o Drosophila Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Resumo

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

Resumo

Drosophila melanogaster emergiu como um poderoso sistema experimental para estudos funcionais e mecanicistas do desenvolvimento e progressão do tumor no contexto de um organismo inteiro. Técnicas sofisticadas para gerar mosaicos genéticos facilitam a indução de clones geneticamente definidos e visualmente marcados, cercados por tecido normal. Os clones podem ser analisados através de diversas abordagens moleculares, celulares e ômicas. Este estudo descreve como gerar tumores clonais marcados com fluorescência de malignidade variável nos discos imaginais oculares/antenais (EAD) de larvas de Drosophila usando a técnica de Análise de Mosaico com Marcador de Células Repressíveis (MARCM). Ele descreve procedimentos como recuperar o mosaico EAD e o cérebro das larvas e como processá-los para imagens simultâneas de repórteres transgênicos fluorescentes e coloração de anticorpos. Para facilitar a caracterização molecular do tecido em mosaico, descrevemos um protocolo para isolamento de RNA total do EAD. O procedimento de dissecção é adequado para recuperar EAD e cérebros de qualquer estágio larval. O protocolo de fixação e coloração para discos imaginários funciona com vários repórteres transgênicos e anticorpos que reconhecem proteínas de Drosophila. O protocolo de isolamento de RNA pode ser aplicado a vários órgãos larvais, larvas inteiras e moscas adultas. O RNA total pode ser usado para traçar o perfil de alterações na expressão gênica usando abordagens candidatas ou de todo o genoma. Por fim, detalhamos um método para quantificar a invasividade dos tumores clonais. Embora esse método tenha uso limitado, seu conceito subjacente é amplamente aplicável a outros estudos quantitativos em que o viés cognitivo deve ser evitado.

Introdução

Cancer representa um dos grupo mais geneticamente heterogêneo de doenças, cuja incidência e mortalidade está aumentando dramaticamente, especialmente entre os idosos em todo o mundo. Cancer origem clonal de uma célula de iniciação tumor que escapa mecanismos supressores tumorais inerente e divide fora de controle. A acumulação gradual de lesões genéticas que cooperativamente promover o crescimento, a proliferação e a motilidade, enquanto inibir a morte e a diferenciação transforma o crescimento excessivo benigno inicial em um tumor altamente maligno metastático e mortal. Tornou-se evidente que, além de alterações genéticas, a progressão do tumor requer alterações no estroma circundante e diafonia entre os tipos de células tumorais e múltiplos (por exemplo, fibroblastos, células endoteliais, imunes e) no seu microambiente. Compreender os princípios moleculares subjacentes transformação maligna incluindo interações tumor-estroma é de grande importância para o desenvolvimento de prevenestratégias de e rastreio precoce, bem como tratamentos novos e eficazes para lutar contra a metástase do câncer e resistência aos medicamentos.

A mosca da fruta Drosophila melanogaster tornou-se um sistema atraente para a investigação do cancro ^1-4 devido ao seu tempo de geração rápido, notável conservação da sinalização nós entre moscas e seres humanos, redundância genética limitada e riqueza de ferramentas genéticas avançadas que facilitam a manipulação de quase qualquer gene em de maneira temporária e espacialmente restritos. Tumores geneticamente definidas de diferentes malignidade pode ser reprodutivelmente engenharia em Drosophila através da introdução de gain- e mutações de perda de função em um subconjunto de células progenitoras num tecido de outra forma tipo selvagem utilizando a técnica marcm ^5. A ferramenta combina marcm FLP / FRT (FLP recombinase / FLP Reconhecimento Target) mediada por recombinação mitótica ⁶ com FLP-out ⁷ e Gal4 / UAS (Upstream Activation Sequence) gene alvo ⁸sistemas de expressão de ^9. Com esta expressão método de qualquer transgene UAS-base, incluindo oncogene ou ADNc de proteína fluorescente ou repetições de ADN invertidos para silenciamento de genes induzido por ARNcd, será restrita a um clone de células que perderam um locus genético específico e um repressor Gal4 devido à recombinação (Figura 1A). Remendos clonais marcados com fluorescente verde (GFP) ou proteínas fluorescentes vermelho (por exemplo, RFP, DsRed, mCherry) pode ser facilmente rastreada ao longo do desenvolvimento, isolados e analisados. Importantemente, o seu comportamento pode ser directamente comparada com o tecido adjacente de tipo selvagem. Assim, questões pertinentes à célula efeitos autónomos e não autónomos de lesões genéticas podem ser convenientemente estudado. Semelhante a mamíferos, apenas clones em que múltiplas lesões oncogênicos são combinados se tornem malignas em Drosophila e recapitular características principais de câncer de mamíferos. Eles overproliferate, fugir apoptose, induzir a inflamação, tornar-se imortal e invasiva, em última análise, matando o hospedeiro ^10-17.

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar tumores clonais geneticamente definidas no tecido ocular / antenas e do cérebro de larvas de Drosophila usando a técnica marcm. O método baseia-se um testador de estoque marcm que expressa a recombinase FLP de levedura sob o controlo do intensificador sem olhos (eyFLP) ^18,19. Desta forma, os clones marcado com GFP são geradas em ambos epitélio colunar e peripodial do EAD e o neuroepitélio do cérebro ao longo estágios embrionários e larval (Figura 1a, b e de referência ^20). Clones podem ser facilmente seguido até a idade adulta como a EAD desenvolve no olho adulto, antena e cabeça cápsula enquanto o neuroepitélio dá origem a neuroblastos que produzem neurônios do lóbulo óptica diferenciadas.

Para facilitar a extensa caracterização molecular, funcional e fenotípica do tecido mosaico, que deescriba um protocolo para dissecção da EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e delinear a forma de processá-los por três aplicações diferentes: (i) a detecção de repórteres fluorescentes transgênicas e imunocoloração, (ii) quantificação de invasão tumoral e (iii) a análise dos altera a expressão do gene utilizando uma quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), ou um ARNm de alto rendimento de sequenciação (ARNm-SEQ) (Figura 1C).

O protocolo de imunocoloração pode ser usado para visualizar qualquer proteína de interesse com um anticorpo específico. Transgenic repórteres fluorescentes transcricionais fornecer informações espaço-temporal conveniente e precisa sobre a actividade de uma via de sinalização particular. repórteres celular específicos de linhagem, por outro lado, reflectem alterações qualitativas e quantitativas em populações de células no interior do tecido do mosaico e entre os tumores de diferentes genótipos. A quantificação do comportamento invasivo facilita a comparação de malignidade do tumor entre o genótipos. Finalmente, o protocolo descrevendo recolha e tratamento de EAD mosaico para o isolamento de RNA é adequado tanto para aplicações a jusante-pequena e grande escala, tais como a transcrição reversa seguida de qRT-PCR e mRNA-seq genome-wide, respectivamente. Os dados qualitativos e quantitativos obtidos a partir destes ensaios de fornecer novos insights sobre o comportamento social dos tumores clonais. Além disso, eles produzem uma base sólida para estudos funcionais sobre o papel dos genes individuais, redes genéticas e microambiente do tumor em diferentes fases e aspectos da tumorigénese.

Protocolo

NOTA: Este trabalho utiliza o eyFLP1; act> y ^+> Gal4, UAS-GFP; Linha tester FRT82B, banheira-Gal80 marcm 82B Verde ^11. Cruzando as virgens testador marcm 82B Verdes para machos de estirpes tais como w; UAS-um; UAS-b ^RNAi, FRT82B c ^mut genótipo irá produzir descendência em que a recombinação mitótico irá ocorrer entre os braços direitos dos cromossomos homólogos ^3º. Desta forma, os clones mutante homozigótica para o gene c localizada distalmente ao local FRT82B irá ser gerado dentro do neuroepitélio EAD e cérebro. Estes clones irá expressar GFP, e um transgene de ARNcd para o gene b (Figura 1A). Várias linhas de tester eyFLP-marcm para recombinação no X, 2L, 2R, 3L e 3R foram estabelecidas e estão disponíveis dentro da comunidade mosca.

1. O manuseamento Fly, cruzes, e estadiamento

1. Expandir o estoque marcm testador adequado à temperatura ambiente, preenchendo múltipla bottles ao mesmo tempo. Virar os adultos em garrafas frescos a cada 2-3 dias para que as virgens suficientes podem ser recolhidos para cruzamentos subsequentes.
   NOTA: Quando recolher virgens, evitar uma exposição prolongada ao CO _2, pois isso compromete a fecundidade das fêmeas.
2. Dependendo da escala do experimento, configurar cruzes mosca em frascos utilizando pelo menos 10 marcm virgens testador e 4 machos (por exemplo, para geração de imagens de repórteres fluorescentes e imunocoloração) ou em frascos com pelo menos 30 virgens e 10 homens (por exemplo, para isolamento de ARN e quantificação de invasividade).
3. Elevar progénie a 25 ° C sob um dia longo de 16 h / 8 h ciclo de luz-escuridão. Virar pais em novos frascos / garrafas a cada 24 horas para facilitar o preparo reprodutível de larvas e para evitar a superlotação.
   NOTA: Começando no dia 6 após a postura dos ovos (AEL), o terceiro controle instar alimentação das larvas parada final, começar vagando e entrar pupariation. Em contraste, o início da transição larva-pupa pode ser deDefiniu ou inexistente em larvas com EAD portadores de tumores clonais hiperplásicas ou malignos.

2. Coleta de terceiro instar larvas

1. Para imunocoloração, recolher cerca de 20 final de larvas terceiro (vagando na parede e os de um tamanho corporal comparável a partir do alimento). Use uma pinça para escolher cuidadosamente as larvas do frasco ou garrafa e transferi-los para um prato de embrião de vidro cheio com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   1. Para o isolamento de ARN e a quantificação da capacidade de invasão, recolher, pelo menos, 80 final de larvas terceiro (vaguear sobre a parede e as de um tamanho comparável a partir do corpo de alimentos). Use uma garrafa de esguicho para esguichar PBS em uma garrafa mosca contendo larvas até que a superfície é coberta.
   2. Suavizar as camadas superiores de alimento com uma espátula e despeje o purê alimentos que contenham larvas em uma placa de Petri. Utilizando uma pinça, gentilmente pegar larvas e transferi-los para um prato de embrião de vidro cheio de PBS.
2. Lavar com PBS larvas until todos os alimentos residual é removido. Inspecionar as larvas sob o estereomicroscópio fluorescente com 8 a ampliação de 16x para descartar todos "leopardo larvas" que carregam manchas GFP positivas aleatórias em todo o corpo larval (Figura 2A, 2B e ver seção de discussão).
   NOTA: Para o isolamento de ARN incluem um passo de lavagem no penúltimo EtOH a 70% durante 1 min.
3. Coloque o prato contendo larvas selecionado na PBS em gelo até dissecção. larvas processo no prazo de 30 min para evitar efeitos adversos de frio e fome.

3. Dissecção da Larvas

1. Para dissecar o EAD sob um microscópio estereoscópico, use um par de pinças para pressionar levemente a parte do meio da larva contra o fundo prato de vidro. Com a segunda pinça, pegue os ganchos boca larval e puxá-los para fora do corpo (Figura 2C).
   NOTA: A força de tracção é muitas vezes suficiente para quebrar os caules óptica que ligam o EAD pair para os lobos cerebrais. Se o cérebro ou suas partes ficar ligado a EAD e a sua presença não é desejada para outras aplicações, cortar os caules óptica com a ajuda dos dois pares de pinças. Para tumores invasivos (por exemplo, ras ^V12 Scrib ¹⁾ a conexão entre EAD e os lóbulos cerebrais torna-se cada vez mais obscurecido com o tempo por overgrowing e migração de células clonais.
   1. Para preparar o complexo de EAD / cérebro com um cordão nervoso intacto ventral (VNC) (Figura 2D), utilizar uma pinça para cortar uma larva no meio do corpo. Descarte a metade posterior.
   2. Segurar a metade anterior do corpo de larvas entre as pontas de um fórceps, inverter a larva de dentro para fora, empurrando os ganchos boca com a ponta do fórceps e as segundas por laminagem a cutícula por cima com o primeiro par de fórceps.
2. Utilizando uma pinça remova cuidadosamente todos os tecidos estranhos (por exemplo, glândulas salivares, gordura corporal e intestinal), deixando o par EAD ouo complexo EAD / cérebro ligado aos ganchos boca. Separar os ganchos na boca da cutícula sobrejacente. Livre o VNC, cortando as projeções axonal estendendo-se até os músculos do corpo e epiderme (Figuras 1B, 2C, 2D).
   NOTA: Os ganchos boca para permitir a manipulação segura do tecido com uma pinça e facilitar o afundamento mais eficiente e fácil reconhecimento de tecido durante a lavagem. Dissecados morfologia mudança EAD relativamente rápido quando mantidos unfixed em PBS. Limitar o tempo de dissecção para 20-30 min.
3. Para transferir o tecido, revestimento a ponta da micropipeta P20 pipetando o corpo restante carcaças várias vezes para cima e para baixo. Para transferir os complexos maiores EAD / cerebrais, corte a ponta da micropipeta P20 com uma tesoura.
   NOTA: O procedimento de revestimento é crítico para evitar a aderência e a perda de tecido dissecados durante a transferência. Uso de uma micropipeta P20 minimiza a transferência de fosfato em solução fixadora, limitando a diluição indesejada.
   1. Para imunocoloração, transferirEAD dissecado em um tubo de 0,5 ml cheio com 400 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) fixador. Use 1,5 ml tubo com 1 ml PFA para ampliar EAD complexos cerebrais / significou para marcação de invasão.
      CUIDADO: PFA é altamente tóxico. Usar luvas e vestuário de protecção. Evitar o contacto com a pele, olhos ou membranas mucosas.
   2. Para o isolamento do RNA transferir o EAD dissecado em um novo prato de vidro cheio de PBS frio. Use uma pinça para limpar EAD a partir das glândulas linfáticas e do anel, para minimizar a contaminação da amostra.
   3. Retire a EAD dos ganchos na boca, cortando a ligação entre os discos de antena e boca ganchos usando uma pinça (Figura 2E). Para evitar RNA degradação e artefatos de expressão gênica, limitar o tempo de dissecção e 30 min. Siga para a etapa 7.
      Nota: Um investigador experiente pode dissecar cerca de 60 larvas em 30 min Tempo de exclusão necessários para a coleta de larvas e de lavar roupa. Total de rendimentos de ARN depender do tamanho EAD que variam entre os genótipos e DevelopmentAl etapas. Dissecação de 80-100 pares de controle de EAD de larvas terceira final deve render 5-8 ug de RNA total.

4. Fixação, imunocoloração e montagem

1. Fix amostras em PFA fixador durante 25 min, enquanto se nutação à temperatura ambiente. O tempo de fixação pode ser prolongado até 60 minutos sem alterar a morfologia do tecido e a antigenicidade de proteínas.
2. Retirar as amostras de agente de fixao e lavagem com PBST (PBS com 0,1% de Triton X-100), três vezes durante 10 min, utilizando um nutator. Utilizar um volume suficiente de PBST durante cada passo de lavagem (400 uL / ​​tubo de 0,5 ml).
   NOTA: Fixo complexos / cérebro EAD significou para marcação de invasão não necessitam de imunocoloração. sinal de GFP continua bem visível após a fixação. Avance para o passo 4.4 para a dissecção final.
   1. Para a imunocoloração, tecido bloco em 200 ul de uma solução de bloqueio (PBST com 0,3% de BSA) durante 20 min com agitação suave à temperatura ambiente.
      1. Incube com primary anticorpos diluídos em 100 ul de uma solução de bloqueamento durante a noite a 4 ° C enquanto agitando suavemente. Referem-se a folha de dados anticorpo primário ou a literatura publicada para a diluição de anticorpo recomendada.
         NOTA: A diluição de anticorpo primário pode precisar ser otimizado.
      2. Após cinco lavagens de 10 min em PBST, tecido mancha com os anticorpos secundários fluorescentes diluído em solução de bloqueio, enquanto agitando durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C no escuro.
      3. Lavar as amostras três vezes 10 minutos em PBST.
3. Substituir PBST com 500 ul de solução DAPI-coloração. Para marcar F-actina, adicionar faloidina conjugada com um corante fluorescente para solução DAPI-coloração. Depois de 15 min no escuro nutação, lavar o tecido uma vez durante 10 min com PBST.
   NOTA: rotulagem F-actina pode ser realizada de forma independente da coloração com DAPI.
4. Para a etapa de dissecção final, transferir o tecido de volta em um prato de vidro PBS-cheia usando um pi 1 mlpette. Utilizando os dois pares de pinças de clipe para fora dos ganchos boca.
   1. Separa-se os cérebros que serão usados ​​para a quantificação da invasividade do EAD cortando a haste óptica como EAD coberto pode dificultar a análise.
5. Colocar uma gota de meio de montagem (15 ul de uma lamela x 22 mm 22 mm) sobre uma corrediça objectivo. Com a ajuda de fórceps dicas, distribuir o meio numa camada fina. Transferir EAD, cérebros ou os complexos EAD / cerebrais para o meio de montagem com uma micropipeta P20.
6. Use as dicas fórceps ou uma haste de tungstênio para distribuir tecidos e endireitar o VNC no slide.
7. Para evitar a formação de bolhas durante a montagem, o primeiro toque de uma borda de uma lamela para o meio de montagem e, em seguida, lentamente inferior para o meio de montagem com a ajuda de fórceps. Use pequenos pedaços de papel de filtro ou lenço de papel para absorver o excesso de meio de montagem em torno das bordas lamela.
   NOTA: DABCO / poli (álcool vinílico) de montagem 4-88 endurece médiasa 4 ° C no decurso de uma hora. As lâminas podem ser armazenadas durante meses a 4 ° C.

5. Imagem Confocal

1. Adquirir seções confocal individuais e pilhas usando um microscópio confocal equipado com 20X, objetivos petróleo 40X e 60X.
2. Evitar a saturação pixel. Use mesmos parâmetros de aquisição de imagem, incluindo a resolução da imagem, potência de entrada laser, ganho, offset, quadro de média, um tamanho de passo em uma série z e manter essas configurações para todos os genótipos para permitir comparações de intensidades de pixel entre os diferentes genótipos ^21,22.
   NOTA: Para a visualização do complexo / cérebro EAD, gerar projeções máximas e costurar respectivas imagens, vizinhos. Para a preparação da imagem final, use pós software de processamento de imagem para a montagem do painel e para ajustar o brilho e contraste.

6. A quantificação de invasividade tumoral

1. Definir um sistema de pontuação que vai caracterizar os diferentes níveis de invasivenes tumoraiss considerando o padrão espacial de invasão e a quantidade de células positivas para GFP espalhar para o cérebro e VNC. Prepare fichas de avaliação para documentação (Figura 3A).
2. Mount pelo menos 80 fixa cérebros intactos para cada genótipo em um slide utilizando 40 ul do meio de montagem por 24 milímetros x 50 mm lamela.
   1. Para permitir pontuação imparcial, pergunte a um partido neutro anonimizar os slides, para que o procedimento de pontuação é imparcial. Avaliar lâminas anónimos por dois membros do laboratório de forma independente. Divulgar genótipos somente após a contagem estiver concluída.
3. Avaliar o grau de malignidade por um placar cega de cérebros montados sob um microscópio estereoscópico fluorescente equipado com um conjunto de filtros GFP. Use um marcador para rotular cérebros que já foram vistos a fim de evitar a dupla contagem (Figura 3B).
4. Calcula-se a percentagem de cérebros de queda em cada uma das categorias definidas por genótipo invasivos. Determinar os s estatísticosignificance usando um teste qui-quadrado (Figura 3C).

7. Isolamento RNA, DNase Tratamento e Verificação da Qualidade

NOTA: Todos os reagentes (soluções, utensílios de plástico) utilizado nos passos seguintes deve ser isento de actividade de RNase. Use sempre luvas e usar um capuz química para o trabalho com solventes orgânicos.

1. Transfira a EAD limpo com uma ponta de micropipeta P20 revestido em 1,5 ml tubo.
2. Deixe dissipador de tecido para o fundo do tubo, cuidadosamente remover PBS e substituí-la com 100 ul de reagente de lise de ARN (suficiente para até 140 DAE).
3. Lyse tecido em vórtex. Neste ponto, as amostras podem ser congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C ou directamente processada com um protocolo de isolamento de ARN padrão.
   NOTA: As amostras de genótipos similares de várias rodadas de dissecação pode ser agrupada vez em reagente de lise RNA.
4. Encher o volume da amostra de 0,9 ml, com reagente de lise de ARN. Adicionar 0,2 ml de clorofórmio e misturar amostras Vigorously durante 15-20 seg.
5. Após 2 a 3 minutos de incubação à temperatura ambiente, centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
6. ARN de transferência superior incolor fase aquosa contendo em um novo tubo, sem perturbar a interfase. Fique longe da interfase, pois contém proteínas e DNA genômico.
   NOTA: O volume recuperado deve ser de cerca de 60% do volume de reagente de lise de ARN usado para a homogeneização.
7. Precipitar o ARN por adição de 0,5 ml de álcool isopropílico. Vortex e incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 min.
8. Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
9. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN, uma vez com 600 ul de etanol a 75%. Depois de um curto vórtice e centrifugação (10.000 xg durante 7 minutos a 4 ° C) descartar todo o etanol e deixar o sedimento de ARN de ar seco durante 5-10 minutos colocando o tubo aberto em um tecido limpo limpar.
   NOTA: O sedimento de ARN pode ser visível como uma pequena branco opaco r /maduro na parte inferior do tubo ou invisível. As gotas de etanol restantes podem ser removidos cuidadosamente com ponta P10 micropipeta.
10. Dissolve-se o ARN em 50 jil de água tratada com DEPC em vortex ou solução que passa algumas vezes através de uma ponta de pipeta.
11. Para minimizar a contaminação com ADN genómico, tratar de ARN total com ADNase pela adição de 50 ul de uma mistura contendo 1 ul de ADNase (2 U / ul) e 10 ul de tampão de ADNase 10x em água tratada com DEPC. Vortex e girar para baixo.
12. Incubar as amostras a 37 ° C num banho de água ou de um bloco de aquecimento durante 30 a 40 min. Após a incubação, adicionar 100 ul de água tratada com DEPC para cada amostra.
13. Para inactivar a actividade enzimática e RNA limpo de ADNase, adicionar 200 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) soluções, vortex durante 1 min e centrifuga-se as amostras a 10.000 xg durante 7 minutos a 4 ° C.
14. Transferir cuidadosamente a fase aquosa superior contendo ARN para um tubo fresco. Adicionar um volume igual (200 ul)de clorofórmio, misturar e repetir o passo de centrifugação a partir de cima.
15. Recolher cuidadosamente a fase superior e precipitar o ARN por adição de 1/10 do volume de 3 M de acetato de sódio, pH 5,2, preparada em DEPC _H2O e 2,5 volumes de etanol a 100%. Misture bem em vórtice.
    NOTA: A adição de 0,5 ul de glicogénio (20 mg / mL) a uma mistura de precipitação ajuda a visualizar o sedimento de ARN. Para minimizar a perda de ARN, usar siliconada, tubos de ligação de baixa microcentrífuga de 1,5 ml.
16. Precipitar o RNA a -20 ° C durante pelo menos 1 h.
    NOTA: A incubação pode ser realizada durante a noite. As amostras podem ser colocadas a -80 ° C, bem.
17. Sedimento de ARN por centrifugação a 10000 xg durante 30 min a 4 ° C. Lave e pellet seco seguindo a descrição em 7,9.
18. Dissolve-se o ARN em 10-15 ul de água tratada com DEPC. ARN armazenar a -80 ° C.
19. Determinar a quantidade e a pureza do RNA através da medição OD a 230 nm, 260 nm e 280 nm utilizando um espectrofotómetro. Calcule RNA concentration, aplicando a convenção de que 1 DO a 260 nm é igual a 40 ug / ml de ARN.
    NOTA: O rácio A _260/280 de ARN "pura" é igual a 2,0, enquanto uma razão A _260/230 deve estar na gama de 2,0-2,2. As amostras de ARN com um A _260/280 razão entre 1,7 e 2,0 são adequados para aplicações a jusante, tais como a síntese de cDNA. Para a preparação de bibliotecas de ARNm-seq a qualidade e quantidade de ARN deve ser verificada utilizando um sistema de electroforese automatizada. A proporção 28S / 18S deve estar acima de 1,8.

Resultados

Para demonstrar o potencial da técnica eyFLP-marcm para gerar manchas marcadas com GFP de genótipos definidos em Drosophila EAD, foram induzidos três tipos de clones: (1) controle somente expressando GFP, (2) tumores malignos expressar uma forma oncogénica do pequeno Ras (Ras ^V12) da proteína G em um fundo de perda homozigótica de um scribble gene supressor de tumor (Scrib ^1), e (3) sobrecrescimento mas não invasivo ras ^V12 ...

Discussão

As técnicas para gerar mosaicos genéticos em Drosophila estão entre as ferramentas mais sofisticadas para analisar e manipular a função do gene ^33. O sistema eyFLP-marcm provou poderoso e robusto, uma vez que permite a indução do visualmente marcados, clones geneticamente definidas de uma maneira espacialmente restrita, isto é, em tecidos em que o potenciador é activa sem olhos ^9,18. Isto é particularmente importante quando múltiplas lesões genéticas são combinados nas me...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agar	Gewü rzmü hle Brecht, Eggenstein, Alemanha	00262-0500	Receita de comida para moscas: Prepare 20 L de comida para moscas com 160 g de ágar, 360 g de fermento, 200 g de farinha de soja, 1,6 kg de fubá amarelo, 1,2 L de extrato de malte, 300 ml de xarope de milho light, 130 ml de ácido propiônico e 200 ml de nipagina a 15%. A comida para moscas deve ser cozida por 1 hora a 85  °C.
Xarope de milho	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Alemanha	01939
Ácido propiónico	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha	6026.1
Cornmeal	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Alemanha	4010155063948
Extracto de malte	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Alemanha	728985
Farinha de soja	Stockmeier Food GmbH, Herford, Alemanha	1000246441010
Levedura	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Alemanha	210099K
Metil-4-benzoato / Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	H5501	Prepare uma solução estoque a 15% com 70%
de EtOH Drosophila frascos de comida para moscas	Kisker Biotech, Steinfurt, Alemanha	789008
Plugues de frasco de etileno	K-TK e.K., Retzstadt, Alemanha	1002
Garrafas de comida para moscas Drosophila	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha	960177
Tampões para garrafas	K-TK e.K., Retzstadt, Alemanha	1002 S
Poli(álcool vinílico) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	81381	Receita de meio de montagem: Dissolver 6 g de Poli(álcool vinílico) 4-88 in 39  ml de Millipore H2O, 6 ml de Tris 1 M (pH 8,5) e 12,5 ml de glicerol. Mexa durante a noite a 50  ° C e centrífuga 20  min a 5.000 rpm. Adicione DABCO ao sobrenadante para obter uma concentração final de 2,5%. Armazene alíquotas em -20  °C.
1,4-Diazabiciclo[2.2.2]octano/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	9002-93-1
Solução salina tamponada com fosfato/ PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 em Millipore H2O
PBST			0,1% Triton X-100 em PBS
Paraformaldeído/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	158127	4% Receita de fixador de PFA: Dissolva 4  g PFA em 80 ml de Millipore H2O em uma placa agitadora magnética aquecida a 55  °C. Adicione 1 M NaOH gota a gota até que todas as partículas de PFA sejam dissolvidas. Adicione 10 ml de PBS 10x e ajuste o pH para 7,4 com HCl 1 M. Misture em 100 µ l Triton X-100 e encha com Millipore H2O até 100 ml. Armazene alíquotas a -20 ° C. Evite descongelar repetidamente. (CUIDADO: O PFA é altamente tóxico. Preparar o fixador PFA numa hotte. Use um aparelho de respiração independente, luvas e roupas. Evite o contato com a pele, olhos ou membranas mucosas.)
Albumina de soro bovino / BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	A3059	Receita de solução de bloqueio: Dissolva 0,3% de BSA em PBST
Faloidina marcada com fluorescência	Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha, Sondas Moleculares	A12379, A22283, A22284	Solução estoque de faloidina: Dissolva o pó (300 U) em 1,5 ml de metanol. Armazene a -20 ° C. Para coloração, use em diluição 1:250 (A12379, A22283) e 1:100 (A22284) em PBST.
4',6-Diamidino-2-fenilindol Di-hidrocloridrato / DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha	6335	Solução de coloração DAPI: Preparar uma solução-mãe de 5 mg/ml em Millipore H2O e armazenar alíquotas a 4 °C. Utilizado na diluição 1:1.000 em PBST.
Anticorpo anti-H2 de camundongo	Kurucz et al., 2003		Usado em diluição 1:500 em solução de bloqueio
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Reino Unido	715-175-151	Usado em diluição 1:500 em solução de bloqueio
Dumont #5 fórceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha	11295-10
Prato de embrião de vidro (30  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	E90
Agulhas de tungstênio	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha	10130-20
Suporte de pino niquelado	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha	26018-17
Lâminas de microscópio	VWR, Darmstadt, Alemanha	631-1553
Lamínulas 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)	VWR, Darmstadt, Alemanha	631-1336
lamínulas 24 x 50 mm (0.13-0.16  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	1076371
Kimtech Science Toalhetes de precisão	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	06-677-70
Estereomicroscópio de dissecação	Olympus, Hamburgo, Alemanha	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japão)
Estereomicroscópio fluorescente	Olympus, Hamburgo, Alemanha	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japão) com câmera	CCD DP72Equipado com o conjunto de filtros passa-banda azul estreito para excitação de GFP outros fluorocromos excitáveis azuis (filtro de excitação BP460-480 nm, filtro de barreira BA495-540 nm) e excitação verde estreita e filtro de barreira passa-longa para RFP e outros fluorocromos excitáveis verdes (filtro de excitação BP530-550, filtro de barreira BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Microscópio confocal	Olympus, Hamburgo, Alemanha	FV1000	Equipado com microscópio IX81 invertido. Objetivos: 20× UPlan S-Apo (NA 0,85), 40&vezes; UPlanFL (NA 1,30) e 60 vezes; UPlanApo (NA 1.35). Lasers: Diodo laser UV LD405 (50  mW), laser de argônio, multi-linha 457/(476)/ 488/515 (40  mW), Diodo laser amarelo/verde LD560 (15  mW) e Diodo Laser Vermelho 635 (20  mW). Software: Software Fluoview 2.1c
Incubadora refrigerada por Drosophila	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemanha	Frasco de esguicho Sanyo MIR553
	VWR, Darmstadt, Alemanha	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Alemanha	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Alemanha	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, Darmstadt, Alemanha	2302700	O protocolo é compatível com outros reagentes à base de TRIzol, e.g., TRIreagent da Sigma (Cat. Nr.T9424), reagente de TRIzol da Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Dietil pirocarbonato / DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	D5758	Diluir DEPC 1:1.000 em Millipore H2O, agitar durante a noite e autoclave.
Fenol UltraPure:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha	15593-031
Clorofórmio	Merck, Darmstadt, Alemanha	102445
TURBO DNase (2 U/µ l)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha	10-814-010
Acetato de sódio trihidratado	VWR, Darmstadt, Alemanha	27652.232	Prepare uma solução de acetato de sódio 3 M com DEPC-H2O e ajuste o pH para 5.2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Alemanha
Etanol	Merck, Darmstadt, Alemanha	100983	Prepare uma diluição de EtOH a 75% com DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrofometer NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	ND-8000
Eppendorf Microcentrífuga (Refrigerada)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	7007103
Estação de Eletroforese Automatizada Experion	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	7007010
SuperScript III Transcriptase Reversa	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		Prepare 100 µ M soluções de estoque em DEPC-H2O e armazene a -20 > Mistura C
dNTP	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, França	4030	Loja alíquotas de 25 µ l em -20 graus; C
CFX96 Touch Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	170-8882
Placas PCR de casca dura 96 poços, parede fina	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	MSB1001
rp49 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'