Artigo de método

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

DOI:

10.3791/54587

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23 de outubro de 2016

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1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

Neste artigo

Resumo

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A quantificação precisa dos eventos de tráfego vesicular geralmente fornece informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas e os efeitos das mutações. Este artigo apresenta métodos para o uso da pHluorina supereclíptica, uma variante de GFP sensível ao pH, como ferramenta para quantificação de eventos endocíticos em células vivas usando microscopia de fluorescência quantitativa e citometria de fluxo.

Resumo

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A proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes são ferramentas amplamente utilizado para estudar a localização de proteínas e na dinâmica de eventos, tais como a remodelação do citoesqueleto e tráfico vesicular em células vivas. Metodologias quantitativas utilizando fusões quiméricas GFP foram desenvolvidos para muitas aplicações; No entanto, a GFP é um tanto resistente à proteólise, assim, a sua fluorescência persistir no lisossoma / vacúolo, o que pode dificultar a quantificação de tráfico de carga na via endocítica. Um método alternativo para a quantificação de endocitose e pós-endocíticas eventos de tráfico faz uso de superecliptic pHluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que é extinta em ambientes ácidos. fusão quimérica de pHluorin à cauda citoplasmática de transmembrana de carga proteínas resulta em um amortecimento de fluorescência após a incorporação da carga em corpos multivesiculares (MVBs) e entrega para o lúmen lisossoma / vacúolo. Assim, extinção da fluorescência vacuolar facilita quantificatião de endocitose e eventos precoces na via endocítica. Este artigo descreve métodos que utilizam cargas pHluorin-marcadas para quantificação de endocitose via microscopia de fluorescência, bem como ensaios de base populacional utilizando citometria de fluxo.

Introdução

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tráfico vesicular desempenha um papel importante na manutenção e função identidade organelo em células eucariotas, e é um mecanismo fundamental para a regulação da composição de proteína e membrana de compartimentos celulares individuais. Na membrana plasmática, a fusão de vesículas exocíticos proporciona novas proteínas e membranas à superfície da célula, ao passo que as vesículas gerados através de endocitose remover membrana e proteínas a partir da superfície para a reciclagem ou o direccionamento para o lisossoma subsequente. Assim, é importante para a endocitose a absorção de nutrientes e para as respostas para o ambiente extracelular. A exocitose e endocitose são equilibradas para regular a área de superfície da membrana de plasma, e para permitir a rotatividade de proteínas danificadas.

Os estudos em células de levedura e de mamífero ter identificado um grande número de proteínas envolvidos em endocitose, bem como a múltiplas vias de endocitose que promovem a internalização de cargas específicas ou que agem em resposta a uma variedade de encondições tações. A via mais bem estudado é endocitose mediada por clatrina (CME), em que a proteína clatrina e acessórios citosólico em montar uma estrutura de revestimento para estabilizar a vesícula endocítica nascente. Experiências no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae produziram informações importantes sobre a dinâmica ea ordem de recrutamento para muitas proteínas de endocitose 1-3. Notavelmente, a maquinaria CME é altamente conservada ao longo da evolução de tal modo que a maioria das proteínas relacionadas com o CME em levedura tem ortólogos humanos; Assim, a brotação levedura tem sido uma ferramenta importante para a compreensão dos mecanismos de endocitose que são conservados em eucariotas superiores. Por exemplo, estudos utilizando levedura de germinação determinado que a formação e maturação de estruturas CME (referidas manchas de actina como corticais em levedura) envolve o recrutamento sequencial de muitas proteínas, começando com clatrina e proteínas adaptadoras de ligação de carga, seguido de recrutamento de acessório endocítica adicional proteínas,activação da polimerização de actina Arp2 / 3-mediada, e recrutamento de proteínas envolvidas em 1,2 vesícula cisão. Recrutamento de proteínas para máquinas CME cortical manchas de actina é um processo altamente ordenada e estereotipada, e a ordem exacta do recrutamento para muitas proteínas foi estabelecida com respeito a outros componentes da maquinaria de CME. Importante, estudos mais recentes confirmaram uma ordem semelhante de recrutamento de proteínas CME em depressões revestidas de clatrina-4 em células de mamífero.

Além CME, muitos tipos de células possuem um ou mais endocítica (CIE) vias independentes de clatrina que se baseiam em mecanismos alternativos para promover a formação de vesículas e internalização da membrana do plasma de 5-7. Em leveduras, que recentemente identificaram um caminho CIE que utiliza a pequena GTPase Rho1 e sua ativação guanina fator de troca de nucleotídeos (GEF), Rom1 8,9. Rho1 activa o formin Bni1 para promover a polimerização da actina 10,11, o que é necessário para esta forma de endocitose independente de clatrina em levedura 12. Além disso, a família α-arrestina de proteínas recrutar o ubiquitina ligase Rsp5 para promover ubiquitination carga e internalização posterior pelo CME 13-17, e também promover a internalização de carga pela via CIE, possivelmente através de interacção directa com proteínas envolvidas no CIE 18. Uma variedade de vias CIE também existe nas células dos mamíferos, incluindo as vias independentes de clatrina e fagocíticas que dependem do ortólogo Rho1, RhoA 9,19. O papel de RhoA em CIE de mamífero é mal compreendida; Assim, os estudos em levedura de brotamento pode fornecer insights mecanicistas adicionais que são aplicáveis ​​a CIE mamíferos.

quantificação precisa dos acontecimentos de endocitose pode fornecer informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas na regulação endocitose, e pode revelar os efeitos das mutações no internalização carga ou progressioN através da via endocítica. Para este efeito, métodos bioquímicos podem ser utilizados para monitorar a absorção do ligando ou para medir as taxas de degradação de proteínas de carga de endocitose. Em células vivas, a fusão da proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes para cargas de interesse permite a visualização direta de transporte de carga. No entanto, cargas GFP são de uso limitado para a quantificação de endocitose porque GFP é resistente à degradação no lisossoma (ou vacúolo em levedura). Além disso, a GFP fluorescente é apenas parcialmente sensível a mudanças no pH, e permanece detectável dentro do vacúolo lúmen 20,21. Consequentemente, a fluorescência do marcador GFP persistir no vacúolo longo após o restante da carga foi degradada, e quantificação baseado em células inteiras de intensidade de carga podem ser imprecisas devido à fluorescência da GFP longo prazo no vacúolo.

A fim de ultrapassar os inconvenientes da fluorescência de GFP vacuolar, que anteriormente feito uso de pH supereclipticluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que fluoresce intensamente a pH neutro, mas perde fluorescência em ambientes ácidos, tais como o lúmen do vacúolo / lisossomo 20,22,23. Colocação de uma etiqueta pHluorin na cauda citoplasmática de cargas de endocitose permite a visualização das cargas na membrana plasmática e em endossomas precoces, onde a etiqueta pHluorin permanece exposta ao citoplasma (Figura 1A). Já endossomos maduros, o complexo endossomal triagem necessária para embalagens de transporte (ESCRT) máquinas cargas localizadas de superfície em vesículas que brotam no lúmen do endossomo, gerando corpos multivesiculares (MVBs) 24. Para cargas que foram incorporados em vesículas internas MVB, a tag pHluorin faces para o lúmen das vesículas. MVB vesículas internas são acidificada; Assim, cargas pHluorin-tag perder sua fluorescência no início endossomas à medida que amadurecem em MVBs 20. fusão subsequente da MVB com o vacúolo oferece o conteúdo MVB luminaispara a degradação, tags e pHluorin permanecem extinta no ambiente ácido do lúmen do vacúolo.

Este artigo fornece descrições detalhadas dos ensaios de endocitose quantitativos usando cargas com marcas pHluorin citoplasmáticos em levedura. As estirpes que expressam cargas pHluorin-tag podem ser utilizados em ensaios cinéticos e / ou ponto de extremidade, em função das propriedades e o comportamento de tráfico da carga específica. Além disso, algumas cargas pHluorin-tag são passíveis de métodos de análise de alto rendimento, incluindo citometria de fluxo. Importante, a tag pHluorin é um instrumento versátil para estudar eventos de endocitose nas células vivas, permitindo a quantificação de endocitose e comparação da função endocítica no tipo selvagem e estirpes mutantes.

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Protocolo

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1. Soluções e mídia

  1. Prepare os estoques A seguir, Mídia e Placas:
    1. Para preparar 10x YNB, dissolve-se 67 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, em 1 L de água. Esterilizar por filtração através de um filtro de nitrocelulose de 0,22 um.
    2. Prepare meio YNB usando 1x YNB (a partir de 10x estoque) com dextrose% 2 (de um estéril 50% w / v estoque) e mistura 1x aminoácido / nutriente (de 100x estoque, consulte o passo 1.1.4). Para a selecção do plasmídeo, omitir aminoácidos individuais ou nutrientes conforme necessário. Para indução da expressão Mup1, adicionalmente omitir a metionina a partir da mistura de aminoácidos / nutriente.
    3. Prepare placas YNB YNB usando 1x (10x de estoque), 2% de dextrose (a partir de uma solução estéril de 50% w / v de estoque), 0,7 g / L de mistura de amino ácido / nutriente (ver o passo 1.1.5) e 2,5% de agar. Preparar o meio da placa em autoclave 25 g de ágar e 0,7 g de ácido amino mistura / nutriente por 860 ml de água. Deixar a mistura arrefecer até 55 ° C, depois adicionar 100 ml de 10x YNB e 40 ml de oF 50% de glucose. Verter em placas (cerca de 30 ml de meio por caixa de 10 cm), permitem que a forma a solidificar à temperatura ambiente, e armazenar as placas a 4 ° C.
    4. Preparar uma solução de ácido da amina / nutriente 100x (para meio líquido), dissolvendo o seguinte em 100 ml de água desionizada: 0,1 g de L-metionina, 0,3 g cada de L-leucina e L-lisina, e 0,2 g cada de L-histidina , L-triptofano, adenina e uracilo (outros aminoácidos e os nutrientes podem ser incluídos, conforme necessário para as estirpes específicas). Use suave calor se necessário para dissolver, e esterilizar através de um filtro de nitrocelulose de 0,45 um. Armazenar à temperatura ambiente ao abrigo da luz. Para a selecção do plasmídeo, preparar soluções de reserva sem componentes específicos, conforme necessário.
    5. Prepare de aminoácidos / mistura de nutrientes (por placas) por combinação do seguinte: 0,5 g de adenina, 4 g de L-leucina, e 2 g de cada de L-histidina, L-lisina, L-metionina, L-triptofano, L- tirosina e uracilo. Moer com um almofariz e pilão, e guarde com proproteção da luz. Para a selecção do plasmídeo, preparar misturas faltam componentes específicos, conforme necessário, e utilizar 0,7 g de uma mistura de aminoácidos por litro de meio de placa (ver o passo 1.1.3).
  2. Preparar lâminas de câmaras de 8 poços para a microscopia por revestimento da superfície da lâmina com concanavalina A (ConA). A cada cavidade da lâmina câmara, adicionar 25 ul de 2 mg / ml de ConA dissolvidos em água. Utilizando uma ponta de pipeta, propagar a ConA em toda a superfície do fundo do poço, em seguida, permitir que a corrediça se secar ao ar à temperatura ambiente durante pelo menos 4-8 horas. Idealmente, usar lâminas de câmaras dentro de 24 h de revestimento ConA.
  3. Gerar linhagens de leveduras com fusões em-frame de GFP ou pHluorin para a carga endocítica de interesse utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) método de integração baseado descrito no Longtine et al. e Goldstein e McCusker 25,26.
    NOTA: Os plasmídeos contendo pHluorin marcação com cassetes de genes para resistência a canamicina (KANMX6) e (nourseothricin NATMX4) foram descritos anteriormente 20.
    1. Amplificar cassetes GFP ou pHluorin contendo marcadores seleccionáveis com iniciadores contendo sequências adicionais específicos para o local de integração genómica 20,25.
    2. Transformar o produto de PCR resultante na estirpe de levedura desejado usando o método do acetato de lítio 27.
    3. Seleccionar para integração da cassete de células que crescem em placas de YPD contendo a droga apropriada. Para preparar as placas, autoclave 10 g de extracto de levedura, 20 g de peptona, 0,1 g de triptofano e 25 g de ágar em 960 ml de água. Antes de vazar placas, deixar a mistura arrefecer até 55 ° C, e depois adicionar 40 ml de 50% de glicose e ou G418 para uma concentração final de 200 ug / ml para selecção KANMX6, ou nourseothricin a uma concentração final de 100 ug / ml durante selecção NATMX4.
    4. Confirmar a integração da GFP ou etiqueta pHluorin em colónias individuais por PCR e / ou transferência de Western utilizando anticorpos anti-GFP,bem como por detecção da proteína etiquetada por microscopia de fluorescência 20.
      NOTA: estirpes de levedura específica e plasmídeos usados neste estudo estão listados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.

2. Endpoint Ensaio para a fluorescência no estado estacionário de constitutivamente Internalized endocítica Carga

  1. Inoculação das células (~ 3 pequenas colónias) em 5 ml de meio YNB que faltam os ácidos aminados ou nutrientes conforme necessário para a manutenção do plasmídeo (se aplicável). Crescer as células durante 16-24 h num incubador com agitação orbital a 30 ° C, com agitação 250 rpm. Alternativamente, uma sequência de ~ 1-2 mm de colónias de células para uma placa de YNB sem aminoácidos ou nutrientes para selecção de plasmídeos, e as células crescer durante a noite a 30 ° C.
  2. Medir a densidade (OD 600) de cada cultura durante a noite utilizando um espectrofotómetro. Prepare uma diluição de 5 ml a 0,35-0,4 OD 600 / ml em meio YNB sem aminoácidos ou nutrientes para PLAmanutenção Smid, e crescer durante cerca de 3 horas a 30 ° C com agitação. Se usando células semeadas em uma placa, ignore esta etapa e prossiga com o passo 2.4 (veja abaixo).
  3. Medir a densidade (OD 600) de células, que deve agora ser entre 0,6-1,0 OD 600 / ml. Transferir 1,5 mL da cultura para um tubo de microcentrífuga, e células de pelotas a 8000 rpm (6800 xg) durante 2 min. Remover 1.475 ul de sobrenadante.
  4. Traga células a um microscópio de fluorescência. Antes de imagem cada amostra, preparar um slide por ressuspensão das células no meio restante e montar 3 ul de suspensão de células sob uma lamela. Em alternativa, preparar a lâminas de câmaras de 8 poços tal como descrito abaixo no protocolo 3, utilizando meio YNB conforme apropriado para selecção de plasmídeos. Idealmente, as células da imagem com um 100X, 1,4 ou superior abertura numérica (NA) de imersão em óleo lente objectiva, uma câmara de 12 ou 16 bits, e os filtros de excitação / emissão optimizados para a fluorescência de GFP.
    NOTA: Se utilizar células cultivadas por listando ona placa, prepare o slide, colocando 3 mL de meio YNB fresca sobre uma lamela. Utilizando uma ponta de pipeta, recolher uma pequena colónia de células a partir da placa, dispersar as células para o meio YNB, e montar a suspensão resultante em uma lâmina de vidro imediatamente antes da imagiologia.
  5. Imagem 4-6 campos aleatórios de células para cada uma das condições, utilizando os mesmos parâmetros de aquisição (isto é, conjuntos de filtros e tempo de exposição) para todas as imagens dentro de uma experiência.
    NOTA: Coletando uma imagem DIC de campo claro ou para cada campo pode ser útil para as células onde o sinal pHluorin se apaga em MVB e compartimentos vacuolares.
  6. Quantificar a intensidade de fluorescência de pelo menos 30-50 células para cada condição (ver protocolo 5).

3. Kinetic Ensaio para Quantificação de endocitose de Cargos que sofrem endocitose Regulado

  1. Inocular 2-3 colónias de células de levedura (cerca de 2 mm de diâmetro por colónia) em 5 ml de meio YNB sem metionina e adicionaraminoácidos itional ou nutrientes para a manutenção da selecção do plasmídeo. Crescer as culturas durante 16-24 horas a 30 ° C com agitação.
    NOTA: Neste trabalho, protocolos para estudar as proteínas de carga de endocitose regulados fará uso da permease metionina, Mup1. Outras cargas que são submetidos a endocitose regulado também são adequados para a marcação com pHluorin (por exemplo, a uracil permease Fur4, que se acumula na membrana plasmática na ausência de uracilo, e em resposta a internaliza aplicado externamente uracilo); para essas cargas, condições mídia deve ser modificada para refletir as condições específicas de expressão, de indução e de internalização para que a carga.
  2. Medir a densidade (OD 600) de cada cultura durante a noite a cerca de 3 horas antes de imagem. Prepare uma diluição de 5 ml a 0,35-0,4 OD 600 / ml em meio YNB que faltam os ácidos aminados e metionina adicional ou nutrientes para a manutenção do plasmídeo, e crescer a 30 ° C com agitação.
  3. Pré-equilibrar as microslidar de câmara ambiental ou estágio aquecida (se disponível) a 30 ° C durante a incubação de 3 horas da etapa 3.2.
  4. Transferir 1 ml de cultura de células para um tubo de microcentrífuga, e células de pelotas a 8000 rpm (6800 xg) durante 2 min. Retirar 975 ul de sobrenadante.
  5. Prepare um slide câmara de tratados ConA, de 8 poços de fundo de vidro para imagens (protocolo 1.2).
  6. Adicionar 200 ul de meio YNB que faltam os ácidos aminados e metionina adicional ou nutrientes para selecção de plasmídeos a cada poço. Ressuspender o sedimento celular a partir do passo 3.4 no sobrenadante remanescente, e queda de 2,5 ul de suspensão de células no centro de cada poço. Dispersar células em toda a superfície do poço pipetando para cima e para baixo, e permitir que as células se contentar com 5-10 min.
  7. Colocar a lâmina na câmara de um microscópio de fluorescência invertido, equilibrada a 30 ° C (ver passo 3.3). Localize um campo de células com uma iluminação de campo claro.
  8. Adicionar 50 ul de meio YNB contendo 100 ug / ml de metionina(Pré-aquecido a 30 ° C) aos 200 ul de meio do poço para se obter uma concentração final de 20 metionina ug / ml. Evitar a ruptura do meio no poço, a fim de evitar que as células de flutuação a partir do fundo.
  9. Permitir que as células a equilibrar durante 2 min antes do início da imagiologia. Imediatamente antes de capturar a primeira imagem, ajuste o microscópio para o plano focal desejado (tipicamente, um plano focal equatorial funciona melhor).
  10. Adquirir imagens GFP e brightfield (ou DIC) em intervalos de 5 min para 45-60 min, utilizando parâmetros de aquisição idênticos para todas as imagens dentro de uma série de tempo (por exemplo, 100X 1.4 NA objectiva de imersão em óleo e 500 tempo de aquisição ms usando o filtro GFP, 100 o tempo de aquisição usando mseg filtro DIC).
    NOTA: Se fase do microscópio e o software de imagens não permitem para a correcção automática de desvio do plano focal, pode ser necessário reajustar manualmente o foco antes de cada ponto de tempo de imagem. Além disso, os tempos de aquisiçãovariar entre microscópios devido a diferenças na iluminação e filtros, e as condições óptimas devem ser determinados manualmente antes de se iniciar o experimento. Se uma carga diferente de endocítica Mup1 é usado, pode ser necessário modificar os intervalos de tempo de aquisição e de imagem, bem como a duração da experiência, de modo a reflectir a cinética internalização de que a carga.
  11. Quantificar a intensidade de fluorescência de células individuais em cada ponto de tempo (ver protocolo 5), e expressar os valores como uma percentagem da intensidade inicial da primeira imagem.

4. Endpoint Ensaio para Quantificação de endocítica Cargos que sofrem endocitose Regulado

  1. Prepare células para geração de imagens como descrito no protocolo 3 (passos 3.1 a 3.6).
  2. Imagem 4-5 campos aleatórios de células para cada condição imediatamente antes de adicionar metionina, usando claro e filtro GFP sets.
  3. Adicionar 50 ul de meio YNB contendo 100 ug / ml de metionina (pré-guerraMed para 30 ° C) aos 200 ul de meio do poço para se obter uma concentração final de 20 metionina ug / ml. Evitar a ruptura do meio no poço, a fim de evitar que as células de flutuação a partir do fundo.
  4. Imagem 4-5 campos aleatórios de células de 30 min após a adição de metionina, utilizando os mesmos parâmetros de aquisição como para o ponto de tempo 0 min (passo 4.2).
  5. Quantificar a intensidade de fluorescência de pelo menos 30-50 células para cada ponto de tempo (ver protocolo 5). valores expressos como a percentagem de Mup1-pHluorin internalizado depois de 30 min, utilizando a fórmula: [intensidade média a 0 min - intensidade média de 30 min] / [intensidade média a 0 min] x 100%.
    NOTA:. É possível realizar simultaneamente até oito ensaios pontos finais ao escalonar o tempo de início de cada ensaio Tabela 3 fornece um fluxo de trabalho exemplo para oito ensaios simultâneos.

5. Pós-aquisição Análise

  1. imagens de exportação de software de aquisição como um 16-bit formato de arquivo de imagem com etiquetas (.tif ou tiff).
    NOTA: Outros formatos de arquivo também podem ser adequados, e deve idealmente usar algoritmos de compressão lossless. imagens de 8 bits não são geralmente adequadas para fins de quantificação.
  2. Abrir arquivos usando o software ImageJ (disponível gratuitamente opção 'Abrir' em no menu 'File'. Use a imagem de fluorescência para a quantificação e a imagem de campo claro / DIC como referência para identificar a localização das células e para excluir as células mortas (se presente ), que aparecem mais escuras do que as células vivas quando vistos por DIC e são autofluorescente quando visto com filtros GFP excitação / emissão.
  3. Realizar uma subtracção de fundo a imagem de fluorescência. Para imagens com um sinal de fundo irregular, usar o algoritmo 'subtração' encontrado na 'menu Process'. Use a configuração padrão (raio de rolamento bola de 50 pixels), que é geralmente suficiente para fins de quantificação.
    NOTA: Um backgro alternativamétodo de subtração und para imagens com fundo uniforme é descrito na etapa 5.3.1.-5.3.2; No entanto, o método também funciona acima para o fundo uniforme.
    1. Para as imagens com fundo uniforme (isto é, a intensidade do fundo é aproximadamente constante em todas as extremidades e no centro da imagem), executar um manual de subtracção do fundo. Clique no botão 'seleções à mão livre' encontrada na janela ImageJ principal e selecione 3-5 regiões aleatórias dentro da imagem que não contêm células.
    2. Abra a função 'set' Medidas localizado no menu "Analisar", selecione o parâmetro 'Média Cinza Valor', e medir valores de intensidade utilizando a função 'Medida' (também encontrado no menu "Analisar"). Calcule o valor médio das 3-5 regiões medidos, e subtrair todas as medições posteriores dessa imagem.
  4. Para quantificação dos ensaios cinéticos (protocolo 3), gerar uma imagem única, empilhadas para o timE Series. Abra as imagens de fluorescência de cada ponto de tempo em ordem cronológica, e gerar uma pilha utilizando as 'imagens para Stack' função (encontrado no menu 'Imagem', sob o sub-menu Stacks).
  5. Delinear uma célula usando a ferramenta de seleção à mão livre, certificando-se de incluir toda a célula, mas tão pouco área externa da célula possível.
  6. Medir os seguintes parâmetros: 'Área, Densidade Integrada "e" Média Cinza Valor'. Selecione os parâmetros usando a função "Definir Medidas", localizado no menu "Analisar".
    NOTA: Densidade integrada corresponde à soma de todas as intensidades de pixel dentro da região seleccionada, e a média Cinzento valor corresponde a [Densidade integrada / Área], o qual corrige os valores de intensidade para o tamanho da célula.
  7. Abra o "ROI Manager 'localizado no menu" Analisar ", na sub-menu" Ferramentas ". Na janela de ROI Manager, clique no botão "Adicionar" para entrar na regio em destaquen como uma nova região de interesse (ROI).
  8. Repita os passos 5.4 através de 5.6 para as células restantes na imagem. Excluir quaisquer células mortas, como avaliadas pelo brightfield / DIC e fluorescência (células mortas aparecem mais escuras em imagens DIC, e ter sinal citoplasmática autofluorescente quando visto com GFP excitação / emissão; veja a Figura 2F), e quaisquer células que tocam a borda da imagem. Salvar as ROIs selecionadas como um arquivo .zip, clicando no botão 'Mais' na janela 'ROI Manager' e exportar todas as medições para uma planilha ou software de análise estatística.
  9. Para a quantificação de ensaios cinéticos (Protocolo 3), delinear e medir uma célula a partir do ponto inicial de tempo, tal como descrito nas etapas 5.4 e 5.5. Utilizar o mesmo ROI para a medição de todos os pontos de tempo subsequentes no experimento.
  10. Para os ensaios de endpoint (protocolos 2 e 4), medida de um mínimo de 30-50 células para cada condição. Realizar quantificação por pelo menos 2-3 imagens, e inclui todas as células em cadaimagem que atender aos critérios descritos no passo 5.8 na análise.
  11. Avaliar a significância estatística entre as amostras utilizando ANOVA de uma via, seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey para análise post hoc.

6. Análise da População de Mup1-pHluorin Endocytosis por citometria de fluxo

  1. Inocular 2-3 colónias de células de levedura (cerca de 2 mm de diâmetro por colónia) em 0,5 ml de meio YNB sem metionina e amino ácidos adicionais ou de nutrientes para a manutenção da selecção do plasmídeo. Cultivar células em tubos de 5 ml de fundo redondo durante 16-24 h a 30 ° C num tambor de rolos.
  2. Adicionar 1,5 ml de meio YNB que faltam os ácidos aminados e metionina adicional ou nutrientes para a manutenção do plasmídeo, e crescer a 30 ° C durante mais 3 horas num tambor de rolos.
  3. Transferir 1 ml de células em cada um de dois tubos de 5 ml de fundo redondo. Adicionar 0,25 ml de meio YNB -Met para o primeiro tubo (condição -Met), e 0,25 ml de meio YNB contendo 100 ug/ Ml de metionina para o segundo tubo para se obter uma concentração final de 20 metionina ug / ml (estado + Met). Incubar as células a 30 ° C durante 45 minutos num tambor de rolos.
  4. Analise as células por citometria de fluxo, a selecção de dispersão para a frente (FS) como uma medida do tamanho da célula, e Mup1-pHluorin intensidade de fluorescência a partir de um filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) como uma medida da internalização de carga.
  5. Utilizar os botões de controle deslizante para ajustar a tensão dos canais FITC e FS para optimizar a detecção para a gama de tamanho e intensidade de fluorescência das células de levedura a ser utilizado (para estas experiências, foram utilizadas configurações de 50 V para o FS e 400 V para FITC).
    NOTA: Tensão para ambos os canais irá variar dependendo do citómetro de fluxo a ser utilizado. Este passo deve ser feito antes ou durante o tratamento de 45 min com metionina (passo 6.3).
  6. Meça FS e intensidade de fluorescência para 10.000 células de cada estado, usando a configuração de caudal elevado. Gerar um gráfico de dispersão de FS contra fluorescência intensidade: clique em "adicionar gráfico", selecione FITC (eixo-x) e FS (eixo y), e gráfico 1.000 pontos (o software irá exibir valores para 1000 células, mesmo que 10.000 células foram medidos).
    NOTA: Para manter a consistência máxima, analisar células 45-50 min após a adição de metionina; para experiências que envolvem um grande número de amostras, escalonar adição de metionina para acomodar o tempo necessário para a análise de citometria de fluxo.
  7. Incluem condições Met e + reuniram-se para células do tipo selvagem (WT) como controle. Usando a função de porta, atribuir uma porta vertical, utilizando a condição WT + Met, de tal modo que cerca de 5% das células brilhantes cair para a direita do portão. Utilize este gating para todas as outras condições do experimento.

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Resultados

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Localização de estado estacionário e quantificação da proteína carga endocítica constitutivamente internalizado Ste3

Para demonstrar que as cargas pHluorin-tag pode ser utilizada para a quantificação de endocitose em células vivas, a localização de GFP quimérico e fusões pHluorin com a cauda citoplasmática de terminal-C de Ste3, o receptor de feromonas do factor A em levedura, foram comparados. Ste3 é um recep...

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Discussão

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Aplicações de pHluorin para quantificação de eventos de endocitose em células de levedura faz uso de cargas transmembranares em que o marcador fluorescente está fundido com a cauda citoplasmática da proteína (Figura 1A). Para os ensaios aqui descritos, as cargas são fluorescentes brilhantemente quando a etiqueta pHluorin é exposta a ambientes neutros, mas tornar-se temperada, quando a etiqueta encontra pHluorin condições ácidas. Assim, uma carga endocítica pHluorin-etiquetado é facilmente detectada na f...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer a Gero Miesenböck e Tim Ryan por compartilharem o cDNA de pHluorina usado para gerar reagentes neste estudo, Nathan Wright, Joanna Poprawski e Lydia Nyasae pela excelente assistência técnica, membros do laboratório de Wendland por discussões úteis e Michael McCaffery e Erin Pryce do Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) por aconselhamento e assistência com microscopia e citometria de fluxo. Este trabalho foi apoiado por doações do National Institutes of Health (para BW, GM60979) e da National Science Foundation (para BW, MCB 1024818). K.W. foi apoiado em parte por uma bolsa de treinamento do National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. foi apoiado por fundos de desenvolvimento do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Duquesne e da bolsa CAREER da National Science Foundation 553143.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AdeninaSigmaA8626-25GUso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
Bacto-ágarFisherBP1423-2Uso para preparação de mídia de placa
BD Difco Yeast Nitrogen Base (sem aminoácidos)BD291920Uso para preparação de mídia líquida e de placa
Concanavalina ASigmaC5275-5MGUso para revestimento de câmara slides
DextroseFisherBP350-1Uso para preparação de meios líquidos e em placas
L-HistidinaFisherBP382-100Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-LeucinaAcros125121000Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-LisinaFisherBP386-100Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-MetioninaFisherBP388-100Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-TriptofanoFisherBP395-100Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
L-TirosinaAcros140641000Uso para preparação de mistura de aminoácidos
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8 poços)Thermo Scientific155411Uso para ensaios cinéticos e finais de internalização de Mup1-pHluorin
UracilSigmaU0750-100GUso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque
Microscópio invertido Axiovert 200Carl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Lente Objetiva de Imersão em Óleo CarlZeiss A objetiva Carl Zeissdeve ser 100X, 1.4NA ou superior
SensicamCooke CorporationA câmera deve ter faixa dinâmica de 12 bits ou superior
X-Cite 120PC Q Fonte de iluminaçãoExcelitas Technologies
Software Slidebook 5Intelligent Imaging Innovations
Software ImageJ NationalInstitutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/

Referências

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pHluorinEndocytosisFluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

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