Artigo de método

Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

DOI:

10.3791/54599

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18 de outubro de 2016

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1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para fenotípica e análise quantitativa de macrófagos residentes de rins de ratos por citometria de fluxo. As células marcadas resultantes podem também ser utilizados para outras aplicações, incluindo a separação de células, a análise da expressão do gene ou estudos funcionais, aumentando, assim, a informação obtida no modelo experimental.

Resumo

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Há evidências crescentes sugerindo o importante papel da inflamação e, subsequentemente, dos macrófagos no desenvolvimento e progressão da doença renal. Os macrófagos são células heterogêneas que têm sido implicadas na lesão renal. Os macrófagos podem ser classificados em dois fenótipos diferentes: macrófagos classicamente ativados (macrófagos M1), que liberam citocinas pró-inflamatórias e promovem fibrose; e macrófagos alternativamente ativados (macrófagos M2) que estão associados a funções imunorreguladoras e de remodelação tecidual. Esses fenótipos de macrófagos precisam ser discriminados e analisados para determinar sua contribuição para a lesão renal. No entanto, existem poucos estudos relatando informações fenotípicas e funcionais consistentes sobre os subtipos de macrófagos em modelos de doença renal inflamatória, especialmente em ratos. Esse fato pode estar relacionado aos marcadores limitados de macrófagos usados em ratos, ao contrário dos camundongos. Portanto, novas estratégias são necessárias para quantificar e caracterizar o conteúdo renal dessas células infiltrantes de forma confiável. Este manuscrito detalha um protocolo para digestão renal e posterior análise fenotípica e quantitativa de macrófagos de rins de ratos por citometria de fluxo. Resumidamente, os rins foram incubados com colagenase e os macrófagos totais foram identificados de acordo com a dupla presença de CD45 (antígeno comum dos leucócitos) e CD68 (marcador de macrófagos PAN) em células vivas. Isso foi seguido pela coloração superficial de CD86 (marcador M1) e CD163 (marcador M2). Macrófagos peritoneais de ratos foram usados como controle positivo para detecção de marcadores de macrófagos por citometria de fluxo. Nosso protocolo resultou em baixa mortalidade celular e permitiu a caracterização de diferentes marcadores de proteínas intracelulares e de superfície, limitando assim a perda de integridade celular observada em outros protocolos. Além disso, esse procedimento permite o uso de macrófagos para outras técnicas, incluindo classificação celular e estudos de expressão de mRNA ou proteína, entre outros.

Introdução

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A doença renal é um problema de saúde global, com prevalência aumentada e associada a morbidade e mortalidade elevadas1. Um dos mecanismos mais importantes envolvidos na progressão e desenvolvimento da lesão renal é a inflamação, desencadeada principalmente por macrófagos. Os macrófagos desempenham um papel fundamental em muitas doenças inflamatórias, incluindo distúrbios renais2. Assim, uma presença elevada de macrófagos infiltrantes tem sido relatada em biópsias de pacientes com lesão renal aguda (LRA) ou doença renal crônica (DRC)3,4. Estudos recentes sugerem que o desfecho a longo prazo da doença renal pode ser controlado por macrófagos5,6. Em resposta ao microambiente local, os macrófagos podem se diferenciar em diferentes fenótipos que desempenham diversas funções biológicas7. Dois fenótipos de macrófagos bem diferenciados foram estabelecidos: macrófagos classicamente ativados (macrófagos M1) e macrófagos ativados alternativamente (M2)8. Os macrófagos M1 promovem inflamação, enquanto os macrófagos M2 têm um papel anti-inflamatório e estão envolvidos no reparo tecidual9. Portanto, um melhor conhecimento da heterogeneidade dos macrófagos é necessário para entender sua regulação e contribuição para a patologia renal e desenvolver novas abordagens terapêuticas.

Tanto os modelos murinos quanto os de ratos têm sido amplamente utilizados para entender o mecanismo molecular e celular envolvido na lesão renal10. No entanto, existem diferenças substanciais nos diversos marcadores usados para identificar fenótipos de macrófagos entre esses roedores. Assim, vários marcadores murinos, como F4/80 ou Ly6C, não são usados em ratos, limitando assim a extrapolação dos achados entre essas espécies. Além disso, há um número limitado de marcadores que descrevem fenótipos de macrófagos em ratos, explicando os escassos estudos que analisam a heterogeneidade de macrófagos nesses animais em comparação com camundongos. Portanto, novas estratégias para a caracterização de subpopulações de macrófagos são necessárias para entender o papel dos macrófagos em modelos de doença renal em ratos.

Este manuscrito descreve um protocolo para a análise fenotípica e quantitativa de macrófagos de rins de ratos por citometria de fluxo. Essa técnica pode ser seguida por vários ensaios, incluindo classificação de células e estudos de expressão de mRNA ou proteína para permitir uma caracterização aprofundada do papel dos macrófagos na doença renal.

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Protocolo

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Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care locais e utilizar comités sequência da Directiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu e da Orientação Nacional 53/2013.

1. Preparação de reagentes e soluções

  1. Preparar todos os reagentes e soluções sob condições estéreis e utilizar sob uma câmara de fluxo laminar. Manter as soluções a 4 ° C.
  2. Preparar tampão de coloração (2% de Soro Fetal Bovino (FBS) em PBS de Dulbecco 1x).
  3. Preparar solução de colagenase por adição de 0,5 mg de colagenase para cada ml de solução salina.
  4. Preparar a solução de anestesia de cetamina / xilazina (2: 1 v / v).

2. Kidney perfusão e Extração

  1. Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina (75 mg / 12 mg / kg de peso). Cuidadosamente beliscar uma pequena dobra de pele, para verificar se o animal está suficientemente anestesiados. Em seguida, cobrir os olhos com pomada veterinário para evitar a secura e sob anestesia. Nota: 4-monTH-Ratos Wistar são utilizados neste ensaio.
  2. Uma vez que o rato é totalmente anestesiado, coloque-o sobre uma mesa cirúrgica em decúbito dorsal.
  3. Aplicar 70% de etanol para o abdômen.
  4. Faça uma incisão central através da pele abdominal e peritônio, a partir do púbis até a caixa torácica, para expor as cavidades pleural e abdominal.
  5. Injectar solução salina (0,9%) na aorta abdominal para perfundir rins utilizando um sistema de perfusão até que todo o sangue é removido a partir de rins. Corte a aorta ao nível abdominal para ajudar a liberar o sangue.
  6. Remova ambos os rins de ratos, cortando a partir do hilo renal (veia renal, artéria e ureter). Para decapsulate o rim, pressionar a borda do rim usando os dedos, separando cuidadosamente a cápsula 11.
  7. Coloque o rim em solução salina equilibrada de Hanks.

Digestão 3. Rim e suspensão de células

  1. Cortar a metade de um rim com uma tesoura em pedaços pequenos e coloque opeças em um tubo de 1,5 ml.
    Nota: Todas as seguintes concentrações são calculados para 1 amostra (rim 1/2 do rato).
  2. Adicionar 1 ml de solução de colagenase e incubar a 37 ° C durante 30 min. Misturar por inversão a cada 5 minutos para se certificar de que a solução de colagenase acessos do tecido todo.
  3. Recolher a solução e passá-la através de um filtro (40 um) com o auxílio de um êmbolo, e ressuspender-lo em 10 ml de tampão de coloração.
  4. Centrifugar a 400 xg durante 15 min.
  5. Re-suspender o sedimento em 1 ml ACK (Ammonium-cloro e potássio) Tampão de Lise. Após 1 min 30 s, à temperatura ambiente, adicionar 10 ml de tampão de coloração para parar a reacção.
  6. Centrifugar a 400 xg durante 10 min.
  7. Re-suspender o sedimento num volume adequado de tampão de coloração (1 ml) e filtrar a suspensão de células através de um filtro (30 um).
  8. Contar o número de células usando exclusão com azul de tripano num hemocitómetro e adicionar 2 milhões de células para um tubo de 1,5 mL para STAining.

4. Análise celular Coloração e Citometria de Fluxo

  1. células centrifugar a 100 xg por 5 min.
  2. Re-suspender o sedimento em 100 ul de soro de rato (diluído 1: 100) durante 10 min a 4 ° C para bloquear os receptores Fc.
  3. Lavar por adição de 1 ml de tampão de coloração e centrifugar a 100 xg durante 5 min.
  4. Misturar os anticorpos para a coloração da superfície celular em 100 ul de tampão de coloração para cada condição: CD45-APC Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) e de solução para detectar células vivas (3: 1000).
  5. Re-suspender o sedimento de células na mistura de anticorpos durante 20 min a 4 ° C no escuro.
  6. Lavar por adição de 1 ml de tampão de coloração e centrifugar a 100 xg durante 5 min. Repita este passo.
  7. Adicionar 600 ul de solução / Permeabilização de fixação durante 20 min a 4 ° C no escuro.
  8. Lavar 2 vezes com 1 ml de tampão de permeabilização / Wash e centrifugar a 170 xg durante 5 min.
  9. Adicionar o anticorpo CD68 FITC (35: 1000) para a Intracelcoloração lular de 100 ul de tampão de permeabilização / lavagem para cada condição.
  10. Re-suspender o sedimento em solução de CD68-anticorpo e incubar 50 min a 4 ° C no escuro.
  11. Lava-se com 1 ml de tampão de permeabilização / Wash e centrifugar a 170 xg durante 5 min.
  12. Re-suspender o sedimento em 100 ul de tampão de permeabilização / Lavagem, adicionar anticorpo CD86PE (35: 1000) e incubar durante 20 min a 4 ° C no escuro.
  13. Lavar por adição de 1 ml de permeabilização / tampão de lavagem e centrifugar a 100 xg durante 5 min.
  14. Re-suspender o sedimento em 100 mL de tampão de permeabilização / Wash e passá-lo para a citometria de fluxo tubo.
  15. Analisar as amostras por citometria de fluxo. Determinar coloração CD45 em células vivas fechados à luz / light forward-dispersadas-Side janela (SSC / FSC). Num segundo passo, analisar CD86 e CD163 expressão em células CD68 +.

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Resultados

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Analisou-se macrófagos heterogeneidade num modelo inflamatório experimental de lesão renal associada com o aumento da presença de macrófagos infiltrantes no rim. Neste modelo, lesão renal foi induzida pela administração de aldosterona (1 mg kg -1 -1 dia) mais sal (NaCl a 1%) na água de beber durante 3 semanas em ratos Wistar, como previamente relatado 12.

A programação das nossas experiências é...

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Discussão

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Os macrófagos são células heterogéneas que desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, incluindo doenças renais. Existe um interesse crescente na caracterização de subconjuntos de macrófagos na doença renal, porque cada sub-população de macrófagos contribui de uma maneira diferente para o desenvolvimento de lesão renal, como relatado na glomerulonefrite, nefropatia diabética e cancro renal 14-16. Nas fases iniciais da lesão renal aguda, uma predominância de macrófagos M1 é observado, a promoção ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por bolsas da FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 e PI14/00883), Sociedade Espanhola de Aterosclerose, Sociedade Espanhola de Nefrologia e Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) a Juan Antonio Moreno. FIS/FEDER financia PI14/00386 e Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica para Jesús Egido. Fundaciòn Conchita Rabago para Melania Guerrero Hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) a Alfonso Rubio Navarro.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Capa de fluxo laminarMais rápidoOu equipamento equivalente
CentrífugaHettichOu equipamento equivalente
Citômetro de fluxo (FACSAria)BD Biosciences
Soro fetal bovinoBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
ColagenaseSigma-Aldrich12/1/9001
ACK Lysing BufferThermo Fisher ScientificA10492-01
Filtros de citometria de fluxoBD Biosciences340626
Filtros de células FalconThermo Fisher Scientific352340
Tubos de citometria de fluxoFalcon3520525 ml Tubos de centrífuga de fundo redondo de poliestireno
Corning centristar430791
Banho-mariaMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° Solução
Fixação/Permeabilização C ou Tampão de Permeabilização/LavagemBD Biosciences554714
Rompum (Xilazina)BayerOu equivalente
Ketalar (Cetamina)PfizerOu
equivalente Solução salina balanceada de HanksSigma-AldrichH8264-500ML
Solução salinaBraun
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Diluído 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITCBio-RADMCA341FDiluído 35:1.000
anti-CD86 (clone: 24F) PEBiolegend200307Diluído 35:1.000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RDiluído 4:100
Mancha viva/morta Sondas MolecularesL34955Diluídas 3:1.000
de 622415

Referências

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  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
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