Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Resumo

As gravações de patch-clamp subcelulares oferecem a possibilidade de investigar as propriedades funcionais dos dendritos. No entanto, essas estruturas finas não são facilmente acessíveis devido ao seu pequeno diâmetro. O protocolo aqui descrito visa facilitar a coleta de gravações estáveis e confiáveis dos dendritos dos neurônios dopaminérgicos em fatias in vitro.

Resumo

Dendrites dos neurónios dopaminérgicos receber e transmitir entrada sináptica, suporte potencial de ação back-propagação e liberação de neurotransmissores. Entender essas funções fundamentais irá lançar luz sobre a transferência de informações nestes neurônios. Dendríticas gravações de patch-clamp prevê a possibilidade de examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e canais de iões dependentes da voltagem subjacentes. No entanto, estas estruturas finas não são facilmente acessíveis para pipetas de patch por causa do seu pequeno diâmetro. Este relatório descreve um procedimento passo-a-passo para recolher gravações estáveis ​​e fiáveis ​​a partir dos dendritos de neurônios dopaminérgicos em fatias aguda. Medidas eletrofisiológicas são combinados com a recuperação post hoc da morfologia celular. experiências bem sucedidas dependem melhorado de preparação de fatias, soluções e pipetas, um ajuste adequado da óptica e estabilidade da pipeta em contacto com a estrutura gravada. princípios padrão de somatic gravação de patch-clamp são aplicados aos dendritos, mas com uma abordagem mais suave da pipeta. Estas técnicas versáteis podem ser implementadas para abordar várias questões relativas às propriedades excitáveis ​​de dendrites.

Introdução

Os neurónios receber informações sináptica predominantemente nas suas dendrites. Excitatórios e sinais inibitórios sinápticas espalhados do seu local de produção para o local de integração onde potenciais de acção (APs) são evocadas como o sinal de saída. Em seu caminho, potenciais sinápticos são influenciados tanto pela estrutura dos dendritos e da interação entre propriedades da membrana passivos e ativos. A combinação destes parâmetros altamente variáveis aumenta o poder computacional de neurónios ^1,2. No entanto, o pequeno diâmetro de dendritos dificulta no entanto, o estudo das suas propriedades eléctricas. O contínuo desenvolvimento da técnica de patch-clamp ^3, a óptica ⁴ e aperfeiçoamento de métodos para a preparação fatia ⁵ durante as últimas décadas têm permitido gravações de muito fina (0,7-3 mm Ø) dendrites ^6,7. Estes métodos eram, e são, em grande parte, ainda usado para examinar a excitabilidade dos dendritos em uma varieneurônios F ^8. Gravações dendríticas diretos são essenciais para determinar a distribuição ^9-19 e as diferenças nas propriedades funcionais ^20-22 de canais iônicos em compartimentos neuronais distintas. Estes dados são o complemento necessário das distribuições de canais de iões detectados com imunohistoquímica combinada à luz e microscopia eletrônica ^23,24. Gravações somatodendríticos dupla têm sido implementadas para explorar a propagação dos potenciais de ação ^{9,13-15,21,22,25-27} e disseminação de potenciais sinápticos ^13,16,18 ao longo do domínio somatodendrítico de neurônios, obtenção de modelos de cabos passivos detalhados ^{28- 30} e investigar a resolução temporal de integração neuronal ^31.

A substância negra (SN) é uma região localizada no meio do cérebro envolvida em várias funções, tais como o controlo do movimento, a codificação de recompensa e comportamentos habituais. A diminuição de dopamina devido à específicaperda de dopaminérgicos (DA) neurónios no SN está associado com os distúrbios motores observadas em pacientes que sofrem de doença de Parkinson ^32. O circuito nigral é composto por dois tipos de células principais: dopaminérgicos e GABAérgicos neurónios. Curiosamente, esses neurônios têm várias características específicas que os distinguem de outros neurônios. O axônio de uma grande proporção de neurônios DA e alguns neurônios GABA origina de um site dendrítica, indicando que o mandril dendrítica é heterogênea (axônio-rolamento e dendrites-falta axônio) ^25,26,33. A morfologia desses neurônios contrasta, por conseguinte, com a organização típica de neurônios em que a transferência de informações segue a lei da polarização dinâmica emitida por Cajal: a partir de dendrites, a soma e, finalmente, para axônio ^34. Neurónios DA também são conhecidos para a libertação de dopamina a partir de suas dendrites ^35, gerar actividade de rotura ³⁶ e ³⁷ plasticidade NMDA-receptor. a dissecçãoção desses fenômenos é evasivo, sem gravações directos a partir do local onde eles são iniciados. Para obter conhecimentos sobre a relação entre a localização precisa e propriedades funcionais dos canais de iões e o seu papel na excitabilidade e informações dendrítica transferência em neurónios da substância negra, gravações dendríticas directos são o método de escolha.

Este relatório descreve um procedimento detalhado que pode ser usado para obter gravações de patch-clamp simples e dupla de dendrites dos neurónios da substância negra eo hoc biocitina rotulagem lugar correspondente. Os princípios básicos para remendar o somático e da membrana dendrítica são muito semelhantes. Praticamente no entanto, as gravações de sites dendríticas requerem otimização específica em comparação com gravações somáticas. gravações dendríticas sucedidas dependem da qualidade das fatias, ajuste ideal da óptica, abordagem suave da pipeta patch e estabilidade das gravações.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais aqui descritos seguir as orientações institucionais e nacionais, as directivas da União Europeia para a Protecção dos Animais e das orientações da Federação da Associação Ciência Animal Laboratório Europeu.

1. Preparação das soluções

1. Líquido cefalorraquidiano artificial padrão (ACSF; Tabela 1)
   1. Use sais de alta pureza ³⁸ e copos de vidro limpo previamente lavado com água bidestilada para preparar uma nova solução. Use de alta qualidade de água bidestilada para a preparação de todas as soluções extra e intracelulares.
   2. Tome de 2 L proveta para dissolver de NaHCO ₃ em 500 mL de água e o outro para dissolver os outros sais, a fim de evitar a precipitação de iões divalentes ³⁹ de acordo com a Tabela 1. Limpar a espátula sistematicamente com água duplamente destilada e secá-lo antes de tomar um seu sal . Usar um agitador magnético para homogeneizar dissolution. Adicionar as soluções de ambos os copos para um balão volumétrico apropriado e levar ao volume apropriado.
   3. Assegure-se que a solução extracelular final é totalmente transparente e sem qualquer vestígio de precipitação.
   4. Aplicar uma mistura gasosa constituída por 95% de _O2 e 5% de CO ₂ (gás carbogénio) com uma vela de microfiltro de vidro (Ø 13 mm) 20 - 30 minutos antes da perfusão as fatias ^38,40. controlar cuidadosamente a osmolaridade (2 - 3 medições consecutivas) do ACSF com um osmómetro (gama óptima: 314-325 mOsmol / L). Guardar a solução remanescente depois da preparação a 4 ° C e usá-lo dentro de 3 dias.
2. Solução de corte (sacarose-ACSF; Tabela 2) ^5,13
   1. Preparar 3 L de solução fresca. Use 1 L para preparar fatias de cérebro de um animal. Guardar a solução restante a 4 ° C e usá-lo dentro de 3 dias.
      Nota: Alto Mg ²⁺ e baixas concentrações ^{de Ca2 +} são usados para decrease transmissão sináptica e a substituição de alguns NaCl com sacarose para preservar o tecido ^5,40.
3. soluções intracelulares
   1. Prepara-se previamente 100 mL de solução de gravações de célula inteira dupla (Tabela 3).
   2. Incluir metilsulfato ^13,15,21 para obter uma boa recuperação da morfologia celular. Adicionar biocitina (0,1-0,4%) para examinar posteriormente a morfologia do neurónio. Incluir um corante fluorescente (por exemplo, Alexa 594 ou 101 Sulforodamina ⁴¹⁾ para acompanhar a extensão de dendritos durante a gravação (opcional).
   3. Preparar adiantado solução eléctrodo 100 mL para gravações ligado de células (Tabela 4). Neste caso, a solução interna é uma solução de K ⁺ de elevada concebidos para isolar o macroscópica activada por hiperpolarização catião corrente (I _h) e contém bloqueadores para os outros canais de iões dependentes da voltagem.
   4. intra lojasoluções celulares em 2 mL de alíquotas a -20 ° C. Use uma nova alíquota para cada nova sessão de gravação. Verifique a osmolaridade de cada alíquota descongelada cuidadosamente com um osmómetro. Dê uma nova aliquota se a osmolaridade não corresponde ao valor inicial.
   5. Transferir a solução da aliquota numa seringa de 3 mL no topo do qual um filtro de seringa estéril de 0,22 um é colocado. Manter a seringa em gelo durante a sessão de gravação para limitar a degradação dos seus compostos (ATP, GTP ou de fosfato).

2. Fabricação e enchimento de remendo Pipeta

1. Puxar
   1. Use um extrator eletrodo horizontal e tubos de vidro de borosilicato de paredes espessas. Para de célula inteira e gravações ligado de células, usar um diâmetro interno diâmetro externo 2 mm / de 1 mm. Certifique-se de que o tubo de vidro é absolutamente limpo ^38.
   2. Se este não for o caso, imergir capilares de vidro em um solvente orgânico (por exemplo, etanol) Em primeiro lugar e, em seguida, em água bidestilada. Resumidamente aquecer terminações capilares com um bico de Bunsen. Alternativamente, tubos de vidro fim lavado e aquecida diretamente do fabricante (ver lista de materiais).
   3. Para gravações de somatodendríticos dupla, garantir que a resistência da pipeta somática é entre 6 e 10 mohms ^6,11 e entre 8 e 19 mohms por pipetas dendríticas quando preenchidos com a solução intracelular (Tabela 3). Padronizar a resistência da pipeta para gravações ligado à célula para uma resistência de 10 mohms para atingir resultados comparáveis ao longo do domínio somatodendrítico do neurônio ^16,18,42,43.
   4. Prepare pipetas frescos antes de cada sessão de gravação (todos os dias) ou imediatamente antes remendar e usá-los 5-8 h após a sua fabricação ^39. pipetas armazenar em um recipiente de vidro coberto para protegê-los da poeira e obstrução da ponta.
2. polimento
   1. Inspecionar e heat-polonês cada ponta da pipeta com um microforge para obter melhores selos com a membrana. Antes de usar o microforge, derreta um pequeno pedaço de vidro sobre o filamento de aquecimento de platina. Substituir este revestimento de vidro sobre o filamento de platina diária para constância (Peter Jonas, comunicação pessoal).
      NOTA: Pipettes utilizados para gravações ligado de células pode ser revestido antes da etapa de polir o calor para reduzir o ruído de fundo. O revestimento pode ser obtido com um agente de isolamento, tais como cera dentária fundida ^22,44 ou um elastómero de silicone ^39.

3. Preparação de cérebro Slices

1. Use ratos Wistar saudáveis ​​com idade entre 16 - 19 dias de idade. Não use animais doentes ou animais que sofrem de hipotermia e desidratação. Antes de iniciar a preparação de fatias de manter o animal em um lugar seguro e silencioso. Evitar que qualquer outro animal na sala enquanto se prepara um animal. Manipular animais com delicadeza.
2. Pour sacarose-ACSF em dois 400mL de polipropileno (PP) provetas e colocá-los na -80 ° C congelador por 45 minutos. Misture a solução para obter uma solução líquida homogénea gelada / congelada e colocar os copos em gelo. Fornecer a solução de sacarose-ACSF com gás carbogênio usando uma vela microfiltro (Ø 13 mm) em cada copo PP.
3. Prepare o cortador e a câmara de reserva
   1. Use um cortador de tecidos de alta qualidade com extremamente baixas vibrações verticais ^5,38 para minimizar os danos às camadas superficiais da fatias, tanto quanto possível. Fixar uma lâmina de barbear fresco e inteiro na slicer.
   2. Use uma lâmina de barbear nova para cada sessão de corte. Evite dobrar da lâmina de barbear. Não remover a película gordurosa na superfície da lâmina de barbear (Josef Bischofberger, comunicação pessoal).
   3. Se estiver disponível, verifique a vibração vertical com um vibroprobe fornecido pelo fabricante. Como alternativa, use um vibroprobe feitos sob medida ^5. Reduzir as vibrações verticais da s lâminaO como para ser o mais próximo possível de 0 uM.
   4. Preparar uma câmara de 150 mL de reserva ^45,46 para fatias como descrito na p. 201 em Ref. ^39. Despeje ACSF padrão para a câmara de reserva e colocá-lo em banho-maria. Fornecer a solução cara de reserva com carbogênio usando uma vela microfiltro (Ø 6 mm). Certifique-se de que as bolhas carbogênio são tão minúsculos quanto possível.
      NOTA: Criar uma nova câmara de reserva a cada 2 - 3 meses para manter constante a qualidade fatia.
4. fatias cortadas
   1. Em uma sala silenciosa em que o experimentador não é perturbado ou estressado, decapitar o animal com tesouras cirúrgicas (comprimento de 150 mm) ao nível da medula cervical.
   2. Cortar a pele na parte superior da cabeça do animal na direcção nasal para caudal com um bisturi e removê-lo lateralmente. Cortar a parte superior do crânio a partir do caudal para a parte nasal da cabeça com uma tesoura fina e remover as duas partes do crânio lateralmente. Remova a bchuva com uma espátula fina e solte-o cuidadosamente para um copo PP contendo gelo (0-4 ° C) de sacarose-ACSF equilibrada com carbogênio ^38.
      Nota: Esta sequência de passos deve ser feito tão depressa quanto possível, mas também meticulosamente << (1 min, a cerca de 40 s).
   3. Manter o cérebro em solução de o copo para PP ~ 2 a 5 min. Ajustar a pressão carbogénio para evitar movimentos do cérebro. Substitua a vela microfiltro se as bolhas carbogênio são muito grandes com um novo.
   4. Colocar o cérebro em uma placa de Petri de 9 centímetros, em que o interior da parte inferior é coberto com uma camada de 0,5 cm de espessura ~ ³⁸ Sylgard. Prepare esta placa de Petri com antecedência.
   5. Rodeiam o cérebro com gelado de sacarose-ACSF. Certifique-se de que alguns fase líquida de solução ACSF sacarose submerge o cérebro. Para cortes coronais, cortar a parte frontal do cérebro no plano coronal com um bisturi ou uma lâmina de barbear. Remover o cerebelo com um corte coronal.
   6. aplicar cianocola de acrilato na bandeja do espécime (área ~ 1 ^cm2). Cole o bloco cérebro de tal forma que a parte frontal voltada para o estágio de corte. Cuidadosamente escorrer sacarose-ACSF em cima do cérebro colado usando a grande abertura de uma pipeta de Pasteur de vidro e, subsequentemente, lentamente submergir a câmara de corte do cortador. Manobrar o tabuleiro de amostra, de modo que a superfície de corte (isto é, o primeiro tecido para bater a lâmina) é a superfície ventral do cérebro ^40.
   7. Aplicar carbogénio com uma vela microfiltro de vidro dobrado (Ø 6 mm) para a câmara de corte (opcional).
   8. Ajustar a lâmina de barbear segundo um ângulo de ~ 15 ° com referência ao plano horizontal ^5. Corte fatias coronais cerebrais de ~ 500 mm no caudal à direção nasal antes de chegar à substância negra. Diminuir a espessura para cortar 300 - 350 um fatias grossas contendo a região de interesse.
   9. fatias separado do bloco de tecido com uma agulha muito fina perfusão ligado auma seringa paralelamente ao bordo da lâmina de barbear. Curvatura da agulha, de modo a ter um ângulo de 90 ° entre a agulha e a seringa. Assegure-se que não é aplicada pressão para a lâmina de barbear durante a remoção da fatia do bloco de tecido.
5. fatias de loja
   1. Transferir os cortes com a maior abertura de uma pipeta de Pasteur de vidro (ligado a uma lâmpada) para a câmara de reserva. Uma vez que todas as fatias são transferidos para a câmara de reserva (Christoph Schmidt-Hieber, comunicação pessoal) trazer a temperatura do banho de água a 34 ° C durante 0,5-1 h.
   2. Após este período de desligar o banho de água e manter as fatias à temperatura ambiente. Ajustar a pressão carbogénio, a fim de evitar movimentos das fatias na cara de reserva. Mantenha as fatias por mais 10 a 20 minutos antes de iniciar as gravações.
   3. Limpar o equipamento e as velas microfiltro cuidadosamente ainda muito bem com água bidestilada no final do SLIprocedimento ciamento.

4. somáticas e Somatodendric Recordings dual na substância negra Neurônios e biocitina Arquivo

1. Siga as descrições para a montagem de uma instalação de patch-clamp para fatias dadas no Guia Axon e nas referências. ^39,40,47. Informações relativas aos aspectos mais básicos de patching estão em Ref. ^48.
2. Prepare câmara de gravação
   1. Coloque 1 - 2 mL de água duplamente destilada na câmara de gravação. Verificar que não é permeável. Coloque a câmara de gravação na mesa xy mudando.
   2. ACSF alimentação padrão através de um sistema de tubagem de perfusão impermeável ao oxigénio (politetrafluoroetileno) para a câmara de registo. Estabilizar o fluxo de perfusão na câmara a um caudal de 4-5 ml min ^-1. Manter o comprimento do tubo de adesão à proveta contendo ACSF e a câmara de registo tão curto quanto possível (1 m).
   3. Selecione uma fatia do cérebro da câmara de reserva e transferi-lo paraa câmara de gravação, utilizando a maior abertura de uma pipeta de Pasteur de vidro. Cobrir a fatia com um anel de platina para o ancorar na parte inferior da câmara de gravação como representado na p. 201 em Ref. ^39. Use um anel de platina plana (Ø 1,5 cm) e cola fios de nylon paralelos (espaçamento> 2 mm) sobre ele.
3. Ajustar e otimizar a ótica
   1. Visualize as fatias usando microscopia de infravermelho (IR) de vídeo ^4,47,49,50. Ajustar a iluminação Köhler ⁵¹ e otimizar o contraste de interferência diferencial (DIC) ⁵¹ óptica ou da iluminação oblíqua (Dodt contraste Gradiente - DGC) ^52,53. Mais detalhes sobre este procedimento são dadas em Refs. ^40,49.
   2. Verifique a qualidade da fatia. Apenas manter fatias com superfícies lisas e mesmo que não estão muito fortemente contrastadas e têm apenas pequenas crateras, dispersos.
   3. Encha 2 pipetas de patch frescos e não utilizados com a solução intracelular ( Tabela 3). Utilizar um tubo de 0,5 ml contendo a solução de pipeta para encher a ponta da pipeta por acção de capilaridade. Para acelerar o enchimento ponta de pipetas sem filamento, aplicar pressão negativa para o fim da pipeta usando tubagem ligada a uma seringa.
4. Posicionar as pipetas acima da superfície da fatia
   1. Verifique a presença de revestimento de cloreto sobre os fios de prata (eletrodo de referência banheira e eletrodo de patch; para obter mais detalhes, consulte o guia e Refs Axon ^39,54.).
   2. Insira o pipetas sequencialmente nos suportes de pipetas e aplicar pressão positiva (~ 70 mbar) utilizando um circuito de mangueira que liga o titular da pipeta, uma torneira de três vias e um manómetro ^40. Abaixe a pipeta para o banho da câmara de gravação.
   3. Verificar que o valor da pressão no manómetro é constante durante ~ 1-2 min. Se a pressão está a diminuir, verificar o tubo ou os O-rings de vedação no interior do suporte da pipeta.
   4. Colocar a ponta da pipeta no meio do monitor de vídeo e assegurar que ele não é obstruída. Certifique-se que a ponta da pipeta não se move ao aplicar ou libertar pressão para a pipeta.
   5. Verificar a existência de desvio e vibrações da ponta da pipeta por desenhar uma pequena cruz no centro do monitor exatamente na posição da ponta da pipeta e observar por 5 min possíveis movimentos da ponta.
   6. Aplicar um passo de tensão (5 mV) para monitorizar a resistência da pipeta num osciloscópio. Definir o potencial de realização do amplificador de patch-clamp para 0 mV. Cancelar pipeta potencial de desvio tal que a corrente pipeta de DC é zero no contador amplificador ^39,51.
   7. Mover as pipetas até a fatia e mantê-las acima da superfície.
5. Selecionar e corrigir um neurônio com longos dendritos
   1. Dentro da substantia nigra seleccionar um neurónio saudável com longos dendritos que pode ser seguido ao longo de uma longa distância em aproximadamente o mesmo plane (Figura 1A e 1B) utilizando contraste de IV-Dodt Gradiente (IR-DGC). Escolha um corpo celular lisa e homogênea. Evitar as duas células fortemente contrastadas na superfície da fatia (Figura 1C e 1D), porque é difícil de arrombar e para preservar as condições de gravação estáveis ao longo do tempo (resistência em série estável). Selecione neurônios que têm a sua soma 10 - 30 mm abaixo da superfície da fatia.
   2. Mova o eletrodo somática perto da soma (40 - 50 mm de distância) e o eletrodo perto dendrítica ao dendrite na mesma distância. Utilize uma ampliação de 2X (quádruplo trocador) para seleccionar e corrigir uma porção de uma dendrite. Obter no monitor uma ampliação absoluta de 2,100X sem ampliação (1X) e de 5,500X com uma ampliação de 2X.
   3. Ligeiramente libertar a pressão da pipeta somática por 10 mbar. Se necessário, a regular a pressão pipeta dendrítica e somático para evitar o deslocamento do cestrutura ell (soma e dendritos) dentro da fatia.
   4. Posicionar a pipeta dendrítica perto da membrana, a fim de ver uma pequena ondulações. Libertar a pressão sobre a ponta da pipeta e corrigir o dendrito enquanto controla a resistência da pipeta. Em condições ideais, apenas uma muito ligeira sucção é suficiente para se obter uma boa vedação.
   5. Mantenha a pipeta dendrítica no modo ligado à célula. Mova o pipeta junto somática para a membrana somático e corrigir a membrana somática. Assegure-se que uma elevada resistência à vedação é obtida antes de se romper a membrana celular (> 1 GÊ) ^39. Ligeiramente retrair ambas as pipetas longe da membrana por um par de pM para evitar a deformação do corpo celular e dendrítico.
   6. Para ambas as pipetas, reduzir, tanto quanto possível, a amplitude dos transientes pipeta de capacitância no topo do passo actual utilizando um impulso de tensão com ganho elevado e pouco filtragem ⁵¹ e o osciloscópio. Entre no modo wi-célula inteirath da pipeta dendrítica e, subsequentemente, com a pipeta somática.
   7. Elimine os transientes de capacitância de células inteiras e compensar resistência em série. Monitorar e documentar o acesso a resistência no início de, e regularmente durante a experiência. Se resistência em série é muito alta (> 50 mohms), repetir com outro pipeta.
   8. Recolha IR-DGC imagens (Figura 1A e 1B) com uma impressora de vídeo gráfico ^25, uma placa de captura ou uma câmera digital com ampliações altas e baixas.
      NOTA: Inchaço de neurônios durante a gravação (Figura 1E e 1F) é esporadicamente observada, mas raramente quando a osmolaridade e pH de soluções é ajustado corretamente ^39.
   9. Obter gravações duplas somáticas de células inteiras (soma - soma) com o mesmo procedimento (Figura 2A).
6. Aplicar longas (várias centenas de ms) crescentes despolarização passos atuais sequencialmentecom a pipeta somática e dendrítico para evocar APs (Figuras 2b, 3c e 3d). Grave o potencial resultante na dendrítica e pipeta somática simultaneamente.
7. Examinar a propagação de potenciais pós-sinápticos excitatórios artificiais (aEPSPs) em neurónios dopaminérgicos
   1. Criar uma forma de onda de excitação de corrente pós-sináptica (EPSC) para injetar como um comando de corrente durante gravações corrente-clamp duplo (Figuras 4A e 4B). Para fazer isso, construir uma função exponencial duplo com valores de amplitude e curso de tempo que correspondem aos valores reais medidos para EPSCS no neurônio de interesse ^55. controlar cuidadosamente as taxas de amostragem do EPSC construído e da forma de onda EPSC injetado para preservar o curso de tempo original.
      Nota: Antes de aplicar a forma de onda em um neurônio real, testá-lo usando uma célula do modelo.
   2. Sequencialmente injectar a forma de onda através do dendrítica epipeta somático e registro resultante potenciais para ambas as pipetas somáticas e dendríticas concomitantemente. Verifique regularmente para um possível desvio de pipetas.
8. Finalizando a gravação de um neurônio
   1. Tome uma imagem IR-DGC com uma ampliação baixa (objectivo: 5x ou 10x) para documentar a posição do neurônio dentro da fatia e os eletrodos.
   2. Devagar e com cuidado retirar a dendríticas e as pipetas somáticas da sequencialmente membrana neuronal, a fim de formar manchas fora-out com ambas as pipetas. Retirar a pipeta usando uma sequência de movimentos laterais e para cima ^38. Estes devem ser curto, em primeira e, em seguida, aumentar gradualmente de comprimento. Esta configuração de gravação favorece o fecho da membrana celular.
   3. Monitorar a diminuição das correntes capacitivas (aumento na resistência de acesso) em resposta a um impulso de tensão de 5 mV da voltagem-grampo ao retirar a pipeta.
   4. Uma vez que a membrana é marlevou em torno da ponta da pipeta, levá-la completamente fora da câmara de gravação. Remover o objectivo do banho. Manter a fatia na câmara de gravação durante 15 - 20 min em ACSF padrão para permitir o equilíbrio de biocitina (a partir da solução intracelular) no neurónio gravado.
   5. Gentilmente transferir a fatia usando a grande abertura de uma pipeta Pasteur em um 25 ml de boca larga garrafa de vidro âmbar (marrom) contendo ACSF padrão. Fechar o frasco com uma tampa. Ver o ponto 6 para a etapa de fixação.

5. Recordings anexado-Cell

1. Seleccionar um neurónio com um dendrito que se estende ao longo de uma longa distância no mesmo plano. Certifique-se de que a dendrite de interesse pode ser seguido de uma soma bem definida.
2. Encher a pipeta de remendo com solução eléctrodo (Tabela 4). Projetar a solução para registrar a corrente de interesse na configuração anexado à célula, incluindo agentes farmacológicos específicos para bloquear outros cha íonnnels.
3. Corrigir o dendrite no modo ligado à célula
   1. Visualizar uma porção do dendrito e aproximar a pipeta recodificação utilizando o manipulador. Adaptar a pressão na ponta da pipeta, verificando o manómetro (70 - 80 mbar), para evitar o deslocamento da dendrite. Corrigir o dendrito como descrito em 4.5.4.
   2. Gravar algumas imagens IR-DGC (Figura 5A). Tentar obter uma resistência de vedação tão grande quanto possível (> 1 GÊ ^39), no melhor dos casos entre 3-10 GÊ para gravações ligado de células ¹⁸ (Figura 5B). Recolha a pipeta de distância a partir da membrana por um par de pM para evitar a deformação da dendrite.
   3. Observar correntes de ação no modo ligado à célula refletindo potenciais de ação espontânea dos neurônios da substância negra. Complementar a ACSF com Ca ²⁺ e bloqueadores de canal de Na ⁺ _(CdCl2 e TTX, respectivamente) para suprimir as correntes de ação.
   4. Aplique uma sv 2etapa ensão de -90 mV a partir de um potencial de realização de 0 mV para o patch para evocar I _h (Figura 5C). Tenha em atenção que o potencial da pipeta e o potencial de repouso da membrana estão em série na configuração ligado à célula ^56. Para mais detalhes, consulte o Guia de Axon e Ref. ^39.
   5. Verifique regularmente para um possível desvio da pipeta.
   6. No final da gravação, romper o remendo para ir no modo de célula inteira e imediatamente tomar uma leitura do potencial de membrana. Retrair a pipeta como descrito nas secções 4.8.2 e 4.8.3 para obter um patch de fora-out.
4. Gravar a partir do soma correspondente no modo de célula inteira
   1. Olhe ao longo do dendrito e localizar a soma correspondente. Usar uma pipeta de alta resistência (5 - 10 MQ) ^6,14,57 preenchido com uma solução ^de K ⁺ intracelular com base na (Tabela 3). Aplicar uma breve de sucção (pressão negativa) para aponta da pipeta para romper a membrana, a fim de entrar no modo de célula inteira.
   2. Verifique se a identidade do neurônio na corrente-clamp aplicando longa hiper e despolarização passos atuais (Figura 5D) e permitir biocitina para difundir junto dendrites. Aplicar etapas atuais despolarizantes curtas para visualizar o curso de tempo AP.
   3. Após ≤10 min, retirar a pipeta para obter um patch de fora-out conforme descrito nas seções 4.8.2 - 4.8.3. Suavemente transferir a fatia usando a grande abertura de uma pipeta de Pasteur, para um frasco de 25 mL de vidro âmbar contendo ACSF padrão. Fechar o frasco com uma tampa.
   4. Alternativamente, em primeiro lugar obter um conjunto de células somáticas com uma solução da pipeta contendo adicionalmente um corante fluorescente. Permitir que a difusão do corante e seleccionar uma parte de um dendrito ^26. Com um segundo pipeta, corrigir o dendrite no modo ligado à célula. Usar um microscópio confocal se disponíveis para melhorar a visualização do marcador fluorescenteed dendrite ^14,22.
   5. Realizar gravações dendríticas na configuração fora-out, alternativa ou adicionalmente às gravações ligado de células ^10,22. Veja um exemplo de uma correntes de voltagem-gravadas a partir de um patch de fora-out na Figura 5E e 5F.

6. biocitina Etiquetagem de neurónios da substância negra

1. A fixação do tecido
   1. Se possível, use salas separadas para a gravação fatia / processamento histoquímico ^38.
   2. Fixar as fatias substituindo o ACSF com 4% de paraformaldeído em 0,1 M de tampão de fosfato salino (PBS, pH = 7,4) com uma pipeta de Pasteur. Sempre use a solução fixadora (<< 1 semana atrás) preparados na hora.
      CUIDADO: use luvas adequadas e uma capa química colocada num laboratório de histologia de manipular paraformaldeído por causa da sua toxicidade. Leia a folha de dados de segurança deste produto perigoso antes de usar e cParreira os regulamentos relativos à segurança química (Directiva Substâncias Perigosas (67/548 / CEE) da Comissão da UE) como este pó é pensado para provocar o cancro. Outros detalhes estão em Ref. ^58.
   3. Coloque as fatias a 4 ° C durante a noite. Evitar a contaminação da configuração do patch-clamp ou qualquer equipamento utilizado para eletrofisiologia por paraformaldeído.
   4. Após a fixação, substitua a solução fixadora com PBS. Use um diferentes pipetas Pasteur para remover a solução fixadora e aplicando a PBS. fatias de loja em PBS a 4 ° C antes de posterior processamento (1 - 2 semanas). Neste caso, substitua PBS duas vezes por semana. Use PBS sempre preparados na hora (<< 1 semana atrás).
2. Coloração de tecido
   1. Prepara-se uma placa de cultura celular de 24 cavidades para as etapas de coloração. Use equipamento limpo para transferir fatias. Lavar as fatias de 3 x 5 min utilizando PBS fresco.
   2. Aplicar Fluoresceína Avidina DCS (Avidina D, grau de separação de células; 1 FLUORES ulcein / mL de Triton X-100) e 0,3% de Triton X-100 em PBS a 4 ° C durante a noite. Proteger as fatias de luz em toda a coloração. Como uma alternativa para fluorescência, os neurônios etiqueta via 3,3'-diaminobenzidina para a luz ou Electron análise microscópica ^21,58.
      CUIDADO: Triton X-100 é perigoso. Leia ficha de segurança e directivas da Comissão da UE antes de usar esta substância.
   3. Lavar 3 x 30 min com PBS e, subsequentemente, com PB (tampão fosfato, para evitar a formação de cristais na superfície da fatia).
3. Montar as fatias em lâminas de vidro padrão. Cubra as fatias cuidadosamente com um meio de incorporação. Evitar bolhas de ar no meio de fixação. Coloque a lamela suavemente, a fim de cobrir completamente a fatia. Secar as lâminas durante a noite antes visualizando-os com um microscópio.
4. Armazenar as fatias marcados a 4 ° C após a visualização. Truques úteis sobre os procedimentos histoquímicos estão em Refs. ^58,59.
5. Limpe o equipamento utilizado para histologia e eletrofisiologia separadamente. Não misture histologia e equipamentos eletrofisiologia juntos.

7. Post Hoc Visualização de Neurônios biocitina-cheias

1. Usar um microscópio confocal para visualizar a morfologia de neurónios recuperados.
   1. Cerca de localizar o neurônio fluorescente etiquetado na fatia com epifluorescência. Examine o mandril dendrítica de neurônios e localize o axônio e bolha axonal (2-4 mm Ø) usando uma objetiva de 10x ou 20x. Documentar o curso do axónio.
   2. Mudar para o microscópio confocal e selecione o laser de diodo 488 nm para excitar a fluoresceína contida no neurônio rotulados. Seguir a extensão do axónio e dendrites no eixo z.
   3. Gravar imagens sucessivas, a fim de obter um z-pilha para toda a célula. Ajustar a resolução do eixo z (distância entre imagens consecutivas) para 0,5-1 uM. Coletar imagens confocal de um usin celularg baixa (objetiva de 10X) e alta (objetivo 60X, de imersão em óleo) a ampliação.
   4. Abra o arquivo de imagem do neurônio obtida com o microscópio confocal com um software de imagens (ImageJ) ^60. Compare a imagem z-projeção com uma imagem IR-DGC por olho para localizar a posição exacta das pipetas de patch durante a gravação eletrofisiológico (Figuras 1, 2a, 3a, 4a, 5a e 5E).
   5. Determinar morfometria de neurônios marcados: medir o axônio - distância soma, distâncias entre pipetas de gravação ao longo do domínio somatodendrítico e entre a pipeta dendrítica e axonal utilizando a função "Measure" em ImageJ.
   6. Reconstruir alguns neurônios com NeuronJ (ImageJ), Imaris ²⁹ ou Neuromantic ^61.

8. Análise dos dados electrofisiológicos

1. Utilizar o pacote de software associado com o amplificador de analisar grosseiramente os dados (por exemplo, Clampfit), quer directamente umoutro software para análise de dados, como Stimfit, um software open source ^62,63 como em nossa recente publicação ¹³ ou, por exemplo WinWCP.

Resultados

O protocolo descrito acima tem a intenção de facilitar a recolha de dados através de gravações de patch-clamp dendríticas. Esta técnica, combinada com histoquímica post hoc, ajuda a obter insights sobre os mecanismos de muitos sinais elétricos originários ou espalhamento em dendrites. Acesso directo à dendrites com pipetas de patch é difícil, mas especial atenção a vários aspectos metodológicos irá melhorar a taxa de sucesso das gravações. Um experimentador suficientemente experientes em gravação somática estável pode esperar obter selos de alta resistência (GÊ) e experiências completas sobre a maioria das tentativas. Uma a duas gravações dendríticas de alta qualidade podem ser recolhidos por dissecção.

A disponibilidade de fatias de cérebro de alta qualidade contendo somata saudável e dendrites é um pré-requisito para acesso a essas estruturas finas (Figura 1). o criteriuma para selecionar esses neurônios são uma superfície lisa e homogênea em todo o celular e um soma e dendritos de baixo contraste, quando observada com óptimas ajustado óptica (Figura 1A e 1B). Seleção de neurônios muito fortemente contrastada geralmente leva a gravações instáveis (Figura 1C e 1c). Por conseguinte, tais neurónios deve ser evitada.

Em comparação com outros neurônios, os neurônios da substância negra DA exibir características morfológicas e eletrofisiológicas específicos. Estas características geralmente avaliadas com uma única pipeta somática também pode ser observada em dupla somática (Figura 2) e gravações de somatodendríticos (Figura 3). Longos injeções atuais hiperpolarizantes induzir uma rectificação potencial de membrana chamada "sag" (Figuras 2B e 5D). O axónio origina, na maioria dos casos, num sítio dendrítica tal como identificadousando critérios complementares ^13,25,26, indicando que o compartimento dendrítica nestes neurónios é heterogénea (Figura 3A - 3B). Como consequência, o compartimento onde o AP é observado em primeiro lugar corresponde ao compartimento no qual o axónio emerge (Figura 3C - 3D) ^13,25,26. O axónio é geralmente terminada por uma bolha axonal causado por um corte do axónio durante corte ^64, mas esta estrutura não é sistematicamente detectado.

A retracção pronunciada observada em neurónios da substância negra consecutivo para a activação da I _h sugere uma elevada expressão de subunidades de HCN. Para determinar a influência da I _h na integração de sinais sinápticos, correntes (EPSC) formas de onda sinápticas-like foram gerados e injetado através do eletrodo de registro dendríticas durante as gravações dupla somatodendríticos ⁵⁵ ( Figura 4). A cinética destas EPSCS simulados foram baseadas em ascensão e tempo de decaimento constantes de EPSCS espontâneas reais. O aEPSP resultante foi gravado com o eletrodo somática. Aplicação no banho do I _h bloqueador ZD 7288 aumentou a duração da aEPSP, indicando a contribuição de I _h para o curso de tempo dos sinais sinápticas (Figura 4B). ZD 7288 aboliu também a membrana rectificação potencial confirmando que os resultados SAG da activação da I _h (Figura 4C). Os resultados obtidos com os EPSPs simuladas pode ser correlacionada com experiências que utilizam EPSPs evocados electricamente ^65. Para mapear a distribuição precisa do canal no domínio somatodendrítico de neurónios DA, gravações ligado de células foram executadas (Figura 5). A selagem de alta resistência (>> 1 GÊ) é uma necessidade absoluta para as gravações ligado de células (Figura 5B Eu _h activa lentamente com degraus de tensão hiperpolarizantes de comprimento e o estado de equilíbrio de corrente é atingido após centenas de ms (Figura 5C), como mostrado anteriormente ^66. Esta observação indica que os canais HCN expressos em dendrites dos neurónios DA possuem diferentes subunidades em comparação com aqueles em neurónios piramidais ou de outros tipos de células ^10,16,66. À medida que a distribuição do canal pode ser não homogénea no compartimento dendrítica e como o compartimento dendrítica é em si heterogéneos, a identidade do dendrito (axónio-rolamento ou dendrito nonaxon-rolamento) é revelada por comparação da imagem IR-DGC com a imagem confocal após coloração biocitina (Figura 3A e B). Recuperação da morfologia das células é, portanto, necessário para ambas as gravações de somatodendríticos dupla e para gravações ligado à célula por meio de gravações de células somáticas toda subsequentes.

Figura 1. Visualizando o Soma e proximal dendrites dos neurônios dopaminérgicos da substância negra usar o infravermelho Videomicroscopia. (A) IR-DGC imagem de um neurônio DA nigral mostrando a soma e dendritos proximais e duas pipetas somáticas e dendríticas. Uma gravação somatodendrítico dupla foi realizada com sucesso neste neurônio saudável. Observar o baixo contraste e a superfície lisa em todo o domínio somatodendrítico da célula. (B) Um outro exemplo de um neurónio DA saudável. (C) DA neurónio com uma superfície mais áspera e desigual e um contraste forte. Embora tenha sido obtida uma gravação dupla, a estabilidade foi abaixo do ideal, e a duração da gravação foi curto (~ 15 min) devido a um aumento gradual da resistência acesso em ambas as pipetas. (D) segundo exemplo de um neurônio DA mostrando uma fortemente contrastada soma e dendritos proximal. Neste caso, um forte aumento da resistência acesso foi observada pouco depois da pausa no modo de célula inteira. Uma tentativa de diminuir a resistência acesso por pressão negativa não teve sucesso. Neurónios no painel C e D podem ter sido danificados durante o procedimento de corte e deve ser evitado para experiências. (E) simultânea dupla gravação somática num neurónio DA saudável no início da gravação. (F) O mesmo neurónio como no painel E com um corpo da célula inchada depois de ~ 17 min. Note a ausência completa de contraste, a aparência bola-like da soma e a presença do grande núcleo que não é aparente em neurônios saudáveis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. simultânea Duplo Somatic gravação de uma DA Neuron. (A) IR-DGC imagem durante a gravação de dupla somática a partir de um neurônio DA. (B) hiperpolarizando e despolarização 1 s injeções de corrente longa (-160 a 80 pA, incremento de 80 pA) e variações de tensão correspondentes gravados simultaneamente com as duas pipetas de patch. Note a presença do afundamento no rastreio de tensão com a etapa atual de hiperpolarização longa e grande pós-hiperpolarização após a AP durante o pulso de corrente de despolarização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. dupla S Gravação omatodendritic num DA Neuron. (A) imagem IR-DGC de um neurônio DA. A distância entre a dendrítica e somapipeta tique é 29 uM imagem. (B) z-confocal projecção do neurónio no painel A marcado com avidina conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC). O neurônio foi preenchido com biocitina durante a gravação. O axônio originado de um dendrito proximal perto da soma, tal como indicado pela seta. (C) a gravação de tensão de célula inteira somatodendrítico dupla simultânea do neurônio no painel A. AP registrado na soma (vestígios de tensão preto) e dendritos (tensão vermelho traços) em resposta a um 1 s passo de injecção de corrente longa via somática (da esquerda; traçado atual preto) e pipeta alternativamente dendríticas (direita; traço corrente vermelha) (D) somática e AP dendrítica mostradas na escala de tempo expandido.. Com qualquer somática ou injeção de corrente dendrítica, a AP somáticas (preto) precedeu a AP dendríticas (vermelho). O atraso entre APs neste neurônio foi de 120 ms e 210 mS com somático e injeção de corrente dendrítica, respectivamente. atrasosforam medidos no AP amplitude semi-máxima durante a fase de subida do AP. A AP é observada pela primeira vez no compartimento próximo ao qual o axônio emerge, confirmando observações anteriores ^25,26. Neste caso, a gravação dendrítica é feita a partir de uma dendrite-falta axónio. Um exemplo de uma gravação de uma dendrite axônio de rolamento está em Ref. ¹³ (na sua Fig. 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Propagação da EPSPs artificiais ao longo do somatodendrítico Axis of DA neurônios. (A) imagem IR-DGC de um neurônio DA. A distância entre a pipeta e dendrítica somática é de 45 uM. Ambas as pipetas de patch está no modo de célula inteira de gravação actual-clamp. (B) Correntegravado com a pipeta dendrítica na corrente de grampo e usado para gerar o EPSP artificial (topo). A corrente é obtida pela injecção de uma forma de onda semelhante EPSC (t _rise = 0,6 ms; τ _decaimento = 3 ms de amplitude = 100 Pa) através do dendrítica pipeta de gravação ^55. Na parte inferior, aEPSPs registados no soma em condições de controle (preto) propagado e depois da aplicação do banho do ZD7288 I _h bloqueador (30 mM; traço vermelho). Cada traço de tensão é a média de 40 varreduras individuais. Observar o grande aumento da duração do EPSP na presença de ZD7288 indicando a contribuição de I _h para o curso de tempo de EPSP. (C) Tensão vestígios gravados a partir do soma, em condições de controlo (preto) e após a aplicação de 30 | iM ZD 7288 ( vermelho) em resposta a uma longa (30 pa; 1 s) passo actual hiperpolarizante. Note-se a ausência do potencial de membrana de rectificação (SAG), após o bloqueio de I _{h. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.}

Figura 5. Presença de I _h em dendritos das DA Neuron. (A) IR-DGC imagem de um neurônio DA e pipeta sobre dendrito proximal. (B) capacitivo e de vazamento de correntes durante um comando de tensão 5 mV na configuração anexado à célula. A resistência de selagem foi GÊ 5, neste exemplo, o passo (C) tensão de hiperpolarização. (90 mV; parte superior) a partir de um potencial de membrana 0 mV induzida uma activação lentamente I _h. O rastreio da corrente foi invertida e equipada com uma única função exponencial dá uma constante de tempo de t = 632 ms. (D) Tensãorespostas da soma registrada de células inteiras (painel A) a 1 s hiper e despolarizantes pulsos de corrente (-160 a 120 Pa, 40 pA de incremento). A gravação de célula inteira somáticas foi realizado após a gravação ligado à célula. Note-se a ausência de APs devido à aplicação extracelular da TTX e Cd ²⁺ suprime a ativação espontânea durante a gravação ligado à célula. Estes voltagem dependentes ^de Na ⁺ e Ca ²⁺ bloqueadores atuais foram adicionados a suprimir as correntes de ação. Os painéis A - D, são do mesmo neurónio (E) imagem IR-DIC de outro neurónio DA e uma pipeta dendrítica correntes (F) de tensão-dependentes activados por um pulso de teste de 0 mV a partir de um pré-pulso de 50 ms a -120 mV.. em um patch de fora para fora excisada do dendrito proximal do neurônio no painel E. Segurar potencial de -80 mV. Note-se a inativação dependente do tempo da corrente. Por favor clique aqui para ver uma maiorversão desta figura.

Substância	g / mol	Concentração	para 1 L
NaCl	58,443	125 mM	7.305 g
NaHCO3	84,007	25 mM	2.100 g
KCl	74,551	2,5 mm	0,186 g
NaH 2 PO 4	137.99	1,25 mM	0,172 g
glicose	198,17	25 mM	4,95 g
MgCl2	1 M (solução)	1 mM	1 mL
CaCl2	1 M (solução)	2 mM	2 ml
Osmolaridade: ~ 310 mOsmol / L (intervalo ideal: 314-325 mOsmol / L), pH = 7,4

Tabela 1: fluido cerebrospinal artificial (ACSF).

Substância	g / mol	Concentração	para 1 L
NaCl	58,443	87 mM	5.084 g
NaHCO3	84,007	25 mM	2,1001 g
KCl	7,551	2,5 mm	0,18637 g
NaH 2 PO 4	137.99	1,25 mM	0,17248 g
MgCl2	1 M (solução)	7 mM	7 mL
glicose	198,17	10 mM	1,9817 g
sacarose	342,29	75 mM	25,672 g
CaCl2	1 M (solução)	0,5 mM	0,5 ml
Osmolaridade: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4

Tabela 2: sacarose-ACSF para preparar fatias.

Substância	g / mol	Concentração	para 100 ml
KMeSO 4	150,2	120 mM	1,8024 g
KCl	74,56	20 mM	0,14912 g
MgCl2	1 M (solução)	2 mM	200 ul
Na 2 ATP	551,1	2 mM	0,1102 g
Na 2 GTP	523,2	0,5 mM	0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine	255,1	5 mM	0,1275 g
EGTA	380,4	0,1 mM	3.803 mg
Hepes	238,31	10 mM	0,23831 g
biocitina	1 mg / mL		0,1 g
Osmolaridade: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 ajustado com KOH

Tabela 3: solução intracelular para gravações dupla.

Substância	g / mol	Concentração	para 100mL
KCl	74,56	120 mM	0,8947 g
CaCl2	1 M (solução)	2 mM	200 ul
MgCl2	1 M (solução)	1 mM	100 ul
Hepes	238,31	10 mM	0,23831
TEA-Cl	165,7	20 mM	0,3314 g
4-AP	94,11	5 mM	0,04705 g
BaCl2	244,26	1 mM	0,02443 g
CdCl2	183,32	0,02 mm	0.3666 mg
TTX	1 mM	200 nM	20 ul
Osmolaridade: ~ 290 mOsmol / L, ajustado com D-glicose (Ref. 16); pH = 7,4

Tabela 4: Solução de eletrodo para gravações ligado por células.

Discussão

Este relatório descreve um protocolo passo-a-passo para implementar gravações de célula inteira somatodendríticos duplas e gravações dendríticas locais. É útil para a determinação da influência de canais iónicos (isto é, I _h) sobre o decurso de tempo de potenciais pós-sinápticos e mapeamento da distribuição do canal de iões (I _h) ao longo do domínio somatodendrítico de neurónios da substância negra de DA, respectivamente. Resultantes medidas eletrofisiológicas são combinados para deixar histoquímica hoc para recuperar a morfologia das células. O procedimento foi utilizado para investigar neurónios DA localizados na substantia nigra, mas podem ser generalizados para os neurónios da substância negra vizinhos GABA, área tegmental ventral neurónios DA ou outros neurónios do mesencéfalo. Todas as etapas também podem ser seguidas para examinar outros canais iônicos expressos em dendrites dos neurónios da substância negra, sem modificações importantes. Visualização post hoc é particularmente pertinente para os neurônios com axônio-bearingdendrites, como neurônios da substância negra ^25,26, hipocampo interneurônios Oriens-alveus ²¹ ou alguns neurônios piramidais CA1 ^67. Curiosamente, os neurônios que partilham esta característica parece ser mais comum do que geralmente se pensa ^67. A análise morfológica revela também a posição precisa dos eletrodos e axônio. A detecção do último pode ser otimizado pela rotulagem de proteínas expressas no segmento axônio inicial (canais de Na ⁺ dependentes de voltagem ou Ankyrin G) usando imunohistoquímica ^68,69.

A fiabilidade dos dados recolhidos com as gravações dendríticas e rotulagem neuronal subsequente, invariavelmente, depende da qualidade fatia. Esforço máximo deve, pois, ser aplicado para preservar a viabilidade das células no tecido. Isto é conseguido com a manipulação suave de animais saudáveis, ferramentas de alta qualidade e reagentes, oxigenação suficiente das temperaturas de tecidos e geladas ao longo da preparação de fatias. condições de gravação estáveis ​​contam com a seleção de neurônios saudáveis. No modo de célula inteira, resistência em série inicialmente deverá ser tão baixo quanto possível e mantida constante ao longo da experiência. A estabilidade das gravações é mais dependente manipuladores de alta qualidade desprovidas de deriva e vibrações. Estas perturbações podem ser reduzidas através da optimização da estabilidade pipeta: verificar a ligação ao suporte da pipeta e a headstage, controlar que os cabos são micromaniplador folga, evitando alterações bruscas de temperatura ou o movimento fase e verificar o mecanismo do manipulador. Para as gravações dupla, metilsulfato ^13,15,21 foi incluído na solução intracelular, mas gluconato ^9,14,25 pode ser alternativamente empregue. No entanto, o principal anião podem alterar o potencial de membrana ^70,71 e algumas correntes dependentes de voltagem ^72. solução intracelular pode ser suplementado com ATP, GTP e fosfocreatina para preservar a physiolofunções gicos dos neurônios. Além disso, a adição de um corante fluorescente na solução de pipeta (por exemplo, Alexa 594 ou Sulforodamina 101 ⁴¹⁾ para visualizar os dendritos durante uma gravação somática pode ser útil, por exemplo para colocar um pedido de pressão (Figura 7 em Ref. ⁴¹⁾ ou um estimulante eléctricos pipeta. A solução de pipeta para gravações ligado à célula contém uma alta concentração de K ⁺ e nenhum Na ⁺ para gravar grande I _h. Digno de nota a proporção da concentração ^de Na ⁺ / K ⁺ influencia a amplitude da corrente ^10, o potencial de inversão da corrente ¹¹ e a propagação de _h I ^73. Como alternativa, eu _h também podem ser gravados utilizando fora-outs ^10. Nesta configuração de gravação no entanto, o meio intracelular na proximidade dos canais pode ser perturbado. Por conseguinte, as diferenças na activação dependente de voltagem de I _{h é observado quando as correntes comparando obtidos utilizando manchas ligado à célula e fora-outs ^10. Inchaço dos neurônios é ocasionalmente encontrada durante a gravação de patch-clamp, e muitas vezes surge de causas distintas, tais como a baixa qualidade da água, forte desequilíbrio da osmolaridade ou pH entre a soluções de ³⁹ ou erros intra e extracelular na composição de soluções. A qualidade dos registos electrofisiolicos tem uma incidência directa sobre a qualidade da morfologia de neurónios recuperados. Alta resistência pipetas somáticas são utilizados para gravações duplas (6 - 10 mohms, como nas refs ^6,11.) E para gravações somáticos simples após gravações ligado de células para minimizar a diluição do meio intracelular ^14. A gravação somática de célula completa após a gravação ligado de células é, portanto, mantido curto (<10 min). patches de fora para fora de ambos os somáticas e dendríticas pipetas são essenciais para o fecho do cmembrana ell e subsequente recuperação da morfologia celular. Além disso a estrutura da célula, o conteúdo neuroquímica pode ser determinado para os neurónios gravados ^59,74. Por exemplo, a proteína intracelular tirosina-hidroxilase pode ser immunolabeled para a identificação inequívoca dos neurónios DA ^13.}

Neurónios DA concentram-se principalmente no SN pars compacta, com uma densidade muito mais baixa presentes no SN pars reticulata, onde eles são misturados com um maior número de neurónios GABA ^75. Enquanto o corpo da célula dos neurónios DA é muitas vezes maior do que a de neurónios GABA, a identificação visual destas células com IR-videomicroscopia é incerto e parcialmente impedida pela opacidade da pars compacta. Para ultrapassar estas limitações, a pré-selecção de neurónios DA pode ser facilitada pela utilização de ratos transgénicos que expressam um marcador fluorescente, numa população específica de neurónios (TH ⁶⁵ ou DAT para neurónios DA, GADpara os neurônios GABA) e iluminação de epifluorescência. Alternativamente, um corante fluorescente pode ser incluída na solução do eléctrodo somática para facilitar a visualização dos dendritos. O aumento da resolução da célula fluorescente é trazida por Nipkow confocal disco giratório ^14,22,30 ou microscopia de dois fótons ⁷ combinados para IR-DGC ^6. Várias vantagens estão relacionadas com DGC em comparação com DIC. Em primeiro lugar, na forma de prismas DIC não são requeridos, a imagem IR-DGC pode ser coberto com uma ^49,52,53,76 imagem de fluorescência. Em segundo lugar, a DGC pode ser combinado com fotoestimulação e Optogenetics ^77.

Uma desvantagem de preparação fatia é a preservação da integridade dos neurónios. Neurónios DA alargar as suas dendrites nos três planos do espaço e, portanto, ^78,79 truncamento do compartimento dendríticas não pode ser completamente evitada em fatias ^80. A escolha da orientação de fatias (coronal, horizontal ou para-sagital) é um trade-off. A origem da inervação eo delineamento experimental devem ser considerados para selecionar a orientação da direita de fatias.

patching dendrítica directa é a técnica utilizada para mapear a distribuição de canais de iões funcionais nos diferentes compartimentos das células. Além disso, esta técnica oferece para determinar a variabilidade nas propriedades funcionais dos canais ^20. Como complemento a localização e densidade de canais de iões pode ser verificado usando imuno-histoquímica para a luz e microscopia eletrônica níveis ^17,23. Essa abordagem também oferece a possibilidade de determinar a densidade de canais em estruturas de pequeno calibre que são inacessíveis para pipetas de patch. No entanto, estes canais pode estar em um estado funcional distinta ²⁴ ou mesmo inativa em comparação com os registados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas as técnicas são, portanto, necessário para obter uma imagem completa da localização e propriedades decanais iônicos em uma região celular específica ^17. Com o desenvolvimento de corantes sensíveis à voltagem, imagiologia de tensão foi usado para examinar a propagação de EPSPs de APs e em neurónios em vários locais ^81. Como uma alternativa a dupla gravações de patch-clamp, esta abordagem pode ainda ser implementado por dendrites finas que não são acessíveis para pipetas patch, mas exigem uma calibração precisa do sinal e média.

Enquanto neurónios DA na SN e área tegmental ventral são amplamente investigada por meio de gravações somáticas no contexto fisiológico e fisiopatológico, as propriedades funcionais das suas dendrites permanece largamente desconhecido em ambas as condições. Aplicação de patches de dendrites foi implementado para os neurónios dopaminérgicos da substância negra por vários grupos com sucesso ^13,25,26 e continua a ser o método de escolha para dissecar propriedades excitáveis destas estruturas subcelulares finas ^8. gravações dendríticas proporcionar uma maior opportuComunidade de fiscalizar a eficiência ea plasticidade da transmissão sináptica e da plasticidade da excitabilidade dendrítica ^82,83.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Água duplamente destilada	Millipore	Super Q	Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm a 25  ° C, filtrado (0,22 µ m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Velas de microfiltro	Robu	Porosidade 3, 6 mm ou 13 mm de diâmetro
Fatiador de tecidos com vibrosonda	Leica	VT1200	: velocidade 0,07, amplitude 1,40
Fatiador de tecidos	Dosaka	DTK-1000	parâmetros de corte: velocidade 4, frequência 7
Lâminas de barbear	Gilette	Super Silver
Ferramentas de dissecação	Braun, Aesculap
Câmara			Beckers PP feitos sob medida
	VWR	213-1725	400 ml
Filtro de seringa	Merk Millipore	Millex - GV 0.22 µ m
Cola de cianoacrilato	cola líquida	"Sekunden Kleber"	UHU
	Luigs & Extrator	horizontais Neumann Slice mini câmara
	Sutter Instruments	Brown-Flaming P-97
Pipetas Hilgenberg	1807524	2 mm o.d./1 mm i.d. vidro capilaries, extremidades polidas a fogo, lavadas
Cera dental	Coltè Tiras	cera ortodônticas para bandejas
Grade			para ancorar fatias na câmara de gravação, feitas sob medida com um disco de platina
Microforge	Narishige	MF-830	para polir pontas de pipeta
de polimento de fogo Metil sulfato de potássio	MP Biomedicals	215481
Biocytin	Sondas moleculares	B1592
Manômetro	GREISINGER eletrônico	GDH 13 AN
Microscópio	Zeiss	FS
Dodt Gradiente Contraste	Luigs & Manipuladores Neumann
	Luigs & Neumann	LN Mini 25
Frame grabber	The Imaging Source	DFG/USB2pro
Câmera	DAGE-MTI	NC-70
Condensador	Zeiss		condensador de alta abertura numérica trabalhando com óleo
Objetiva	Zeiss	W Plan Apocromat 441470-9900 VIS-IR	63X ampliação, longa distância, alta abertura numérica 1.0 imersão em água objetivo
Quádruplo	Luigs & amp Neumann		entre a câmera e o microscópio
Monitor de vídeo preto e branco	Sony	SSM-175CE	16 polegadas, 850 linhas de TV,
frascos de amostra analógicos, vidro âmbar, com tampa	VWR	215-2409	para transferir fatias da configuração para a sala de histologia
O Guia Axon	Molecular Devices		Book
Stimfit	https://github.com/neurodroid/stimfit		Análise de dados eletrofisiológicos
Paraformaldeído	Sigma	441244	consulte a FICHA DE DADOS DE SEGURANÇA e a Diretiva de Substâncias Perigosas (UE) antes do uso
Placa de cultura de células de poço	Greiner-Bio-One	662160	para a coloração de fatias fixas
Triton X-100	Merk	108643	consulte a FICHA DE DADOS DE SEGURANÇA e a Diretiva de Substâncias Perigosas (UE) antes do uso
anti-TH monoclonal primário de camundongo	Immunostar	22941	concentração de trabalho: 1/1.000
anticorpo secundário anti-camundongo de cabra - Alexa Fluor 568	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11031	concentração de trabalho: 1/500
Soro de cabra normal	Dako	X0907
ProLong Diamond Antifade	Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific	P36961
Microscópio
NeuronJ	http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/		plugin para a
Neuromantic	http://www.reading.ac.uk/neuromantic/		Reconstrução de neurônios preenchidos com biocitina
WinWCP	http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm		Análise de dados eletrofisiológicos