Artigo de método

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

DOI:

10.3791/54604

⸱

18 de novembro de 2016

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve uma metodologia de bioimpressão usando um sistema de depósito robótico automatizado que incorpora pistas de orientação topográfica gravadas com a deposição precisa de uma biotinta de hidrogel contendo células. As células impressas são entregues diretamente aos recursos gravados e são capazes de sentir e orientar com eles.

Resumo

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Este manuscrito descreve a introdução de características de orientação de células seguindo-se a entrega directa de células para estas funcionalidades de uma bioink hidrogel utilizando um sistema de distribuição robotizado e automatizado. O bioink particular foi selecionado como ele permite que as células para sedimentar direção e sentido os recursos. O sistema de distribuição bioprints células viáveis ​​em bioinks hidrogel usando uma cabeça de impressão de contrapressão assistida. No entanto, através da substituição da cabeça de impressão com um estilete ou bisturi afiado, o sistema de distribuição também pode ser empregada para criar pistas topográficas através de condicionamento de superfície. O movimento caneta pode ser programada em passos de 10 um nos sentidos de X, Y e Z. Os sulcos estampados foram capazes de orientar células-tronco mesenquimais, influenciando-os a adotar uma morfologia alongada em alinhamento com a direção dos sulcos. O padrão pode ser concebido usando o software de plotagem em linhas retas, círculos concêntricos, e ondas senoidais. Em um processo subsequente, fibroe blastos de células estaminais mesenquimais foram suspensos numa bioink gelatina a 2%, para bioprinting num cabeçote de extrusão accionado contrapressão. O bioink rolamento de células foi então impressa utilizando as mesmas coordenadas programadas utilizados para a decapagem. As células bioprinted foram capazes de detectar e reagir às características gravadas como demonstrado pela sua orientação alongada ao longo da direcção das ranhuras gravadas.

Introdução

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A padronização deliberada de posicionamento de célula permite a formação de culturas que imitam in vivo uma organização celular. Na verdade, a investigação sobre a interacção entre vários tipos de células pode ser assistido por organizar a sua 2,3 colocação espacial. A maioria dos sistemas de padrões dependem de procedimentos de modificação de superfície para promover ou prevenir a adesão celular com a deposição de células passiva subseqüente. Bioprinting oferece controle espacial e temporal sobre distribuições de células 1. Além destas funções, bioprinting foi descrito como sendo um método tecnicamente simples, rápido e de baixo custo para a geração de andaimes geometricamente complexas 4. Ele utiliza software de design de computador e permite a introdução de células para o processo de fabricação 4.

Sistemas bioprinting foram classificados com base em seus princípios de trabalho como laser baseados, à base de jato de tinta ou extrusão baseados em 4. Extrusão bioprinting foi descrito como o mais promissor, uma vez que permite a fabricação de construções organizados de tamanhos clinicamente relevantes dentro de um período de tempo realista 4-6. É realizada por qualquer pressão mecânica ou para trás extrusão assistida de um hidrogel bioink rolamento celular. No método aqui apresentado, foi empregue a pressão de retorno. Como mencionado, as células são entregues em um bioink cytocompatible. Tal bioink deve suportar a entrega de células sem produzir esforço de corte deletério, e ser de uma viscosidade suficiente para manter a integridade do traço impressa, sem entrar em colapso ou espalhamento (referido como "tinta de sangria") 7-10.

A interacção das células com a superfície aderente é conhecido para influenciar o comportamento celular. A topografia da superfície pode controlar a forma das células, orientação 11, e ainda o fenótipo. Em particular, a fabricação de sulcos e canais têm demonstrado induzirum esticado, morfologia alongada em vários tipos de células. A adopção desta morfologia foi encontrado para influenciar o fenótipo de células multipotentes e pluripotentes. Por exemplo, quando alinhadas em ranhuras, as células estaminais mesenquimais (MSC) mostram evidências de diferenciação em direcção cardiomiócitos 12,13 e células musculares lisas vasculares adoptar o fenótipo contráctil sobre o sintética 10,14-17.

A célula alinhando canais ou ranhuras pode ser gerado numa superfície polimérica por meio de uma série de métodos, por exemplo, gravação iónica reactivo profundo, litografia de feixe de electrões, impressão a laser directo, femtosecond laser, fotolitografia e ataque químico de plasma seco 18. Estas abordagens são frequentemente demorados, exigem aparelhos complexos e podem ser limitante na forma do padrão gerado. Além disso, eles não sincronizar padronização com bioprinting e não permitem celularização imediata. O movimento coordenado controlada de um automatizadoSistema de distribuição pode seguir padrões complexos para a deposição de soluções. Aqui demonstramos como o movimento controlado por microescala pode ser aproveitada para criar canais para orientação de células. Uma caneta ou bisturi afiada está ligado à cabeça de impressão em lugar da seringa e o equipamento de extrusão pode, em seguida, gravar a superfície de polímero sob a orientação do software trama. O método oferece uma versatilidade na concepção padrão e é aplicável a materiais poliméricos normalmente usados ​​em bioengenharia, tais como poliestireno, de PTFE, e policaprolactona. Como um passo subsequente para a decapagem, as células podem ser bioprinted directamente aos sulcos riscados. O bioink gelatina utilizada aqui foi capaz de manter tanto o traço e permitir que as células depositadas para detectar as características gravadas. As células estaminais mesenquimais bioprinted aos sulcos gravados foram demonstrados para alongar ao longo delas em linhas distintas.

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Protocolo

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NOTA: Este protocolo descreve a utilização de uma contra-pressão assistida sistema de distribuição robótico (Figura 1A) como uma superfície de gravação (Figura 1B) e bioprinter à base de extrusão (Figura 1C) 10.

1. Alteração de uma superfície de poliestireno

  1. Use 1 folhas mm de poliestireno desde placas de cultura de tecidos de poliestireno tendem a se curvar para cima no centro, arruinando a consistência altura de ambos gravura e impressão.
    NOTA: Como as folhas de poliestireno não são modificados para a adesão celular, o tratamento de plasma é realizado.
  2. Oxigénio tratamento com plasma.
    1. Primeiro, selecione uma pressão de 2 bar no regulador do cilindro de oxigênio acoplado à máquina de plasma. Em seguida, desligar a máquina de plasma e a entrada das seguintes condições para o painel de controlo do equipamento: 150 W, 30 sscm de oxigênio, 10 min (para o poder, o fluxo de gás e tempo respectivamente).
    2. Coloque o substrat poliestirenode e para a câmara de plasma, selar a porta e pressione o botão Iniciar no painel de controle. Embeber o plasma de oxigénio substrato de poliestireno tratado em soro fetal bovino e incubar a 37 ° C durante 2 h antes de lavar três vezes com fosfato 1x solução salina tamponada (PBS).

2. Padrões de programação de impressão

  1. Usar o Programa para a Primeira Etch a superfície com um estilete ou bisturi.
    1. Quando se utiliza um estilete, inserir uma agulha têxtil diâmetro de 1,5 mm (a partir do interior com grande cuidado) para dentro do bocal de uma seringa de distribuição (5 ou 10 ml) até que se torne em cunha e protegidas. Se usando um bisturi, escolher um bisturi rodada manipulados de modo que pode ser fixado no mecanismo de fixação do braço de impressão.
      NOTA: A caneta grava padrões curvos melhor do que a lâmina de bisturi.
    2. Quando a primeira tentativa de criar um arranjo bioprinted, esboçar o padrão desejado no papel de gráfico com eixos numerados para gerar as coordenadas XY. Então eunput as coordenadas gravado padrão / bioprinted para o software de planilhas (Figura 2).
      NOTA: O "padrão desejado" pode ser em muitas formas, tais como linear, em forma de S, ou circular. A escolha depende do modelo experimental necessária, como linear linhas paralelas para a diferenciação das MSCs para cardiomiócitos, como demonstrado aqui. A função de gráfico de dispersão permite a visualização do padrão enredo proposto.
    3. Abra o / software de distribuição de impressão. Selecione "Programa> Adicionar programa" seguido de "Editar> Adicionar ponto" para configurar o programa. Exportar o x e y valores de coordenadas obtidas a partir da folha de cálculo para a impressão / distribuição de software usando o "Copiar e colar" a função.
    4. Calibrar a altura de "z" do robô antes de cada execução, a fim de colocar o bico stylus / impressão sobre a superfície.
      1. Na cópia do software / distribuição, selecione a opção "Robot", clique em "Alterar Modo &# 34; e habilitar a opção "Modo de Ensino". Uma vez selecionado, o software permite a função "Jog" do robô.
      2. Para correr, primeiro inicializar o robô para sua posição padrão, selecionando os seguintes comandos a partir da barra de menu; "Robot> Meca Inicializar" e selecione "Robot> Jog". Introduzir os valores numéricos (em mm) no "slots de X e Y" necessários para colocar a caneta exactamente sobre a origem do padrão.
      3. Em seguida, a entrada de um valor numérico (em mm) no "slot de Z" para colocar o bico de caneta ou impressão em contato com a superfície, mas não flexível ou recuar a superfície. Este ponto é designado como "Z" valor de partida.
        NOTA: A profundidade de cada ranhura podem ser variadas facilmente utilizando o Z-altura do sistema. As ranhuras de 40, 80, e 170 ^ M são demonstrados para cortar a superfície de 1 mm de espessura folhas de poliestireno (Figura 4 e Tabela 1).
    5. Selecione o pinstruções rint para cada um dos pontos coordenados, ou seja, "o início da linha Dispensar" para definir o primeiro ponto eo início de impressão, "Linha de Passe" para designar os pontos intermédios e "Fim da Linha Dispensar" para sinalizar para o robô para terminar a Tiragem.
    6. Comunique-se o programa para o robô, selecionando os comandos acompanhamento a partir da barra de menu superior: "Robot> Enviar C & T de dados".
    7. Iniciado o condicionamento run / impressão, alterando o robô para o modo "Run". Faça isso selecionando "Robot> Modo Mudando> Transferir o modo Run" na barra de menu superior.
    8. Iniciar o procedimento de impressão, premindo o botão "start" verde na consola dispensador robô.

3. Preparação e Impressão de Gelatina Bioink contendo celular

  1. Dissolve-se 2% de gelatina em Meio Mínimo Essencial alfa Médio (aMEM) (suplementado com 10% de FBS e 2% de antibiótico / antimycotIC) a 60 ° C durante 2 horas para preparar as soluções bioink.
  2. Pré-cultura da proteína vermelha fluorescente expressando células-tronco mesenquimais (RFP-MSCs) a 70% de confluência em 10 cm placas de cultura de tecido, utilizando aMEM / 10% FBS. Libertar as células ligadas em suspensão por remoção do meio de revestimento e com uma solução de tripsina-EDTA 1x durante 5 min a 37 ° C.
  3. Agregar as células por centrifugação a 1000 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 0,5 mL de PBS 1x e contar a densidade de células utilizando um hemocitómetro.
  4. Depois de deixar a bioink arrefecer até à temperatura ambiente, misturar suavemente num volume suficiente para a suspensão de RFP-MSCs no bioink para atingir uma concentração final de 5 x 10 6 mL -1 células.
  5. Verter a bioink rolamento de células dentro de uma seringa de impressão com o bocal fechado. Arrefecer a seringa carregada a 4 ° C a fim de atingir uma viscosidade de impressão.
  6. Colocar a seringa carregada no automatizadosistema de distribuição de robótica e anexar as linhas de pressão de ar. Retire a seringa Luer selo e anexar o bocal de impressão.
  7. Faça a extrusão do bioinks celularizados em linhas finas usando 0,05 MPa pressão de retorno, a 5 mm / seg velocidade de escrita a partir de uma seringa de 10 ml através de um 27 G agulha / bico (afuniladas recomendado sobre cilíndrica) sobre uma superfície de película de poliestireno, após a deposição pré-programado padrão descrito no passo 2.1 a colocar o bioink celularizado para as ranhuras pré-gravadas.
  8. Após incubação de 1 h à temperatura ambiente, adicionam-se 10 ml de meio de crescimento (suplementado com 10% FBS e antibióticos) e incuba-se as células durante 24 h (para permitir que as células para detectar e reagir às características gravadas) antes da visualização usando um microscópio de fluorescência invertido a 10X de ampliação.

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Resultados

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Os resultados representativos demonstram que o sistema de dispensa robótico contrapressão assistida pode ser usado como um bioprinter à base de extrusão para a realização de ambos gravura e impressão bioink superfície (Figura 1 A). Ele pode ser usado para a geração de ranhuras gravadas em superfícies de polímeros, e, subsequentemente, para imprimir uma bioink rolamento célula directamente para as características (Figura 1 B e C).

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Discussão

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O passo crítico deste procedimento é a entrega bioprinting efectiva das células estaminais enquanto o processo deve permitir a sedimentação de células para as características, de impressão sem bioink espalhando / hemorragia, proporcionam células sem morte celular tensão de cisalhamento e não desencadeiam a diferenciação no sentido linhagem indesejado.

Se o alinhamento de células esperado não ocorrer, então a viscosidade bioink deve ser avaliado quanto à sua aptidão para a impressão. É import...

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Divulgações

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Os autores declaram não ter interesse financeiro conflitante.

Agradecimentos

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O trabalho apresentado aqui é apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa de Cingapura no âmbito do programa CREATE (NRF-Technion): A Iniciativa de Medicina Regenerativa no Programa de Pesquisa em Terapia de Restauração Cardíaca e pelo Financiamento do Setor Público (PSF) 2012 do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERC) sob a Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipment
Sistema de Distribuição RobóticaJanome2300N
Máquinade Plasma Femto ScienceCovance
Microscópio
Microscópio ÓpticoOlympusIX71
Nome EmpresaNúmero de catálogoComentários
Software
SpreadsheetExcelExcel
Software de Coordenadas de ImpressãoJanomeJR C-Points
Softwarede Imagem National Institutes of Health (NIH)ImageJ
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Stylus (Lâmina)OLFAAK-5
Seringa de impressão de 5 mlSan-ei TechSH10LL-B
30 G agulha de impressãoSan-ei TechSH30-0.25-B
1 mm folhasComprado localmente
Soro fetal bovinoInvitrogen 10270-098
Gelatina salina Tamponada com fosfatoInvitrogen
de pele suína, força do gel 300, Tipo ASigma Aldrich9000-70-8
α MEMInvitrogen41061-029
Antibiotc antimicóticoSigma AldrichA5955-100ML
Células-tronco mesenquimais de proteína fluorescente vermelha (RFP-MSCs)Cyagen Biosciences IncorporaçãoRASMX-01201
USB de poliestireno

Referências

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