A Facile e Eco-friendly rota para fabricar poli (ácido láctico) Scaffolds com Graded Pore Tamanho

Resumo

Neste trabalho, scaffolds de poli(ácido lático)/polietilenoglicol (PLA/PEG) foram preparados usando uma combinação de mistura de fusão e lixiviação seletiva. O método aqui discutido permitiu desenvolver andaimes de três camadas, controlando altamente a porosidade e o tamanho dos poros. As propriedades mecânicas também foram avaliadas em ambiente fisiológico.

Resumo

Nos últimos anos, os andaimes funcionalmente graduados (FGS) ganharam um papel crucial na fabricação de dispositivos para engenharia de tecidos. A importância deste novo campo de pesquisa em biomateriais deve-se à necessidade de desenvolver implantes capazes de mimetizar a complexa funcionalidade dos vários tecidos, incluindo uma mudança contínua de uma estrutura ou composição para outra. Neste último contexto, um tópico de maior interesse diz respeito ao projeto de scaffolds apropriados para o tecido de interface osso-cartilagem. Neste estudo, andaimes de três camadas com tamanho de poro graduado foram obtidos pela mistura de poli(ácido lático) (PLA), cloreto de sódio (NaCl) e polietilenoglicol (PEG). As distribuições de tamanho de poros foram controladas por granulometria de NaCl e solvatação de PEG. Os andaimes foram caracterizados do ponto de vista morfológico e mecânico. Foi encontrada uma correlação entre o método de preparo, a arquitetura dos poros e o comportamento mecânico compressivo. A força de adesão da interface foi avaliada quantitativamente por meio de um teste de força interfacial personalizado. Além disso, a fim de imitar a fisiologia humana, testes mecânicos também foram realizados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C. O método aqui apresentado proporciona um alto controle de porosidade, distribuição de tamanho de poros e desempenho mecânico, oferecendo assim a possibilidade de fabricar andaimes de três camadas com propriedades personalizadas, seguindo uma rota simples e ecológica.

Introdução

O interesse por polímeros biodegradáveis tem crescido em importância nos últimos anos, tanto na academia quanto na indústria, devido às crescentes preocupações com os resíduos plásticos e à redução do uso de fontes não renováveis^1-7. Em particular, polímeros sintéticos biocompatíveis e biodegradáveis são difundidos em vários campos de aplicação biomédica, como liberação controlada de drogas^8,9, fios de sutura absorvíveis^8,10, intensificação de bioprocessos¹¹ e engenharia de tecidos¹².

A engenharia de tecidos se concentra no desenvolvimento de dispositivos capazes de restaurar e manter a função normal em tecidos doentes ou lesionados. A maioria dos tecidos nativos é composta por diferentes tipos de células e matrizes extracelulares (ECMs) em hierarquias espaciais específicas. Por exemplo, a cartilagem articular (AC) consiste em diferentes zonas com vários tipos e orientações de fibras de colágeno e proteínas de ligação ao colágeno. Além disso, cartilagem e osso apresentam estruturas hierárquicas significativamente diferentes. Nesse contexto, a preparação de scaffolds multicamadas com propriedades de engenharia em cada camada poderia permitir a substituição de tecidos heterogêneos, levando em consideração todos os microambientes locais desses sistemas complexos^13,14.

Com base nas características celulares/biológicas e/ou físico-químicas dos scaffolds, as principais estratégias adotadas pela engenharia de tecidos podem ser divididas em monofásicas, bifásicas e trifásicas. As abordagens bifásicas e trifásicas (BTA) usam duas ou três arquiteturas de poros, materiais ou cargas diferentes para preparar dispositivos funcionais multicamadas. Além disso, um único material pode ser usado para obter dispositivos bifásicos ou trifásicos, desde que seja possível criar um gradiente em suas propriedades físicas¹².

A migração celular desempenha um papel fundamental na morfogênese, inflamação, cicatrização de feridas e metástase tumoral. O movimento celular é incentivado pela presença de um gradiente de propriedades físico-químicas da superfície ao núcleo do dispositivo. Portanto, os biomateriais que atendem aos requisitos discutidos acima podem ser úteis no estudo da migração celular. Além dos gradientes químicos que desencadeiam a migração celular (quimiotaxia), as propriedades mecânicas do substrato de cultura de células também podem levar ao movimento celular (mecanotaxia)¹⁵.

A estrutura multicamadas também pode fornecer a liberação ajustável de medicamentos específicos incorporados à matriz polimérica, alterando a área específica da camada ou a quantidade de medicamentos carregados.

Na última década, com o objetivo de desenvolver scaffolds com gradiente discreto ou contínuo de propriedades morfológicas, como porosidade ou tamanho de poros, várias abordagens foram^{apresentadas16-31}. Os trabalhos mais recentes enfocaram a preparação de BTA adotando: lixiviação de partículas ^12,28,32, técnica de espuma de gás¹⁶, eletrofiação^17-19, técnica de fundição camada por camada²⁰, prototipagem rápida^21,22, separação de fase induzida termicamente (TIPS)²², liofilização por centrifugação^24,25, superfícies mínimas triplamente periódicas (TPMS)²⁶, fundição por congelamento^27-30.

No âmbito deste trabalho, apresentamos uma rota rápida e simples para obter andaimes porosos de três camadas (TLS) baseados em PLA, combinando mistura de fusão, moldagem por compressão e lixiviação de sal. Diferentemente da maioria das tecnologias comumente utilizadas para a produção de andaimes, a estratégia aqui adotada pode ser considerada totalmente ecologicamente correta, uma vez que não requer nenhum solvente tóxico potencialmente perigoso para o meio ambiente e para células e tecidos vivos³². As relações básicas de processamento-estrutura-propriedade estabelecidas neste estudo, analisando as características morfológicas e o comportamento mecânico dos dispositivos fabricados, fornecem orientação para futuros avanços no projeto de andaimes graduados multifuncionais com propriedades específicas do alvo.

Protocolo

Fabrication 1. Andaime

1. Moer NaCl em um misturador de laboratório durante 20 minutos e secá-lo numa estufa a 100 ° C.
2. Coloque a NaCl secou-se (45 g de cada vez) em uma máquina de crivagem durante 30 minutos a mais alta frequência disponível sem que ocorre em ressonância. Recolha fracções de sal seis, que vão desde 500 um a 1000 um (M 500); a partir de 300 um a 500 um (M 300); a partir de 100 um a 200 um (M 100); a partir de 90 um a 100 (M 90); a partir de 45 ^ m a 65 | iM (H 45) e, finalmente, 10 M com partículas de sal tamanho menor do que 45 um, como esquematizado na Figura 1.
3. Aspirador de secar durante a noite todos os materiais, a fim de evitar a cisão hidrolítica durante o processamento. Para cada material, a escolha da temperatura, a fim de maximizar o grau de secagem sem superar - no caso dos polímeros - o de transição vítrea. Por conseguinte, escolher T = 90 ° C durante PLA e T = 25 ° C durante PEG, T = 105 ° C durante NaCl.
4. AlimentaçãoPLA, PEG e NaCl, com uma composição em percentagem de peso de 20/5/75, respectivamente, a um misturador de operação em lotes a T = 190 ° C e n = 60 rpm e então processá-las até atingir um valor constante de torque, geralmente após cerca de 10 minutos. Depois disso, recolher rapidamente o material resultante.
5. Preparar as mono-camadas, utilizando uma prensa de laboratório operando a 210 ° C, colocar as misturas em moldes cilíndricos adequadas com um diâmetro de 10 mm e uma altura de 3 mm e mantê-los durante 60 segundos à pressão ambiente e 3 minutos a 180 bar . Em seguida, arrefecer as misturas à temperatura ambiente, mantendo a pressão de 180 bar.
6. Montagem de três camadas através de moldagem por compressão
   1. Preparar cada camada simples da mesma maneira que a descrita no (1,5), mas utilizando diferentes moldes, isto é, tendo um diâmetro de 10 mm e uma altura de 1 mm. Finalmente, obter 6 discos com um diâmetro de 10 mm e uma altura de 1 mm, contendo seis tamanhos de partículas diferentes: M 500, M 300, M 100,
   2. foR montagem de três camadas andaime Um TLS (A), se acumulam M 500, M 300 e H 100 no interior do molde cilíndrico e compressão-moldá-los em uma prensa de laboratório operando a 210 ° C durante 60 segundos à pressão ambiente e 3 minutos a 180 bar e, em seguida, arrefecida até à temperatura ambiente, mantendo a pressão de 180 bar.
      NOTA: Prepara-se o TSL B pelo empilhamento de um sobre o outro H 90, H 45 e H 10 nos mesmos moldes e realizar a operação de moldagem por compressão, seguindo o mesmo procedimento que o utilizado para TLS A.
7. Retire os discos a partir dos moldes cilíndricos e colocá-los em uma desmineralizada de ebulição banho-maria, sem agitação. 3 horas depois, remover as estruturas porosas resultantes do banho e deixa-os secar durante 12 horas à temperatura ambiente numa hote química.

2. Análise morfológica

1. Avaliar as morfologias dos andaimes por microscopia eletrônica de varredura.
   1. Quebrar as amostras em azoto líquido e, em seguida, anexar oamostras em um stub de alumínio usando uma fita adesiva de carbono. Finalmente, por pulverização catódica com ouro-coate durante 90 s sob uma atmosfera de árgon antes de imagem, a fim de evitar uma descarga electrostática durante o ensaio.

3. Andaime de tamanho de poro

1. Elaborar as imagens obtidas por análise de SEM com um software de processamento de imagem capaz de reconhecer a distribuição do tamanho dos poros do andaime.
   NOTA: Neste trabalho a análise da distribuição de tamanho dos poros foi realizado usando um software baseado em MATLAB descrito anteriormente ³³

4. A porosidade

1. Pesar as amostras antes da lixiviação e avaliar a porosidade teórica de acordo com a seguinte expressão:
   
   NOTA: M de _NaCl, m e m _{PEG PLA,} são, respectivamente, a massa teórica de NaCl, PEG, e PLA, assumindo por misturas homogéneas. Tele densidades (ρ) de NaCl, e PLA PEG são, respectivamente, 2,16 g / cm ^3, 1,12 g / ^cm3 e 1,24 g / cm ^3.
2. Pesar as amostras após a lixiviação e a secagem, a fim de avaliar a densidade aparente das amostras (ρ _andaime), e depois avaliar a porosidade real como o recíproco da relação entre a densidade aparente do andaime e a densidade da não-porosa PLA pela utilizando a expressão (2).
   NOTA: É expressa a relação entre o volume vazio do andaime e o volume total do andaime (Vazio + completo).
   

5. Propriedades Mecânicas

1. Testar as amostras de acordo com o modo de compressão utilizando uma máquina de tracção, equipado com uma célula de carga de 1 kN. Definir uma taxa de tensão constante de 1 mm, min ^-1.
2. A fim de investigar o desempenho mecânico das amostras em meio fisiológico, equipar o dynamometeR com um banho contendo (PBS), (pH = 7,4) a 37 ° C e realizar o teste com a mesma configuração que o descrito no ponto 5.1.
   1. Antes de cada medição em ambiente molhado, embeber as amostras com PBS num balão de vácuo durante 5 minutos, a fim de deixar PBS encher todos os poros. Em seguida, permitir que os andaimes para permanecer em PBS a 37 ° C durante 15 minutos para atingir a temperatura nominal.
3. Determinar a força de adesão interfacial (IAS) entre as camadas de TL A e B TL usando um equipamento de teste de força interfacial personalizados, ligado a uma máquina de ensaios mecânicos seguindo um método descrito na literatura ^32,34.
   1. Fixar o andaime sobre o equipamento e garantir o seu alinhamento correcto com placa de célula de carga ea base da máquina. Prenda as amostras de andaime para topos de teste de alumínio utilizando um adesivo de alta viscosidade e colocá-los no equipamento para teste.
   2. Para o teste de condição molhada, hidratar as amostras em PBS durante 1 hr priou para o teste. Usar uma célula de carga de 1 kN, sob uma carga de tracção aplicada a uma taxa de deformação de 1 mm, no mínimo ^-1.
      NOTA: Levar em conta que a falha pode ocorrer quer a resistência à ruptura de uma das camadas ou por causa de delaminação nas interfaces. Avaliar o IAS como a força máxima da curva de tensão-deformação.

Resultados

A influência de NaCl tamanho de partícula sobre a arquitectura dos poros dos andaimes foi avaliada qualitativamente e quantitativamente por investigar a morfologia das amostras e calcular a distribuição do tamanho dos poros por análise de imagem, respectivamente, Figura 2a -. F mostra micrografias de andaimes mono-camadas resultantes de sal-lixiviação de materiais com diferentes tamanhos de partículas de NaCl.

Discussão

O primeiro passo crítico é a otimização de peneiramento eficiência. O elevado controlo do tamanho de partícula de NaCl é fundamental para a preparação de andaime com distribuição de tamanho de poro desejado. Um outro passo crucial é evitar a fractura das monocamadas PLA finas durante a extracção da amostra a partir do molde. A análise de processamento de imagem pode não ser representativa de todo o dispositivo.

Durante ensaios de tracção, a amostra pode rasgar para longe do equipamento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Poli (ácido lático)	NatureWorks	PLA 2002D
Poli (etilenoglicol)	Sigma	83797-1KG-F
Cloreto de sódio	Sigma	793566-5KG-D
Solução tampão de fosfato	Sigma	P5368-10PAK
Misturador de laboratório	Brabender	PLE 330 - Plasticorder
Laboratory Press
de teste universal	Instron	3365 (Reino Unido)
BioPuls Bath	Instron, Norwood
Forno a vácuo	ISCO	NSV9035
Precision Balance	Sartorius	AX224

Máquina Sieving Machine Endecotts EVF1.