o Drosophila Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Resumo

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

Resumo

Drosophila melanogaster emergiu como um poderoso sistema experimental para estudos funcionais e mecanicistas do desenvolvimento e progressão do tumor no contexto de um organismo inteiro. Técnicas sofisticadas para gerar mosaicos genéticos facilitam a indução de clones geneticamente definidos e visualmente marcados, cercados por tecido normal. Os clones podem ser analisados através de diversas abordagens moleculares, celulares e ômicas. Este estudo descreve como gerar tumores clonais marcados com fluorescência de malignidade variável nos discos imaginais oculares/antenais (EAD) de larvas de Drosophila usando a técnica de Análise de Mosaico com Marcador de Células Repressíveis (MARCM). Ele descreve procedimentos como recuperar o mosaico EAD e o cérebro das larvas e como processá-los para imagens simultâneas de repórteres transgênicos fluorescentes e coloração de anticorpos. Para facilitar a caracterização molecular do tecido em mosaico, descrevemos um protocolo para isolamento de RNA total do EAD. O procedimento de dissecção é adequado para recuperar EAD e cérebros de qualquer estágio larval. O protocolo de fixação e coloração para discos imaginários funciona com vários repórteres transgênicos e anticorpos que reconhecem proteínas de Drosophila. O protocolo de isolamento de RNA pode ser aplicado a vários órgãos larvais, larvas inteiras e moscas adultas. O RNA total pode ser usado para traçar o perfil de alterações na expressão gênica usando abordagens candidatas ou de todo o genoma. Por fim, detalhamos um método para quantificar a invasividade dos tumores clonais. Embora esse método tenha uso limitado, seu conceito subjacente é amplamente aplicável a outros estudos quantitativos em que o viés cognitivo deve ser evitado.

Introdução

Cancer representa um dos grupo mais geneticamente heterogêneo de doenças, cuja incidência e mortalidade está aumentando dramaticamente, especialmente entre os idosos em todo o mundo. Cancer origem clonal de uma célula de iniciação tumor que escapa mecanismos supressores tumorais inerente e divide fora de controle. A acumulação gradual de lesões genéticas que cooperativamente promover o crescimento, a proliferação e a motilidade, enquanto inibir a morte e a diferenciação transforma o crescimento excessivo benigno inicial em um tumor altamente maligno metastático e mortal. Tornou-se evidente que, além de alterações genéticas, a progressão do tumor requer alterações no ....

Protocolo

NOTA: Este trabalho utiliza o eyFLP1; act> y ^+> Gal4, UAS-GFP; Linha tester FRT82B, banheira-Gal80 marcm 82B Verde ^11. Cruzando as virgens testador marcm 82B Verdes para machos de estirpes tais como w; UAS-um; UAS-b ^RNAi, FRT82B c ^mut genótipo irá produzir descendência em que a recombinação mitótico irá ocorrer entre os braços direitos dos cromossomos homólogos ^3º. Desta forma, os clones mutante homozigótica para o gene c localizada distalmente ao local FRT82B irá ser gerado dentro do neuroepitélio EAD e cérebro. Estes clones irá expressar GFP, e um transgene de ARNcd para o gene b

Resultados

Para demonstrar o potencial da técnica eyFLP-marcm para gerar manchas marcadas com GFP de genótipos definidos em Drosophila EAD, foram induzidos três tipos de clones: (1) controle somente expressando GFP, (2) tumores malignos expressar uma forma oncogénica do pequeno Ras (Ras ^V12) da proteína G em um fundo de perda homozigótica de um scribble gene supressor de tumor (Scrib ^1), e (3) sobrecrescimento mas não invasivo ras ^V12 .......

Discussão

As técnicas para gerar mosaicos genéticos em Drosophila estão entre as ferramentas mais sofisticadas para analisar e manipular a função do gene ^33. O sistema eyFLP-marcm provou poderoso e robusto, uma vez que permite a indução do visualmente marcados, clones geneticamente definidas de uma maneira espacialmente restrita, isto é, em tecidos em que o potenciador é activa sem olhos ^9,18. Isto é particularmente importante quando múltiplas lesões genéticas são combinados nas me.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agar	Gewü rzmü hle Brecht, Eggenstein, Alemanha	00262-0500	Receita de comida para moscas: Prepare 20 L de comida para moscas com 160 g de ágar, 360 g de fermento, 200 g de farinha de soja, 1,6 kg de fubá amarelo, 1,2 L de extrato de malte, 300 ml de xarope de milho light, 130 ml de ácido propiônico e 200 ml de nipagina a 15%. A comida para moscas deve ser cozida por 1 hora a 85  °C.
Xarope de milho	Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Alemanha	01939
Ácido propiónico	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha	6026.1
Cornmeal	ReformKontor GmbH, Zarrentin, Alemanha	4010155063948
Extracto de malte	CSM Deutschland GmbH, Bremen, Alemanha	728985
Farinha de soja	Stockmeier Food GmbH, Herford, Alemanha	1000246441010
Levedura	Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Alemanha	210099K
Metil-4-benzoato / Nipagin	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	H5501	Prepare uma solução estoque a 15% com 70%
de EtOH Drosophila frascos de comida para moscas	Kisker Biotech, Steinfurt, Alemanha	789008
Plugues de frasco de etileno	K-TK e.K., Retzstadt, Alemanha	1002
Garrafas de comida para moscas Drosophila	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha	960177
Tampões para garrafas	K-TK e.K., Retzstadt, Alemanha	1002 S
Poli(álcool vinílico) 4-88/[-CH2CHOH-]n	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	81381	Receita de meio de montagem: Dissolver 6 g de Poli(álcool vinílico) 4-88 in 39  ml de Millipore H2O, 6 ml de Tris 1 M (pH 8,5) e 12,5 ml de glicerol. Mexa durante a noite a 50  ° C e centrífuga 20  min a 5.000 rpm. Adicione DABCO ao sobrenadante para obter uma concentração final de 2,5%. Armazene alíquotas em -20  °C.
1,4-Diazabiciclo[2.2.2]octano/ DABCO	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	D2522
Triton X-100	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	9002-93-1
Solução salina tamponada com fosfato/ PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 em Millipore H2O
PBST			0,1% Triton X-100 em PBS
Paraformaldeído/ PFA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	158127	4% Receita de fixador de PFA: Dissolva 4  g PFA em 80 ml de Millipore H2O em uma placa agitadora magnética aquecida a 55  °C. Adicione 1 M NaOH gota a gota até que todas as partículas de PFA sejam dissolvidas. Adicione 10 ml de PBS 10x e ajuste o pH para 7,4 com HCl 1 M. Misture em 100 µ l Triton X-100 e encha com Millipore H2O até 100 ml. Armazene alíquotas a -20 ° C. Evite descongelar repetidamente. (CUIDADO: O PFA é altamente tóxico. Preparar o fixador PFA numa hotte. Use um aparelho de respiração independente, luvas e roupas. Evite o contato com a pele, olhos ou membranas mucosas.)
Albumina de soro bovino / BSA	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	A3059	Receita de solução de bloqueio: Dissolva 0,3% de BSA em PBST
Faloidina marcada com fluorescência	Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha, Sondas Moleculares	A12379, A22283, A22284	Solução estoque de faloidina: Dissolva o pó (300 U) em 1,5 ml de metanol. Armazene a -20 ° C. Para coloração, use em diluição 1:250 (A12379, A22283) e 1:100 (A22284) em PBST.
4',6-Diamidino-2-fenilindol Di-hidrocloridrato / DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha	6335	Solução de coloração DAPI: Preparar uma solução-mãe de 5 mg/ml em Millipore H2O e armazenar alíquotas a 4 °C. Utilizado na diluição 1:1.000 em PBST.
Anticorpo anti-H2 de camundongo	Kurucz et al., 2003		Usado em diluição 1:500 em solução de bloqueio
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Reino Unido	715-175-151	Usado em diluição 1:500 em solução de bloqueio
Dumont #5 fórceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha	11295-10
Prato de embrião de vidro (30  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	E90
Agulhas de tungstênio	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha	10130-20
Suporte de pino niquelado	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha	26018-17
Lâminas de microscópio	VWR, Darmstadt, Alemanha	631-1553
Lamínulas 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)	VWR, Darmstadt, Alemanha	631-1336
lamínulas 24 x 50 mm (0.13-0.16  mm)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	1076371
Kimtech Science Toalhetes de precisão	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	06-677-70
Estereomicroscópio de dissecação	Olympus, Hamburgo, Alemanha	SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japão)
Estereomicroscópio fluorescente	Olympus, Hamburgo, Alemanha	SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japão) com câmera	CCD DP72Equipado com o conjunto de filtros passa-banda azul estreito para excitação de GFP outros fluorocromos excitáveis azuis (filtro de excitação BP460-480 nm, filtro de barreira BA495-540 nm) e excitação verde estreita e filtro de barreira passa-longa para RFP e outros fluorocromos excitáveis verdes (filtro de excitação BP530-550, filtro de barreira BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.
Microscópio confocal	Olympus, Hamburgo, Alemanha	FV1000	Equipado com microscópio IX81 invertido. Objetivos: 20× UPlan S-Apo (NA 0,85), 40&vezes; UPlanFL (NA 1,30) e 60 vezes; UPlanApo (NA 1.35). Lasers: Diodo laser UV LD405 (50  mW), laser de argônio, multi-linha 457/(476)/ 488/515 (40  mW), Diodo laser amarelo/verde LD560 (15  mW) e Diodo Laser Vermelho 635 (20  mW). Software: Software Fluoview 2.1c
Incubadora refrigerada por Drosophila	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemanha	Frasco de esguicho Sanyo MIR553
	VWR, Darmstadt, Alemanha	215-8105
BD Clay Adams Nutator Mixer	VWR, Darmstadt, Alemanha	15172-203
ELMI Digital Rocking Shaker	VWR, Darmstadt, Alemanha	DRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent	VWR, Darmstadt, Alemanha	2302700	O protocolo é compatível com outros reagentes à base de TRIzol, e.g., TRIreagent da Sigma (Cat. Nr.T9424), reagente de TRIzol da Thermofisher (Cat. Nr. 15596).
Dietil pirocarbonato / DEPC	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha	D5758	Diluir DEPC 1:1.000 em Millipore H2O, agitar durante a noite e autoclave.
Fenol UltraPure:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1)	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha	15593-031
Clorofórmio	Merck, Darmstadt, Alemanha	102445
TURBO DNase (2 U/µ l)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	AM2238
Invitrogen UltraPure Glycogen	ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha	10-814-010
Acetato de sódio trihidratado	VWR, Darmstadt, Alemanha	27652.232	Prepare uma solução de acetato de sódio 3 M com DEPC-H2O e ajuste o pH para 5.2
2-Propanol	Merck, Darmstadt, Alemanha
Etanol	Merck, Darmstadt, Alemanha	100983	Prepare uma diluição de EtOH a 75% com DEPC-H2O.
UV/Vis-Spectrofometer NanoDrop ND-8000	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	ND-8000
Eppendorf Microcentrífuga (Refrigerada)	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	5417R
Experion RNA StdSens Analysis Kit	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	7007103
Estação de Eletroforese Automatizada Experion	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	7007010
SuperScript III Transcriptase Reversa	Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha	18080044
Oligo d(T) Primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		Prepare 100 µ M soluções de estoque em DEPC-H2O e armazene a -20 > Mistura C
dNTP	Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, França	4030	Loja alíquotas de 25 µ l em -20 graus; C
CFX96 Touch Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	1855195
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	170-8882
Placas PCR de casca dura 96 poços, parede fina	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	HSP9601
Microseal 'B' Film	Bio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Alemanha	MSB1001
rp49 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Forward primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Reverse primer	Integrated DNA Technologies, Leuven, Bélgica		5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'