Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para fenotípica e análise quantitativa de macrófagos residentes de rins de ratos por citometria de fluxo. As células marcadas resultantes podem também ser utilizados para outras aplicações, incluindo a separação de células, a análise da expressão do gene ou estudos funcionais, aumentando, assim, a informação obtida no modelo experimental.

Resumo

Há evidências crescentes sugerindo o importante papel da inflamação e, subsequentemente, dos macrófagos no desenvolvimento e progressão da doença renal. Os macrófagos são células heterogêneas que têm sido implicadas na lesão renal. Os macrófagos podem ser classificados em dois fenótipos diferentes: macrófagos classicamente ativados (macrófagos M1), que liberam citocinas pró-inflamatórias e promovem fibrose; e macrófagos alternativamente ativados (macrófagos M2) que estão associados a funções imunorreguladoras e de remodelação tecidual. Esses fenótipos de macrófagos precisam ser discriminados e analisados para determinar sua contribuição para a lesão renal. No entanto, existem poucos estudos relatando informações fenotípicas e funcionais consistentes sobre os subtipos de macrófagos em modelos de doença renal inflamatória, especialmente em ratos. Esse fato pode estar relacionado aos marcadores limitados de macrófagos usados em ratos, ao contrário dos camundongos. Portanto, novas estratégias são necessárias para quantificar e caracterizar o conteúdo renal dessas células infiltrantes de forma confiável. Este manuscrito detalha um protocolo para digestão renal e posterior análise fenotípica e quantitativa de macrófagos de rins de ratos por citometria de fluxo. Resumidamente, os rins foram incubados com colagenase e os macrófagos totais foram identificados de acordo com a dupla presença de CD45 (antígeno comum dos leucócitos) e CD68 (marcador de macrófagos PAN) em células vivas. Isso foi seguido pela coloração superficial de CD86 (marcador M1) e CD163 (marcador M2). Macrófagos peritoneais de ratos foram usados como controle positivo para detecção de marcadores de macrófagos por citometria de fluxo. Nosso protocolo resultou em baixa mortalidade celular e permitiu a caracterização de diferentes marcadores de proteínas intracelulares e de superfície, limitando assim a perda de integridade celular observada em outros protocolos. Além disso, esse procedimento permite o uso de macrófagos para outras técnicas, incluindo classificação celular e estudos de expressão de mRNA ou proteína, entre outros.

Introdução

A doença renal é um problema de saúde global, com prevalência aumentada e associada a morbidade e mortalidade elevadas¹. Um dos mecanismos mais importantes envolvidos na progressão e desenvolvimento da lesão renal é a inflamação, desencadeada principalmente por macrófagos. Os macrófagos desempenham um papel fundamental em muitas doenças inflamatórias, incluindo distúrbios renais². Assim, uma presença elevada de macrófagos infiltrantes tem sido relatada em biópsias de pacientes com lesão renal aguda (LRA) ou doença renal crônica (DRC)^3,4. Estudos recentes sugerem que o desfecho a longo prazo da doença renal pode ser controlado por macró....

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care locais e utilizar comités sequência da Directiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu e da Orientação Nacional 53/2013.

1. Preparação de reagentes e soluções

1. Preparar todos os reagentes e soluções sob condições estéreis e utilizar sob uma câmara de fluxo laminar. Manter as soluções a 4 ° C.
2. Preparar tampão de coloração (2% de Soro Fetal Bovino (FBS) em PBS de Dulbecco 1x).
3. Preparar solução de colagenase por adição de 0,5 mg de colagenase para cada ml de solução salina.
4. Preparar a solução de anestesia de cetamina / xilazina (2: 1 v / v).

Resultados

Analisou-se macrófagos heterogeneidade num modelo inflamatório experimental de lesão renal associada com o aumento da presença de macrófagos infiltrantes no rim. Neste modelo, lesão renal foi induzida pela administração de aldosterona (1 mg kg ^{-1 -1} dia) mais sal (NaCl a 1%) na água de beber durante 3 semanas em ratos Wistar, como previamente relatado ^12.

A programação das nossas experiências é.......

Discussão

Os macrófagos são células heterogéneas que desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, incluindo doenças renais. Existe um interesse crescente na caracterização de subconjuntos de macrófagos na doença renal, porque cada sub-população de macrófagos contribui de uma maneira diferente para o desenvolvimento de lesão renal, como relatado na glomerulonefrite, nefropatia diabética e cancro renal ^14-16. Nas fases iniciais da lesão renal aguda, uma predominância de macrófagos M1 é observado, a promoção .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Capa de fluxo laminar	Mais rápido		Ou equipamento equivalente
Centrífuga	Hettich		Ou equipamento equivalente
Citômetro de fluxo (FACSAria)	BD Biosciences
Soro fetal bovino	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Colagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Filtros de citometria de fluxo	BD Biosciences	340626
Filtros de células Falcon	Thermo Fisher Scientific	352340
Tubos de citometria de fluxo	Falcon	352052	5 ml Tubos de centrífuga de fundo redondo de poliestireno
	Corning centristar	430791
Banho-maria	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 ° Solução
Fixação/Permeabilização C ou Tampão de Permeabilização/Lavagem	BD Biosciences	554714
Rompum (Xilazina)	Bayer		Ou equivalente
Ketalar (Cetamina)	Pfizer		Ou
equivalente Solução salina balanceada de Hanks	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Solução salina	Braun
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluído 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluído 35:1.000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluído 35:1.000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluído 4:100
Mancha viva/morta	Sondas Moleculares	L34955	Diluídas 3:1.000