genotipagem de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

Resumo

Aqui, o espaçador ribossômico PCR (RS-PCR) é usado em conjunto com um sistema de eletroforese miniaturizado como um método rápido e de alta resolução para genotipagem de S. aureus a custos moderados, permitindo um alto rendimento.

Resumo

A PCR espaçadora ribossômica (RS-PCR) é um método de genotipagem altamente resolutivo e robusto para S. aureus que permite um alto rendimento a custos moderados e, portanto, é adequado para ser usado para fins rotineiros. Para melhor resolução, avaliação e gerenciamento de dados, é necessário um sistema de eletroforese miniaturizado. Juntamente com esse sistema de eletroforese e o software desenvolvido internamente (disponível gratuitamente aqui), a atribuição do padrão de bandas a um genótipo é padronizada e direta. A extração de DNA é simples (preparação de ebulição), a configuração das reações é fácil e elas podem ser executadas em qualquer máquina de PCR padrão. A ciclagem de PCR é comum, exceto tempos prolongados de rampa e alongamento. Em comparação com a tipagem spa e a tipagem de sequência multilocus (MLST), o RS-PCR não requer sequenciamento de DNA, o que simplifica consideravelmente a análise e permite um alto rendimento. Além disso, a resolução para cepas bovinas de S. aureus é pelo menos tão boa quanto a tipagem spa e melhor do que MLST ou eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). O banco de dados RS-PCR inclui atualmente um total de 141 genótipos e variantes. O método está altamente associado ao padrão genético de virulência, contagiosidade e patogenicidade de cepas de S. aureus envolvidas na mastite bovina. O genótipo B de S. aureus (GTB) é contagioso e causa problemas nos rebanhos, causando grandes custos na Suíça e em outros países europeus. Todos os outros genótipos observados na Suíça infectam vacas e quartos individuais. A genotipagem por RS-PCR permite a previsão confiável do potencial epidemiológico e patogênico de S. aureus envolvido na infecção intramamária bovina (IMI), dois fatores-chave para a medicina clínica veterinária. Devido a essas propriedades benéficas, juntamente com custos moderados e um alto rendimento de amostras, o objetivo desta publicação é fornecer um protocolo detalhado e passo a passo para estabelecer e executar facilmente RS-PCR para genotipagem de S. aureus em outros laboratórios.

Introdução

Staphylococcus (S. aureus) é conhecido como o mais importante agente patogénico responsável a nível mundial para a infecção intramamária (IMI) em bovinos ^1. O estudo realizado por Fournier et al. ² demonstraram em vacas suíças e os estudos por Cosandey et al. ³ e Boss et al. ^4, em vacas de 12 países europeus que S. aureus isolados de bovinos IMI é um grupo geneticamente heterogénea. Por amplificação por PCR de rRNA 16S-23S região espaçadora de intergénica (RS-PCR), um total de 17 genótipos foram inicialmente detectados em 101 isolados independentes epidemiologicamente

Protocolo

1. Staphylococcus aureus

1. Espalhe 10 ul de S. aureus cultura de reserva ou uma colónia crescida em meio selectivo em placas de agar de Columbia contendo 5% de sangue de carneiro (BA).
2. Incubar aerobicamente a 37 ° C durante 18 h a 24 h.

2. Extração de DNA

1. Preparar tampão TEL contendo Tris-HCl 10 mM e 10 mM de Na ₂ EDTA, pH 8,5. Preparar alíquotas e autoclave a 121 ° C durante 15 min.
2. Recolha 1 colónia da BA usando uma ansa estéril de plástico ou um palito de madeira estéril e ressuspender em 100 mL TEL. Use tubos de 1,5 ml com tampas de rosca.
3. In....

Resultados

Definição de um genótipo e suas variantes

Um perfil electroforético que difira em mais do que uma banda de todos os genótipos identificados é considerado como um novo genótipo. Novos genótipos são nomeados e ampliado de acordo com a Fournier et al. ⁵ levando aos genótipos GTA a GTZ, seguido pelos genótipos GTAA para GTAZ e GTBA para GTBZ e GTCA para GTCC no presente. Variação em apenas uma faixa é considera.......

Discussão

O passo mais importante de todo o processo é quando há um excesso de ADN de RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensaio puro) ^2. Em geral, a resolução de um perfil é ideal se todos os seus picos de começar e terminar na linha de base. Se dois picos são muito próximos, a resolução é incompleto. Sob estas condições, o software Bioanalyzer inadequado pode levar ao pico de identificação de modo a que é requerida uma identificação manual.

Todos os picos visivelmente separadas e relevantes expre.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tris (hidroximetil) -aminometano	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g / mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g / mol; A substância é equivalente a Na2EDTA· 2H2O
Ácido clorídrico 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Ágar Columbia+5% de sangue de ovelha	bioMé rieux	43049
Kit de DNA7500 Agilent	Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 software especialista	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'