Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Resumo

A quantificação precisa dos eventos de tráfego vesicular geralmente fornece informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas e os efeitos das mutações. Este artigo apresenta métodos para o uso da pHluorina supereclíptica, uma variante de GFP sensível ao pH, como ferramenta para quantificação de eventos endocíticos em células vivas usando microscopia de fluorescência quantitativa e citometria de fluxo.

Resumo

A proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes são ferramentas amplamente utilizado para estudar a localização de proteínas e na dinâmica de eventos, tais como a remodelação do citoesqueleto e tráfico vesicular em células vivas. Metodologias quantitativas utilizando fusões quiméricas GFP foram desenvolvidos para muitas aplicações; No entanto, a GFP é um tanto resistente à proteólise, assim, a sua fluorescência persistir no lisossoma / vacúolo, o que pode dificultar a quantificação de tráfico de carga na via endocítica. Um método alternativo para a quantificação de endocitose e pós-endocíticas eventos de tráfico faz uso de superecliptic pHluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que é extinta em ambientes ácidos. fusão quimérica de pHluorin à cauda citoplasmática de transmembrana de carga proteínas resulta em um amortecimento de fluorescência após a incorporação da carga em corpos multivesiculares (MVBs) e entrega para o lúmen lisossoma / vacúolo. Assim, extinção da fluorescência vacuolar facilita quantificatião de endocitose e eventos precoces na via endocítica. Este artigo descreve métodos que utilizam cargas pHluorin-marcadas para quantificação de endocitose via microscopia de fluorescência, bem como ensaios de base populacional utilizando citometria de fluxo.

Introdução

tráfico vesicular desempenha um papel importante na manutenção e função identidade organelo em células eucariotas, e é um mecanismo fundamental para a regulação da composição de proteína e membrana de compartimentos celulares individuais. Na membrana plasmática, a fusão de vesículas exocíticos proporciona novas proteínas e membranas à superfície da célula, ao passo que as vesículas gerados através de endocitose remover membrana e proteínas a partir da superfície para a reciclagem ou o direccionamento para o lisossoma subsequente. Assim, é importante para a endocitose a absorção de nutrientes e para as respostas para o ambiente extracelular. A exocitose e endocitose s....

Protocolo

1. Soluções e mídia

1. Prepare os estoques A seguir, Mídia e Placas:
   1. Para preparar 10x YNB, dissolve-se 67 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, em 1 L de água. Esterilizar por filtração através de um filtro de nitrocelulose de 0,22 um.
   2. Prepare meio YNB usando 1x YNB (a partir de 10x estoque) com dextrose% 2 (de um estéril 50% w / v estoque) e mistura 1x aminoácido / nutriente (de 100x estoque, consulte o passo 1.1.4). Para a selecção do plasmídeo, omitir aminoácidos individuais ou nutrientes conforme necessário. Para indução da expressão Mup1, adicionalmente omitir a metionina a partir da mistura de aminoácidos / nutriente.
   <....

Resultados

Localização de estado estacionário e quantificação da proteína carga endocítica constitutivamente internalizado Ste3

Para demonstrar que as cargas pHluorin-tag pode ser utilizada para a quantificação de endocitose em células vivas, a localização de GFP quimérico e fusões pHluorin com a cauda citoplasmática de terminal-C de Ste3, o receptor de feromonas do factor A em levedura, foram comparados. Ste3 é um recep.......

Discussão

Aplicações de pHluorin para quantificação de eventos de endocitose em células de levedura faz uso de cargas transmembranares em que o marcador fluorescente está fundido com a cauda citoplasmática da proteína (Figura 1A). Para os ensaios aqui descritos, as cargas são fluorescentes brilhantemente quando a etiqueta pHluorin é exposta a ambientes neutros, mas tornar-se temperada, quando a etiqueta encontra pHluorin condições ácidas. Assim, uma carga endocítica pHluorin-etiquetado é facilmente detectada na f.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adenina	Sigma	A8626-25G	Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
Bacto-ágar	Fisher	BP1423-2	Uso para preparação de mídia de placa
BD Difco Yeast Nitrogen Base (sem aminoácidos)	BD	291920	Uso para preparação de mídia líquida e de placa
Concanavalina A	Sigma	C5275-5MG	Uso para revestimento de câmara slides
Dextrose	Fisher	BP350-1	Uso para preparação de meios líquidos e em placas
L-Histidina	Fisher	BP382-100	Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-Leucina	Acros	125121000	Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-Lisina	Fisher	BP386-100	Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-Metionina	Fisher	BP388-100	Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-Triptofano	Fisher	BP395-100	Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-Tirosina	Acros	140641000	Uso para preparação de mistura de aminoácidos
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8 poços)	Thermo Scientific	155411	Uso para ensaios cinéticos e finais de internalização de Mup1-pHluorin
Uracil	Sigma	U0750-100G	Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
Microscópio invertido Axiovert 200	Carl Zeiss	Custom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Lente Objetiva de Imersão em Óleo Carl	Zeiss A objetiva Carl Zeiss		deve ser 100X, 1.4NA ou superior
Sensicam	Cooke Corporation		A câmera deve ter faixa dinâmica de 12 bits ou superior
X-Cite 120PC Q Fonte de iluminação	Excelitas Technologies
Software Slidebook 5	Intelligent Imaging Innovations
Software ImageJ National	Institutes of Health		http://imagej.nih.gov/ij/