionalmente competentes e capazes de contribuir para a imunidade humoral.

Ambos ELISA e ELISpot são, de longe, os métodos mais geralmente aplicado com o qual para obter informação funcional sobre a resposta imunológica humoral. ELISA é um ensaio baseado em placa de 96 poços, e é frequentemente utilizado para medir os títulos de soro Abs Ag-specific e outros analitos (por exemplo, citocinas). É conveniente e escalável. ELISA foi concebido para utilizar um ensaio de enzima de fase sólida para detectar a presença de ABS ou de outras substâncias, tais como soro, numa amostra ^de líquido ^16. As leituras de ELISA no soro têm sido amplamente utilizados para representar a resposta imune do corpo. Uma ferramenta necessária para a aquisição de readouts de ensaios de ELISA é um leitor de microplacas espectrofotométrico. O leitor pode determinar a densidade óptica (DO) dos produtos finais normalmente resultantes da reacção de peroxidase de rábano (HRP) Abs detecção -conjugated e seus substratos específicos ^17. No que diz respeito a informações sobre a resposta imunológica humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA representam a colectiva, mas não indivíduo, o desempenho de ASC no corpo. Em adição, a ELISA não tem em conta a participação de células B de memória, que não secretam Abs.

Tal como ELISA, ELISpot é um método amplamente utilizado para a detecção e monitorização da resposta imunitária em amostras de sangue periférico ^17-18. ELISpot é uma técnica relacionada com um ELISA de tipo sanduíche. Nele, as células são colocadas dentro do difluoreto de polivinilideno (PVDF) poços apoiados por uma membrana de microplacas de 96 poços para uma cultura de curto prazo. O ensaio ELISpot é análoga à execução de uma transferência de Western em microplacas e developing as manchas na membrana de PVDF em cada poço. Um sistema de leitor de ELISpot automatizado ou um estereomicroscópio para contagem manual é necessária. A principal vantagem de ELISpot na detecção de uma resposta imunitária é a sua excelente sensibilidade na quantificação da ASC e células secretoras de citocinas. Ela reporta as suas actividades funcionais na imunidade humoral e celular, respectivamente. Na medição da função imune humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA e o número de ASC enumerados por ELISPOT são frequentemente correlacionados, mas as leituras de dados a partir destes dois ensaios têm algumas diferenças em implicações funcionais ^19-20. A principal vantagem de ELISpot é a sua sensibilidade do método. O nível dos títulos de soro AB como relatado por ELISA apresenta-se semi-quantitativamente, como leituras de DO, que denota o nível de Ab relativa, ou mais quantitativamente, como leituras de concentração quando uma quantidade conhecida dos isotipos apropriados de Abs é incluída para referência. Em contraste, os resultados de ELISpot são Presented como o número absoluto de ASC em uma associação de células de interesse (por exemplo, células não fraccionadas mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células B purificadas a partir de PBMCs). ELISpot pode detectar um único ASC, mas ELISA requer quantidades ab a partir da ASC para atingir concentrações dependente de ensaio optimizadas antes da medição. Assim, é obviamente superior ELISpot para ELISA na sensibilidade da quantificação. Além disso, também ELISpot é adequada para a quantificação dos ASC diferenciadas in vitro a partir de células B de memória activadas. células B de memória não secretam Abs, mas podem se diferenciar em ASC sobre a ativação; Eles, portanto, não tem nenhuma contribuição para Abs de soro detectados por ELISA. Assim, ELISpot é o método de escolha para a medição da resposta imune de células de memória B em circulação após a activação em cultura. Ele permite o acompanhamento da manutenção da imunidade humoral a longo prazo.

sangue periférico humano deve ser obtido a partir de dadores saudáveis ​​sob consentimento informado, bem como a utilização de amostras de sangue devem estar em conformidade com as orientações aprovadas estabelecidas por conselhos de revisão institucionais individuais. Neste estudo, o protocolo de usar sangue humano em uma demonstração dos resultados de citometria de fluxo (Figura 1) e ensaios ELISPOT (Figura 3) foi aprovado pelo Conselho de Revisão Interna do National Taiwan University Hospital (número de protocolo 201307019RINB).

1. Isolamento e purificação de células B de sangue periférico humano

1. Desenhar ~ 10 mL de sangue a partir da veia cubital mediana (no anterior fossa cubital ao cotovelo) para um tubo de 15 ml, contendo K ₂ EDTA (1,5 a 2,0 mg / mL de sangue) e inverter imediatamente o tubo várias vezes para evitar coágulos formação.
2. Adicionar 35 mL de autoclavada (121 ° C, 15 min) de glóbulos vermelhos (RBC) de tampão de lise (150 mM de _NH4Cl, 10 mM de _KHCO3, e EDTA 1 mM; pH 7,4) ao tubo que contém a amostra de sangue fresco (≥ 3: 1 v / v) e incuba-se à temperatura ambiente (TA) durante não mais do que 5 minutos.
   NOTA: O aparecimento de transmissão de luz através do tubo indica a conclusão de lise de RBC.
3. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Certifique-se de que o sedimento é de cor branca.
4. Ressuspender o sedimento com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na ₂ HPO _4, e 1,47 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,4) e centrifuga-se tal como no passo 1.3.
5. Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com 10 ml de meio RPMI 1640 (suplementos: 10% de soro fetal de vitelo, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 0,25 mg / mL de anfotericina B, e 2 mM de L-glutamina), e, em seguida, a chapa células em uma placa de cultura de 10 cm (10 ml de sangue por prato). Colocar a cápsula num incubador a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 30 min.
6. Agite suavemente o prato de cultura algumas vezes e colocar omeio de cultura (células de suspensão) em 15 mL tubos cónicos de plástico. Descartar as células aderentes (principalmente macrófagos) nas placas de cultura.
7. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante.
8. Ressuspender o sedimento com 1 ml de meio RPMI 1640. Contar o número de células com um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
   NOTA: A viabilidade de leucócitos isolados é normalmente superior a 90% por exclusão com azul de tripano.
9. Centrifugar como no passo 1.7 e ressuspender as células em ~ 200 uL de tampão de PBS frio (0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA) a uma concentração de 5-10 x 10 ⁶ células / ml.
10. Adicionar 5 mL de cocktail de anticorpo anti-humano biotinilado específico para as células do sangue (para a selecção negativa das células B) por 10 ⁶ células e incubar em gelo durante 30 min ^21.
    NOTA: O cocktail Ab anti-humana deve incluir, pelo menos Abs específico para CD2 (ou CD3), CD14 e CD16.
11. Adicionar um excesso de volume de 10 vezesde PBS estéril para as células, centrifugar a 600 xg durante 5 min, e desprezar o sobrenadante.
12. Adicionar quantidades iguais de microesferas de estreptavidina conjugada (5 mL por 10 ⁶ células) para o pellet e misture bem.
13. Incubar em gelo durante 30 min num tubo cónico de 15 mL, em plástico.
14. Adicionar 2 ml de tampão PBS para dentro do tubo.
15. Colocar o tubo em um suporte magnético e incubar à temperatura ambiente durante 8 min. As micropérolas Brown vai anexar gradualmente para a parede do tubo ao lado do íman ^22.
16. Com o tubo restante no suporte magnético, transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo estéril de 15-mL ^22.
17. Repita os passos de 1,14-1,16, e combinar os dois sobrenadantes que contêm as células B intactas. Descartar as microesferas.
18. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante.
19. Ressuspender o sedimento em meio RPMI 1640 para experiências a jusante.
    NOTA: Normalmente, 1 - 5 x 10 ⁵ células B witha pureza superior a 95% a partir de 10 ml de sangue periférico pode ser isolado ^23.

2. purificação e separação de Memória e Naïve B As células a partir de células B isoladas

1. Use células purificadas a partir do passo 1 e determinar o número de células utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automático.
2. Ressuspender as células em 100 ul de tampão PBS frio depois da centrifugação a 600 xg e TA durante 5 min.
3. Adicionar 1 - 2 ug de mAb CD27 biotinilado por 10 ⁶ células e incubar em gelo durante 30 min.
4. Adicionar 10 ml de tampão PBS ao tubo e centrifugar a 600 xg durante 5 min.
5. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 50 ul de tampão PBS.
6. Adicionar a mesma quantidade de microesferas magnéticas de estreptavidina (1 - / 10 ⁶ células 2 ug) às células num tubo cónico de plástico de 15 ml.
7. Com cuidado, misturar bem e incubar em gelo durante 30 min.
8. Adicionar 2 - 3 ml de tampão PBS ao tubo.
9. Coloque otubo num suporte magnético e incubar à temperatura ambiente durante 8 min para permitir que as microesferas castanhos para anexar ao lado mais próximo do íman.
10. Com o tubo no suporte magnético, transferir cuidadosamente a fracção de sobrenadante para um novo tubo de ensaio estéril. Esta fracção contém a CD27 enriquecido ^- células B virgens.
11. Adicionam-se 5 ml para o tubo contendo as micro-esferas e suavemente ressuspender as microesferas (isto é, a fracção enriquecida de células CD27 ⁺ de memória B) ^24-25.
12. Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Ressuspender as peletes com meio RPMI 1640 para os experimentos a jusante.
    NOTA: Tipicamente, ~ 30 - 60% de células B podem ser purificadas como células de memória CD27 ⁺ a partir das PBMC de um dador saudável ^{7, 25-26.}

3. células de classificação para a coleta de células Naïve B, células B de memória, e PBS / PCs

1. Usando as células purificadas a partir do passo 1, determinar o número de células utilizando um hemocytometer ou um contador de células automático.
2. Ressuspender as células em tampão de PBS frio a uma concentração de 10 ⁷ por ml num tubo de polistireno de 5 ml.
3. Adicionar 1 - 2 ug de IgG humana por 10 ⁶ células e incubar em gelo durante 10 min para o bloco de Fc.
4. Adicionar 1 ug de cada anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323), e anti-CD38-PE (clone: HIT2) por 10 ⁶ células; misturar bem e incubar em gelo durante 30 min ^{4, 27.}
5. Na última 5 min na etapa 3.4, adicionar 5 mL do 7-D aminoactinomycin comercial (7-AAD).
6. Adicionar 2 ml de PBS ao tubo, vórtice, e centrifugar a 600 xg durante 5 min.
7. Ressuspender as células em tampão de triagem (PBS estéril com 2% de BSA e EDTA a 2 mM) a uma concentração de 1 - 5 x 10 ⁷ células por ml num tubo de 15 mL.
8. Filtrar as células através de um filtro de células de malha de nylon (40 um de tamanho de poro) para eliminar aglomerados de células.
9. Separaram-se as células com uma citometria de fluxo tipoer equipado com três lasers: violeta (405 nm), azul (488 nm) e vermelha (640 nm).
   NOTA: O laser azul por si só é suficiente para 3 cores citometria de fluxo ^27-28.
10. Ordenar as células em três tubos de 15 ml (contendo 5 mL de meio RPMI) para a recolha simultânea de células B virgens (CD19 ⁺ CD27 ^-), células B de memória (CD19 ⁺ CD27 ^+), e PBS / PCS (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / oi} CD38 ^{+) 3-4, 28.}
    NOTA: Ordenar as células B naive e de memória podem ser cultivadas tal como descrito no passo 4.

4. Na diferenciação in vitro de células isoladas CD19 Humano ⁺ B, CD19 ⁺ CD27 ⁺ células B de memória, e CD19 ⁺ CD27 ^- células naive B

1. Usando as células purificadas nos passos 1.19, 2.10, 2.11 e 3.10, determinar o número de células com um hemocitómetro ou um contador de células automático.
2. Ressuspender as células com meio RPMI 1640a uma concentração de 1 - 10 x 10 ⁵ por ml e aliquotar-los para os poços de uma placa de 12 poços.
3. Adicionar CpG (ODN 2006) a 5 ug / 10 ⁶ células / ml ^{18, 29.}
4. Cultura das células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 5 dias.
5. Colher as células de cada poço, colocá-los separadamente em tubos de 15 ml, adicionar 5 mL de PBS a cada tubo e centrifugar-los a 600 xg e RT durante 5 min.
6. Contar as células usando um hemocitômetro ou um contador de células automático. Ressuspender as células a uma concentração de 1 - 10 x 10 ⁵ por ml com meio RPMI 1640.

5. ELISpot Assay

1. Adicionar 30 uL de 35% de etanol em água destilada a cada poço das placas ELISpot durante 30 s.
   NOTA: Quando pipetagem, evitando tocar na membrana nas cavidades em todos os momentos.
2. Inverter as placas ELISpot para remover o etanol.
3. Colocar 150 mL de DDH autoclavados ₂ O em cada poço e incubar-los à temperatura ambiente durante 5 minutos para lavar o etanol residual; seguir com uma lavagem de PBS estéril à temperatura ambiente durante 3 min.
   NOTA: As etapas 5.1 a 5.3 pode ser opcional, dependendo do fabrico das placas.
4. Coloque 50 uL de 5 ug / mL de anticorpo policlonal de F (ab ') ₂ de anti-Ig humana (IgG + IgM + IgA) (em PBS) a cada poço das placas ELISpot e incubar a 4 ° C durante a noite (preferida) ou 37 ° C durante 2 h ^11.
   NOTA: Selar as bordas de placas com parafilme até à sua utilização.
5. Inverter as placas para remover Abs não ligado, adicionar 200 ul de PBS a cada poço e incubar duas vezes à temperatura ambiente durante 3 min de cada vez.
6. Adicionar 200? L de PBS com BSA a 5% (ou meio RPMI 1640) a cada poço para bloquear, e incubar à TA durante 2 h.
7. Inverter as placas para remover o tampão de bloqueio. Lavar cada poço duas vezes com 200 ul de PBS, tal como no passo 5.5.
8. Adicionar 100 uL de meio RPMI 1640 a cada poço e incubar a 37 ° C.
9. Quando estiver pronto para semear as células, inverter as placas para remover o meio RPMI 1640.
10. Semente de 100 uL (5 x 10 ^4), 50 mL (2,5 x 10 ^4), e 25 uL (1,25 x 10 ⁴⁾ das células (de passos 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, e 4.6) para os poços de uma placa ELISpot. Com meio RPMI 1640, perfazer o volume de 150 uL / ​​poço.
    NOTA: Um mínimo de uma ou duas diluições em série de 2 vezes para plaqueamento das células é recomendada.
11. Incubar as placas em uma incubadora a 37 ° C com _CO2 a 5% durante 8-14 h ^18. Evitar mover as placas durante a incubação.
12. Inverter as placas para remover as células e meio RPMI 1640.
13. Adicionar 200? L / cavidade de PBS-T (PBS com Tween 20 a 0,05%) e incuba-se-lhes 5 vezes à TA, cada vez durante 3 minutos. Inverta a placa para remover o tampão de lavagem entre cada um dos 5 lavagens.
14. Adicionar quer fosfatase alcalina de IgG de cabra-anti-humano (AP), Abs Fcy-específico (para a detecção de IgG, 1: 5000 em PBS-T) Ou de cabra anti-IgM humana-AP, Fcμ Abs específicos do fragmento (para a detecção de IgM, 1: 5000 em PBS-T) nas cavidades designadas e incubar à TA durante 2 h, no escuro.
15. Lavar cada poço duas vezes com 200 ul de PBS, tal como no passo 5.5.
16. Adicionar 50 / poço de solução de substrato de fosfato uL bromochloroindolyl-nitro azul de tetrazólio (BCIP / NBT). manchas de cor roxa normalmente aparecem em 5-15 min.
17. Adicionar 100 uL / poço de _ddH2O para evitar o sobre-revelação de manchas.
18. Lavar as placas com água corrente da torneira após o desenvolvimento completo de todos os pontos.
19. Remover o underdrain das placas e permitir-lhes secar ao ar, no escuro.
20. Contar as manchas utilizando um leitor automático de placas com um aparelho de imagem aquisição / análise (por exemplo, um scanner automático ou manualmente por meio de um microscópio de dissecção).
    NOTA: As placas podem ser armazenadas à temperatura ambiente no escuro e analisadas mais tarde.

PBMCs foram depletados de glóbulos vermelhos e células aderentes (passos 1.2 a 1.7). Uma alíquota (2 X 10 6) de células foram submetidos a uma análise por citometria de fluxo para ilustrar as populações de células B naive, as células B de memória, e PBS / PCs no sangue periférico (Figura 1). Em PBMCs de dadores este, cerca de 10% dos linfócitos foram células B CD19 +. No compartimento de células B, a percentagem de CD19 + CD27 - células B virgens foi de cerca de 50%. Por outro lado, cerca de 50% das células B CD19 + CD27 + foram células B de memória 7, 25-26. Digno de nota, as células CD27 + B de memória podem ainda ser separados com a inclusão de IgD 4. O fenótipo de circulação de OP pode ser melhor definido com expressão baixa ou nenhuma superfície de CD20 (CD19 + CD27 + / oi CD38 + CD20 lo / -) 2, 30-31. Para excluir as células mortas, a 7-AADpodem ser incluídas na coloração de células (passo 3.5), e uma trama para o FSC versus 7-AAD permite modular a população de células vivas (7-AAD -).

As principais etapas do ensaio ELISpot estão representados na Figura 2. Tanto as células B humanas purificadas e células B de memória CD19 + CD27 + foram cultivadas na presença de CpG com meio RPMI 1640 durante 5 dias. As células foram colhidas para o ensaio ELISpot para quantificar as ASC recentemente emergiram. Se estiver presente, o pré-existente OPs isolado a partir do sangue periférico irão morrer em 48 h 11. O ensaio ELISpot foi realizada, e as imagens adquiridas no local por um scanner automático de placa são demonstradas na Figura 3. Os resultados de ELISpot tipicamente irá mostrar 50 - 200 IgM-ASC de 10 4 células B tratados com CpG, durante 5 dias, ao passo que o número de IgG-ASC é 10 - 50 na 10 4 11 células.

Figura 2. Ilustrações dos principais passos do ELISpot de Ensaio. (A) Colocar 50 uL / poço (5 ug / ml) de F (ab ') 2 de anti-Ig humana (IgG + IgM + IgA) em uma placa de ELISpot durante 2 h a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C (preferido) (passo 5.4). Semear as células nos poços da placa de ELISPOT. Permitir que as ASC para anexar à membrana PVDF e para secretar Abs para 8 - 14 h (passo 5.11). (B) Lavar as células com PBS (com 0,05% de Tween 20). (C) Adicione o AP- ou HRP-conjdetecção ugated Abs específico para IgG ou IgM. (D) Lavar o Abs de detecção que sejam liberados. (E) Desenvolver as manchas com uma solução de substrato de AP ou HRP para coincidir com o Abs detecção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Resultados de ELISpot de uma placa representativas. (A) células purificada B CD19 + foram colocados em três poços adjacentes (50.000 células no poço # 1, 25.000 células no poço # 2, e 12.500 células no poço # 3, respectivamente) da placa de ELISPOT. As células foram então cultivadas em meio RPMI 1640 durante a noite (~ 14 h). O ensaio ELISpot foi realizada depois de completar a cultura (passos 5,12-5,18). para analyze os resultados, a placa ELISpot foi digitalizada para adquirir imagens através de um analisador automático equipado com o scanner e software. Células de memória (B) purificada CD19 + CD27 + (10 6 / ml) foram cultivadas na presença de 5 ug / mL de CpG, durante 5 dias. As células foram tratadas como em (A) para o ensaio de ELISPOT. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O autor declara não haver interesses financeiros concorrentes.