Symmetric Bihemispheric Postmortem Cérebro de corte para o Estudo de Saúde e Condições Patológicas cerebral em humanos

Resumo

procedimentos de corte do cérebro organizados são necessários para correlacionar fenômenos neuropsiquiátricos específicos com diagnósticos neuropatológicos definitivas. estacas cerebrais são realizados de forma diferente com base em diversas contingências clínico-acadêmico. Este protocolo descreve um procedimento de corte cérebro bihemispheric simétrica para investigar diferenças hemisféricas de patologias do cérebro humano e maximizar as técnicas biomolecular / neuroimagem atuais e futuras.

Resumo

Neuropathologists, às vezes, se sentem intimidados pela quantidade de conhecimento necessário para gerar diagnósticos definitivos para os fenômenos neuropsiquiátricos complexas descritas nesses pacientes para os quais foi pedida uma autópsia cerebral. Embora os avanços das ciências biomédicas e de neuroimagem revolucionaram o campo neuropsiquiátrica, também têm gerado a idéia enganosa de que autópsias cerebrais têm apenas um valor de confirmação. Esta falsa idéia criada uma redução drástica das taxas de autópsia e, consequentemente, uma possibilidade reduzida de realizar investigações neuropatológicos mais detalhadas e extensas, que são necessários para compreender vários aspectos normais e patológicos ainda desconhecidas do cérebro humano. O método inferencial tradicional de correlação entre fenômenos neuropsiquiátricos observados e correspondente localização / caracterização de suas possíveis correlações neuro-histológicos continua a ter um valor inegável. No contexto da neuropsychidoenças atric, o método clínico-patológico tradicional ainda é a melhor metodologia possível (e muitas vezes o único disponível) para vincular recursos neuropsiquiátricos únicas para os seus substratos neuropatológicos correspondentes, uma vez que se baseia especificamente sobre a avaliação física direta de tecidos cerebrais. A avaliação dos cérebros post-mortem é baseado no cérebro procedimentos que variam entre os diferentes centros de neuropatologia corte. estacas do cérebro são realizadas de forma relativamente extensa e sistemática com base nas diversas contingências clínicos e acadêmicos presentes em cada instituição. A metodologia de corte cerebral bi-hemisférica anatomicamente mais inclusiva e simétrica deve pelo menos ser usada para fins de investigação na neuropatologia humana para investigar de forma coerente, em profundidade, as condições normais e patológicas com as peculiaridades do cérebro humano (ou seja, a especialização hemisférica e lateralização para específica funções). Um tal processo proporcionaria uma Colle mais abrangentecção de cérebros neurologicamente bem caracterizados disponíveis para técnicas biotecnológicas e de neuroimagem atuais e futuras. Nós descrevemos um procedimento de corte cerebral bi-hemisférica simétrica para a investigação das diferenças hemisféricas de patologias do cérebro humano e para uso com corrente, bem como técnicas biomolecular / neuroimagem futuras.

Introdução

Neuropathologists ter o privilégio científica, honra intelectual, e a obrigação de diagnóstico para avaliar os cérebros humanos. Por muitas décadas, descrições clínicas detalhadas de doenças cerebrais e grandes esforços para individualizar suas possíveis correlações neuro-histológicos em cérebros post-mortem humanos têm sido realizadas. Historicamente, esses esforços representou a modalidade mais produtiva através da qual as ciências médicas, e neurologia em particular, avançou na era moderna. Graças a neuropathologists anteriores eminentes e sua dedicação, determinação, bolsa de estudos, e espantosa capacidade de discriminar entre tecidos cerebrais normais e anormais (muitas vezes utilizando ferramentas muito rudimentares), agora podemos investigar e doenças-alvo, tais como a doença de Alzheimer-Perusini (injustamente chamados apenas a doença de Alzheimer doença; DPA / AD) ^1, doença de Parkinson (DP) ^{de 2,} doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) ^3, doença de Lou Gehrig-/ Esclerose lateral SCLEROSIs (ALS) ^4, e de Guam, doença ⁵ para mencionar alguns.

Técnicas avançadas de neuroimagem, como a alta definição tomografia computadorizada (ou seja, tomografia computadorizada espiral multisection; angio-TC), ressonância magnética funcional e morfológica (ou seja, fMRI, difusão-MRI, tractography-MRI, etc.), Positron Emission Tomography (PET), imagiologia à base de ultra-som, e outros, certamente modificado a nossa abordagem geral sobre como diagnosticar e curar pacientes neurológicos e psiquiátricos. No entanto, apesar de as técnicas de neuroimagiologia é capaz de visualizar o cérebro de uma pessoa quando vivo, elas não oferecem a oportunidade, no momento em que ocorre, para analisar directamente as estruturas celulares e subcelulares altamente complexas de células, tais como os neurónios; ou para visualizar, marca, e quantificar tipos específicos de lesões intracelulares; ou para indicar com precisão sua localização neuroanatômica ou sub-regional na circuital e sub-níveis anatômicos circuital. Por exemplo, técnicas de neuroimagiologia não pode identificar ou localizar o corpo de Lewy (LB) em neurónios pigmentados da substância negra (SN), uma característica patológica comum associado com PD, ou emaranhados neurofibrilares (NFT) no córtex entorrinal, uma característica clássica da doença de Alzheimer e outras patologias cerebrais. investigações neuropatológicos combinadas com microscopia digital avançada ainda são insubstituíveis para as correlações clinicopatológicas detalhados e, portanto, para diagnóstico definitivo.

Devido às propriedades peculiares anátomo-funcional do cérebro humano, e especialmente a sua localização anatómica (isto é, dentro do crânio, um sistema de protecção natural que não permite o exame directo do seu conteúdo), a introdução in vivo de técnicas de neuroimagiologia os clínicos e investigadores extraordinariamente ajudou a encontrar respostas iniciais a alguns dos mistérios deste tecido complexo. No entanto, não há nenhuma clínica ou neuroimagimetodologia ng que pode substituir a oportunidade única de analisar diretamente o tecido cerebral durante uma autópsia. Somente a coleção organizada, preservação e categorização dos cérebros humanos pode permitir que investigações diretas e sistemáticas de células neuronais e não neuronais, os seus constituintes subcelulares, intracelular e lesões patológicas extracelulares, e qualquer tipo de anormalidade dentro do cérebro para confirmar, modificar ou redefinir diagnósticos clínicos e descobrir novas correlações clínico-patológicas. Uma das limitações aparentes diz respeito à avaliação do cérebro na autópsia tem sido o facto de que este processo é uma metodologia em corte transversal. Haverá sempre um atraso entre um processo contínuo neuropatológico (clinicamente manifesta ou não) e a chance, se houver, para defini-lo no nível neuro-histológicos. Isto é principalmente devido à incapacidade do cérebro humano para se regenerar. No momento não é possível obter tecido cerebral in vivo sem criar pedanos rmanent. Por conseguinte, não é possível avaliar longitudinalmente e neuropatologicamente o mesmo cérebro / pessoa. No entanto, procedimentos bancários cérebro padronizados e uma maior sensibilização para a doação do cérebro entre o público geral poderia contribuir grandemente para a resolução de problemas de tempo de cérebro-autópsia, aumentando de forma consistente o número de casos de recolher e analisar. Desta forma, os números mais adequados de cérebro postmortem poderia ser obtida para definir padrões constantes de origem patológica e progressão para cada tipo específico de lesão cerebral associada com cada doença cérebro humano. Isto exigiria doação e recolha de tantos quanto possível cérebros de pacientes afectados por qualquer desordem neuropsiquiátrica, bem como a partir de indivíduos saudáveis ​​de controlo em todas as idades. Um método possível poderia estar a recolher tantos cérebros post-mortem possível de centros médicos gerais e especializados como uma rotina padrão. A necessidade de doações cerebrais foi expressa recentementepor aqueles que estudam a demência e envelhecimento normal ^6. A mesma necessidade deve ser expresso pelo campo neuropsiquiátricos como um todo.

Para o acima referido e por outras razões, uma actualização dos procedimentos de corte do cérebro em curso é necessário. Além disso, o cérebro procedimentos de corte deve ser universalmente padronizado entre os diferentes centros de pesquisa neuropatologia em todo o mundo, tendo também em conta a possibilidade de empregar técnicas biotecnológicas atuais e futuras para melhor investigar e, esperançosamente, para compreender de forma definitiva, as causas e mecanismos das doenças do cérebro em humanos.

Aqui, principalmente para fins de investigação, é descrita uma metodologia para simétrica cerebral postmortem de corte em seres humanos. Este procedimento propõe recolher regiões mais cerebral do que normalmente é feito e de ambos os hemisférios cerebrais e cerebelo. Um procedimento de corte cerebral bi-hemisférica simétrica vai caber muito melhor com nosso conhecimento atual do ser humanoneuroanatomia, neuroquímica e neurofisiologia. Este método também permite a possibilidade de analisar neuropathologically as características únicas do cérebro humano, tais como a especialização hemisférica e lateralização que estão associados com funções cognitivas e não-cognitivas superiores tipicamente ou exclusivamente presente em nossa espécie. Se existem relações patogênicos específicos entre hemisférica especialização / lateralização e tipos específicos de lesões cerebrais, ou se um evento patogênico neuropsiquiátrica peculiar é, inicialmente, predominantemente, ou exclusivamente associada a um hemisfério específico e função não é conhecido atualmente. Ao descrever este procedimento de corte cérebro simétrico, pretendemos propor um método atualizada de dissecção cérebro humano que poderia ajudar a entender melhor as condições normais e patológicos em um tecido altamente especializado, o cérebro. Este método também leva em consideração os aspectos hemisféricos morfo-funcionais que só existem em seres humanos.

Protocolo

Procedimentos envolvendo tecidos humanos pós-morte foram revistos pelo conselho de revisão institucional e isentos ao abrigo do 45 CFR (Code of Federal Regulations).

NOTA: O protocolo descreve um procedimento de corte cérebro bihemispheric simétrica para a avaliação postmortem cérebro finalizado para estudos neuropatológicos em seres humanos. As descrições detalhadas dos aparelhos, instrumentos, materiais e suprimentos necessários para executar o corte cérebro humano serão excluídos. Os materiais e suprimentos para dissecções cérebro são selecionados a critério do único investigador e são baseadas em ferramentas de autópsia permitidos ou autorizados em cada instituição de pesquisa. O conjunto mínimo de ferramentas e materiais necessários para este procedimento está descrito na Tabela de Materiais / Equipamentos. Procedimentos de corte específicos e precauções para suspeitos de doenças cerebrais transmissíveis, tais como CJD humana, estão fora dos objectivos deste manuscrito e estão disponíveis a partir de outras fontes ^7.

1. Symmetric BiCorte cerebral hemisférica

Nota: Assegurar que o cérebro recebeu a fixação do tecido necessária (utilizando, por exemplo, neutro tamponado a 10% de formalina) (isto é, pH), e tecido conservação durante um período de duas a três semanas, dependendo do periagonal, metabólico ( isto é, temperatura) condições. No entanto, para os estudos de correlação de imagem de patologia, um período mais longo de fixação (> 5,4 semanas) tem sido sugerido ^8.

1. Colocar o cérebro sobre uma superfície plana voltada para o investigador, com os postes frontais voltadas no sentido oposto em relação ao investigador.
2. Colocar o cérebro de tal modo a permitir uma visualização clara e completa de todos os giros cortical e sulcos do cérebro inteiro (Figura 1a).
3. Primeiro olhar para anomalias das meninges, as assimetrias hemisféricas macroscópicos (possíveis indicadores de focal, lobar ou fenômenos hemisféricas generalizadas de atrofia), lesões macroscópicas tissutal (ie, tumors ou hérnia), malformações congênitas, anomalias dos vasos, e quaisquer outras anormalidades possíveis ou apresentações incomuns da superfície cerebral.
   NOTA: Para obter descrições detalhadas sobre como avaliar um cérebro humano, referem-se comercialmente disponíveis livros neuropatologia e manuais de autópsia ^9,10.

2. Protocolo Sequence

1. Enfrentar pólos frontais longe do investigador, com os aspectos superficiais do hemisférios (telencéfalo) voltado para o investigador. Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macro-anomalias e ter em conta possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Ter um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para captar toda a superfície cortical (Figura 1a - c).
2. Mark pré e giros corticais pós-central usando tinta ou agulhas coloridas antes de cortar o cérebro (Figura 1b ).
   NOTA: Este procedimento facilita um reconhecimento mais imediato do motor e córtex somatossensorial primário após o corte.
3. Rodar o cérebro por 180 graus, mantendo-o virado para a mesma direcção (ou seja, os postes frontais voltadas para fora a partir do investigador). Verifique cuidadosamente a base do cérebro. Preste atenção especial às condições dos sistemas vasculares cerebrais (ou seja, artérias basilar e vertebrais e do polígono de Willis) e os nervos cranianos em seus níveis saída / entrada do tronco cerebral. Gerir os bulbos olfatórios e tratados com cuidado especial para evitar laceração tissutal, devido à sua extrema fragilidade.
   1. Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macro-anomalias e ter em conta possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Tem um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para capturar a totalidade das superfícies corticais e do tronco cerebral.
4. Voltado para a base do cérebro e, usando um bisturi, cortar o tronco cerebral transversalmente ao nível da parte superior da ponte (o mais perto possível para a base do cérebro). Verifique cuidadosamente a SN (ou seja, por palidez) ¹¹ e outras estruturas vizinhas ^12. Tome nota, possivelmente usando um dispositivo gravador de áudio, de qualquer aparência incomum do cérebro em comparação com um cérebro normal ^13.
5. Novamente rodar o cérebro por 180 graus e, usando uma faca afiada, separar os dois hemisférios, cortando o corpo caloso centralmente através da fenda longitudinal medial e seguindo uma direcção fronto-occipital. Inspecione cada lado de cada hemisfério para possíveis anomalias (por exemplo, ampliações ventriculares, malformações, amaciadores de tecidos, tumores, etc.) ^13. Veja a Figura 2-A.
   1. Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macro-anomalias epara contabilizar possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Tem um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para captar toda a superfície cortical. Tome nota de qualquer característica incomum do cérebro em comparação com um cérebro normal.
6. Colocar os dois hemisférios plana, encontrando-se os seus aspectos medial, com os lobos frontais de costas para o investigador, como mostrado na Figura 2b. Coloque-os de tal forma que os seus centros de tocar (também em caso de assimetria hemisférica marcada).
7. Usando uma faca afiada, corte manualmente através de ambos os hemisférios cerebrais, começando nos pólos frontais e movendo-se em direcção aos pólos occipitais através de todo o comprimento dos hemisférios. Obter duas séries de 1 cm de espessura blocos de tecido cerebral (cerca de 18 placas para cada hemisfério).
8. Colocar as placas cerebrais numa sequência organizada anatomicamente (direcção fronto-occipital) sobre uma superfície plana separada. Use um surfa brancoCE com uma régua impressa sobre ele para melhor contraste ao fotografar. Mostrar a duas séries de placas cerebrais de uma forma anatomicamente simétrica (direção fronto-occipital), certificando-se de que as suas superfícies coronais são visíveis para inspeção visual direto e fotografia digital (Figura 3a). Use superfícies de corte com grades milimétricos impressas em ambos os lados para localizar estruturas cerebrais, tamanhos e possíveis alterações de forma mais precisa.
   1. Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macro-anomalias e ter em conta possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Tem um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para captar toda a superfície cortical. Tomar notas (possivelmente através de um dispositivo gravador de áudio), de qualquer aspecto anormal do cérebro, em comparação com um cérebro normal.
9. Usando um bisturi afiado, dissecar manualmente blocos retangulares menores detecido cerebral para cada região cerebral estabelecido. Siga o programa de recolha região cerebral proposta descrita na Tabela 1.
   1. Coloque cada bloco de tecido em histocassettes marcadas separadamente.
      NOTA: Cada bloco de tecido cerebral tem de ser cortado para se ajustar, tanto quanto possível, o volume máximo histocassette padrão (30 x 20 x 4 ^mm3).
   2. Rotular os histocassettes usando um código de identificação de para cada caso e usando identificadores neuroanatómicos específicos (não use letras aleatórias ou números para diferentes cérebros, mas sim, usar sempre o mesmo regionais nomes anatômicos ou números correspondentes, como mostra a Tabela 1). Crie códigos de-identificação, por exemplo, através da geração de números aleatórios ou semi-aleatórios para cada caso (ou seja, BRC 130, onde B fica para o Cérebro, R permanece por Resource, C permanece por Center e 130 é uma adesão progressiva ou AD160001, onde AD significa "estudo da doença de Alzheimer", 16 é oano, quando a autópsia foi realizada (2016) e 0001 um número espécime adesão progressiva).
      NOTA: Este passo é muito útil para futuros pesquisadores; manter uma lenda, e especificar o hemisfério (L = hemisfério esquerdo, R = hemisfério direito). Use duas cores diferentes de histocassettes, estabelecendo uma cor específica para cada hemisfério.
   3. Tome-se como muitas fotos digitais como necessário em cada caso particular para documentar possíveis macroanomalies e ter em conta possíveis considerações clínico-neuroanatômica e pós-corte. Tem um assistente de pesquisa tirar fotografias digitais perpendicularmente ao cérebro para captar toda a superfície cortical. Tome nota de qualquer característica incomum do cérebro em comparação com um cérebro normal.
10. Tire fotos digitais (como muitos como necessário ou desejado) de todo o cérebro de corte e as histocassettes associados.
11. Punch (por exemplo, por Accu-punch) pequenos pedaços de tecido para a extração de DNA e análises genéticas. Usarum perfurador de 2 - 5 mm de diâmetro.
    NOTA: Para o seu elevado teor de material genómico, o cerebelo, é a escolha preferida; no entanto, qualquer outra região está bem.
12. Reimergir todos histocassettes contendo blocos de tecido cerebral no mesmo tipo de solução fixadora (por exemplo, 10% de formalina neutra tamponada) tal como anteriormente usado até que o próximo passo de processamento de tecidos.
13. Siga os procedimentos padrão para fixado em formol processamento de tecidos humanos ^14.

3. Uma abordagem especial: alternada Congelados e fixa corte Symmetric Bihemispheric

NOTA: O protocolo de corte cérebro bihemispheric simétrica descrito na seção 2 oferece a possibilidade de cortar lajes de tecidos de não fixadas, cérebros frescos (quando disponível) da mesma maneira sistemática e simétrica.

1. Coloque todo o cérebro fresco de cabeça para baixo (de preferência sobre uma superfície de plástico tigela-como semi-esférica) para 8-10 min de -80 ° C freezer para endurecer o tecido cerebral without provocando danos bioquímicos e facilitar o corte manual.
2. Usando uma faca afiada, corte ambos os hemisférios em um suplente e forma consecutiva, seguindo o protocolo de corte cérebro descrito na Seção 2, mas congelar e corrigir todas as outras placas (de ambos os hemisférios e ao longo de uma direção anatômica fronto-occipital).
   1. Neste ponto, não tentar cortar cada região cerebral, tal como descrito na Tabela 1. Corte regiões específicas do cérebro frescos somente se necessário para RNA imediato ou extração de proteínas (ou seja, para estudos genômicos ou proteômica) ^15.
3. Após o corte, congelar imediatamente, etiqueta e número cada tecido fresco. Tire fotos digitais de toda a série de placas; embalar cada placa em um único saco de plástico; recolher as lajes num recipiente separado, uma cérebro-only; e armazenar o recipiente num congelador a -80 ° C dedicado.
   NOTA: O congelador deve ser dedicado apenas a tecido cerebral humano. Só mais tarde vai cantarle regiões do cérebro congelado ser cortado, conforme necessário para cada experiência específica.
4. Mergulhe cada outra laje de tecido escolhido para a fixação (formol neutro tamponado a 10% ou outro fixador) em sacos separados contendo um volume suficiente de fixador (3/1 volume de proporção / tecido bloco fixador). Rotular cada saco por consecutivamente numerando-os a seguir uma sequência fronto-occipital. Selar cada saco, tirar fotos digitais e armazená-los em um recipiente de plástico.
5. Abrir os sacos contendo o agente de fixao depois de 2 semanas de fixação do tecido e cortar cada região cerebral, tal como descrito na Tabela 1.

4. Histostain e imuno-histoquímica

NOTA: O conjunto de regiões cerebrais corte com base no esquema proposto (Tabela 1) são suficientes para satisfazer os critérios patológicos a maioria, se não todos, baseados em consenso, actualmente fixado para ¹⁶ AD, PD ^17, Demência de Corpos de Lewy (DCL) ^18, A demência frontotemporal (DFT / DNM) ^{19, Progressive suprabulbares Cerebral (PSP) 20, Atrofia de Múltiplos Sistemas (MSA) 21, crônica traumática Encefalopatia (CTE) 22, etc.}

1. Para cada região do cérebro e para ambos os hemisférios, execute o seguinte conjunto mínimo de histostains: Hematoxilina e Eosina (H & E), violeta cresil (CV; se os estudos morfométricas quantitativas estão previstas, por exemplo), e coloração de prata (se análises "exploratórias" são necessário).
2. Para cada região do cérebro e para ambos os hemisférios, execute o seguinte conjunto mínimo de protocolos de imunohistoquímica: p amilóide (β A), fosforilada-Tau (pTau), fosforilada α-sinucleína (pα-sin), e fosforilada-TDP43 (pTDP43) , tal como descrito ^14.
   NOTA: O número total de cortes de tecidos, a fim de avaliar cada cérebro após este protocolo é de 46 (se todas as regiões cerebrais de ambos os hemisférios estão disponíveis).

Resultados

Protocolo Comprimento

O tempo gasto para um único procedimento de corte simétrica bihemispheric fixo cérebro é estimado em 1 h (excluindo o tempo gasto a criação de mesa de dissecação, ferramentas e cortar superfícies; rotulagem;. Etc). O tempo requerido para um único bi-alternada simétrica hemisférica cerebral congelado e fixado procedimento de corte é estimada em 2 h. Pode demorar pelo menos entre 4-6 semanas para obte...

Discussão

Este método de corte cerebral pode ser adaptada às necessidades específicas de cada laboratório neuropatologia (por exemplo, por redução do número de regiões cerebrais para avaliar, para cada hemisfério), mantendo o procedimento de corte simétricas bihemispheric como uma das suas características principais. Este protocolo proposto pode ser utilizado para procedimentos de rotina (centros neuropatológicos orientados para a pesquisa) ou apenas quando necessárias (estudos orientados clinicamente específicos). Ele pode ser u...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cópia do consentimento informado assinado permitindo autópsia e doação de cérebro para uso em pesquisa.
História clínica detalhada do sujeito, que deve incluir uma descrição detalhada de quaisquer sintomas e sinais neurológicos e psiquiátricos.
Gravações de vídeo médicas ou não médicas, quando disponíveis (especialmente úteis no campo dos distúrbios do movimento). Parente mais próximo s consentimento necessário.
Neuroimagem, neurofisiologia, neuropsiquiátrica e escalas de avaliação ou clínico-métricas.
Dados genéticos e de história familiar. Revisão de relatórios genéticos, se doenças neurogenéticas foram diagnosticadas.
Recipiente de histologia	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	64233-24
de histologia	VWR	18000-142 (laranja)
de histologia	VWR	18000-132 (navy)
Cabos de faca e lâminas descartáveis	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62560-04
Lâminas longas	MICROSCOPIA ELETRÓNICA SCIENCES	62561-20
Lâminas de Faca Descartáveis	MICROSCOPIA ELETRÔNICA SCIENCES	72040-08
Lâminas de bisturi	MICROSCOPIA ELETRÔNICA SCIENCES	72049-22
Accu-Punch 2 mm	MICROSCOPIA ELETRÔNICA SCIENCES	69038-02;
Recipientes de Poliestireno - Estéril	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	64240-12
Placa de Dissecção	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63307-30
Solução de formalina, tamponada neutra, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128 SIGMA
Hematoxylin Solution, Gill No. 2	Sigma-Aldrich	GHS280  SIGMA
Eosin Y solução, aquosa	Sigma-Aldrich	HT1102128  SIGMA
anti-beta-amilóide	Covance, Princeton, NJ	SIG-39220	1:500
anti-tau	Thermo Fisher Scientific	MN1020	1:500
anti-alfa-sinucleína	Abcam	ab27766	1:500
anti-fosfo-TDP43	Cosmo Bio Co.	TIP-PTD-P02	1:2000
Câmera Digital	Qualquer
Máquina de Selagem por Impulso de Cabeça	Grainger	5ZZ35