Artigo de método

Um sensor baseado em Polianilina de Ácidos Nucleicos

DOI:

10.3791/54590

⸱

1 de novembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

Neste artigo

Resumo

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Os ácidos nucléicos são analitos comuns para avaliar sistemas biológicos; no entanto, o viés da manipulação enzimática pode causar preocupação. Aqui é descrito um método para detecção sem marcação de ácidos nucléicos usando polianilina. Essa tecnologia de sensor sensível e econômica pode distinguir diferenças de nucleotídeo único entre moléculas.

Resumo

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A detecção de ácidos nucléicos está no centro das tecnologias de diagnóstico usadas na pesquisa e na clínica. As abordagens padrão usadas nessas tecnologias dependem de modificações enzimáticas que podem introduzir vieses e artefatos. Um elemento crítico das plataformas de detecção de próxima geração será o sensoriamento molecular direto, evitando assim a necessidade de amplificação ou rótulos. Os nanomateriais avançados podem fornecer as modalidades químicas adequadas para realizar sensores sem rótulos. Os polímeros conjugados são ideais para sensoriamento biológico, possuindo propriedades compatíveis com biomoléculas e exibindo alta sensibilidade a mudanças ambientais localizadas. Neste artigo, é apresentado um método para detecção de ácidos nucléicos utilizando o polímero eletrocondutor polianilina. Oligonucleotídeos simples de "sonda" de DNA complementares aos ácidos nucléicos alvo são ligados eletrostaticamente ao polímero, criando um sistema de sensor que pode diferenciar diferenças de nucleotídeo único nas moléculas-alvo. Fora da natureza específica e imparcial dessa tecnologia, ela é altamente econômica.

Introdução

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Os polímeros conjugados fornecem muitas opções para sensores moleculares. Isso inclui respostas fluorescentes, eletrônicas e colorimétricas1. Tem havido muitos esforços para incorporar polímeros conjugados em sensores de ácido nucleico. No entanto, a maioria dos sistemas requer detecção secundária, limitando as opções de detecção2. Recentemente, relatamos uma plataforma de sensor baseada em polímero conjugado construída em polianilina (PANI) que explora as propriedades desse polímero, criando um sistema livre de rótulos3. PANI é um polímero eletroativo extensivamente conjugado com propriedades como fluorescência e resistência que são adequadas para medir sistemas biológicos4. Os éxcitons dentro da estrutura não estão localizados, levando à mobilidade da carga positiva entre as subunidades monoméricas. Isso fornece uma estrutura flexível de cargas positivas que podem interagir com a espinha dorsal carregada negativamente do DNA5,6. É importante ressaltar que o DNA ligado eletrostaticamente é orientado de tal forma que as bases nitrogenadas podem participar do emparelhamento de bases. A associação com o DNA altera as propriedades eletrônicas da PANI, um efeito que pode ser potencializado pela irradiação UV (Figura 1)3. Usando este sistema, oligonucleotídeos complementares aos ácidos nucléicos alvo podem ser imobilizados em PANI. Vários estudos demonstraram que, após a hibridização, os oligonucleotídeos adsorvidos eletrostaticamente se dissociam do PANI ou de outras matrizes catiônicas devido a alterações conformacionais causadas pela mudança para uma estrutura de DNA de fita dupla3,5,7.

Em um sistema de sensor onde a fixação da sonda modula as propriedades do polímero conjugado, os eventos de hibridização podem ser transduzidos sem rótulos ou modificação enzimática de sondas ou ácidos nucléicos alvo. Os polímeros conjugados oferecem grande flexibilidade nos métodos de detecção, um dos quais é a fluorescência. Através do monitoramento da fluorescência PANI, concentrações de ácidos nucléicos alvo tão baixas quanto 10-11 M (10 pM) podem ser detectadas3. A detecção é rápida, ocorrendo dentro de 15 minutos após a hibridização, e específica onde uma única incompatibilidade em uma molécula alvo pode ser diferenciada3.

A fabricação de sensores PANI é direta. Pode-se gerar PANI de alto peso molecular que é bem disperso em água usando procedimentos de síntese padrão envolvendo monômero de anilina, surfactante e adição controlada de um oxidante. O rendimento pode ser muito alto e o oxidante não reagido é removido por lavagem com água, garantindo que não haja mais crescimento de PAN. A associação PANI-sonda ocorre espontaneamente após a mistura, e a formação do complexo é aumentada pela exposição leve aos raios UV. A hibridização pode ser realizada imediatamente e as alterações na fluorescência PANI testadas após uma curta incubação. A simplicidade dessa tecnologia a torna altamente acessível a muitos laboratórios.

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Protocolo

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1. processável PANI Síntese

  1. Dissolve-se anilina (1 ml, 11 mmol) completamente em 60 ml de clorofórmio num balão de 250 ml de fundo redondo. Agita-se a 600 rpm durante 5 min e arrefecer a 0-5 ° C com gelo. Isso normalmente leva 15-20 min (Figura 2A).
  2. Adicionar sulfonato de sódio dodecil benzeno (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) para a solução de anilina em um balão de fundo redondo, enquanto se agitava a 600 rpm.
  3. Dissolver persulfato de amónio (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) em 20 ml de água e adicionar tudo isso gota a gota ao longo de 30 min para evitar o superaquecimento da reação.
  4. Efectua-se a reacção a 0-5 ° C durante 24 h, e permitir-lhe atingir a temperatura ambiente durante mais 24 h.
  5. Observe-se a mistura de reacção inicialmente transformar branca leitosa após 15 min, em seguida, castanho escuro após 2 horas, e, finalmente, para verde escuro após 24 h (Figura 2B-F).
  6. Filtra-se a solução PANI-NaDBS com um funil de Buchner. Misturar com 80 ml de clorofórmio e 120 ml de água, em queeparation funil (Figura 2G).
  7. Incubar a solução durante 24 horas à temperatura ambiente e recolher o PANI verde escuro a partir do funil de separação, deixando NaDBS que não reagiram e APS no sobrenadante aquoso.

2. A mistura PANI-sonda e irradiação UV

  1. Diluir solução PANI 10x com clorofórmio-água (1: 3 v / v) e misturar 200 ul de PANI diluída com 6,4 pmol de oligonucleótidos de DNA sonda por agitação suave durante 15 min num tubo de microcentrífuga.
  2. Irradiar a solução de ADN com 1.200 PANI μJ / cm 2 de UV em um reticulador durante 2 min. É crítico que a exposição UV é limitado ao valor indicado. A exposição prolongada à radiação UV compromete a mudança de fluorescência no PANI, provavelmente devido à ligação covalente cruzada de PANI e ADN.
  3. complexos por centrifugação a 17000 xg durante 6 minutos, e lava-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Sedimentar novamente, e re-suspensão em PBS.

3. Hybridization de PANI-sonda

  1. Adicionar 8 uL de 100 uM oligonucleótidos de ADN complementares ou ácidos nucleicos alvo com 200 ul de complexos PANI-sonda.
  2. Realizar hibridação por mistura de balanço solução durante 15 min a 40 ° C.
  3. Agregar as complexos PANI por centrifugação a 17000 xg durante 6 min. Lavar com PBS e re-suspensão em água.

4. Emissão constante Medição Estado de fluorescência

  1. Adicionar PANI de diferentes tratamentos para uma microplaca de 96 poços e medir a emissão de fluorescência na gama de 270-850 nm por excitação a 250 nm. Um pico de emissão para PANI devem ser observadas cerca de 500 nm.

5. Medição da Microscopia de Fluorescência duplex hibridado

  1. Gota revestimento PANI sobre uma lamela de vidro de borosilicato e seco a 40 ° C durante 48 h.
  2. Adicionar sonda (8 uL de 100 uM) num filme de PANI e secou-se irradiar com luz UV (1200 μJ / cm2 ) durante 2 min.
  3. Lava-se a película PANI-sonda com PBS e seco a 40 ° C durante 48 h.
  4. Realizar a hibridação durante 15 min pela adição de ácidos nucleicos alvo. Esta poderia ser uma amostra biológica, ou um oligonucleótido alvo de controlo (8 uL de 100 uM). Siga com uma lavagem PBS.
  5. Obtenção das imagens fluorescentes em aumento de 40 vezes, com um filtro de passagem longa de 500 nm.

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Resultados

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Figura 2A capta a configuração de reacção no início do processo de polimerização, isto é, antes da adição APS. A formação de micelas é o passo inicial na reacção de síntese de processo de PANI ocorre na interface micelar. A Figura 2B mostra uma solução leitosa após 5 min. 30 min após a APS é adicionada a reacção se vira para uma cor ligeiramente castanha. A Figura 2C mostra a alteração de cor associada com a formação de oligómer...

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Discussão

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Um sensor baseado em ácidos nucleicos de PANI requer a solubilização do polímero em água, a fim de interagir com o DNA e RNA. A dispersão de PANI em água é realizada usando tensioactivos, formando micelas, como relatado previamente 8. Além dos NaDBS utilizados aqui outros agentes tensioactivos aniónicos, como éster de dodecilo de ácido 4-sulfophthalic, tensioactivos não iónicos tais como etoxilato de nonil-fenol, ou tensioactivos catiónicos como brometo de cetiltrimetil amónio também pode ser utilizado para a...

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Divulgações

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O trabalho foi apoiado pela Faculdade de Ciência e Tecnologia da Universidade do Sul do Mississippi e pela Faculdade de Ciência e Tecnologia do Mississippi e pelo programa INBRE do Mississippi (Prêmio Número P204M103476 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais).

Agradecimentos

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Os autores não têm nada a divulgar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anilina Fisher Scientific A7401-500 ACS, líquido, refrigerado
Peroxidissulfato de amônioFisher Scientific A682-500 ACS, cristalino
Dodecilbenzeno sulfonato de sódioPfaltz & Bauer D56340 95% sólido
ClorofórmioFisher Scientific MCX 10601 líquido
Primers de DNAMWG operonn/asequência de DNA personalizada ~20 
bps Microplaca Científica dos EUA1402-9800 96 bem, polipropileno, pois não é reativo ao clorofórmio
Filme Adesivo MicroplateUSA Scientific 2920-0000Reduz a contaminação poço a poço, derramamento de amostras e evaporação
Tampa de Vidro para MicroscópioFisher Scientific 12-544-D PANI revestido em vidro de cobertura irradiado UV
Reticulador UV UVP HL-2000 Energia: X100 μ J/cm2; Tempo: 2 min
Forno de HibridizaçãoVWR01014705 TTemperatura: 400  ° C; com balanço por 15 min
Aparelho de vidro Cantilde fundo redondo de três pescoços da Fisher Scientific para reação; funil de queda, rolhas, condensador, funil de separação
Leica IMC S80Ampliação 20X; Pseudo cor 536 nm; Exposição 86 mseg; Ganho 1,0x; Gamma 1.6
Microplate ReaderMolecular Devices 89429-536
Microscópio Leica Microsystems 

Referências

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  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
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