genotipagem de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

Resumo

Aqui, o espaçador ribossômico PCR (RS-PCR) é usado em conjunto com um sistema de eletroforese miniaturizado como um método rápido e de alta resolução para genotipagem de S. aureus a custos moderados, permitindo um alto rendimento.

Resumo

A PCR espaçadora ribossômica (RS-PCR) é um método de genotipagem altamente resolutivo e robusto para S. aureus que permite um alto rendimento a custos moderados e, portanto, é adequado para ser usado para fins rotineiros. Para melhor resolução, avaliação e gerenciamento de dados, é necessário um sistema de eletroforese miniaturizado. Juntamente com esse sistema de eletroforese e o software desenvolvido internamente (disponível gratuitamente aqui), a atribuição do padrão de bandas a um genótipo é padronizada e direta. A extração de DNA é simples (preparação de ebulição), a configuração das reações é fácil e elas podem ser executadas em qualquer máquina de PCR padrão. A ciclagem de PCR é comum, exceto tempos prolongados de rampa e alongamento. Em comparação com a tipagem spa e a tipagem de sequência multilocus (MLST), o RS-PCR não requer sequenciamento de DNA, o que simplifica consideravelmente a análise e permite um alto rendimento. Além disso, a resolução para cepas bovinas de S. aureus é pelo menos tão boa quanto a tipagem spa e melhor do que MLST ou eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). O banco de dados RS-PCR inclui atualmente um total de 141 genótipos e variantes. O método está altamente associado ao padrão genético de virulência, contagiosidade e patogenicidade de cepas de S. aureus envolvidas na mastite bovina. O genótipo B de S. aureus (GTB) é contagioso e causa problemas nos rebanhos, causando grandes custos na Suíça e em outros países europeus. Todos os outros genótipos observados na Suíça infectam vacas e quartos individuais. A genotipagem por RS-PCR permite a previsão confiável do potencial epidemiológico e patogênico de S. aureus envolvido na infecção intramamária bovina (IMI), dois fatores-chave para a medicina clínica veterinária. Devido a essas propriedades benéficas, juntamente com custos moderados e um alto rendimento de amostras, o objetivo desta publicação é fornecer um protocolo detalhado e passo a passo para estabelecer e executar facilmente RS-PCR para genotipagem de S. aureus em outros laboratórios.

Introdução

Staphylococcus (S. aureus) é conhecido como o mais importante agente patogénico responsável a nível mundial para a infecção intramamária (IMI) em bovinos ^1. O estudo realizado por Fournier et al. ² demonstraram em vacas suíças e os estudos por Cosandey et al. ³ e Boss et al. ^4, em vacas de 12 países europeus que S. aureus isolados de bovinos IMI é um grupo geneticamente heterogénea. Por amplificação por PCR de rRNA 16S-23S região espaçadora de intergénica (RS-PCR), um total de 17 genótipos foram inicialmente detectados em 101 isolados independentes epidemiologicamente ^2. Genótipo B eo genótipo C (GTC) eram mais comuns (80%), enquanto os outros 15 genótipos (GTs) ocorreram raramente, cada um fazendo 1 a 4% de todos os isolados. A nível europeu ^3, GTB, GTC, GTF, GTI e GTR foram os genótipos mais importantes que compreendem 76% de todas as cepas analisadas (n = 456). GTB estava situada na Europa Central whereas os outros genótipos foram amplamente divulgados. Os restantes 24% das cepas incluiu 41 genótipos, muitos deles, no entanto, foram observados apenas uma vez.

Os estudos por Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ^3, e Graber et ai. ⁵ ainda demonstrado que os genótipos foram altamente associado com o seu padrão de gene de virulência, bem como no Swiss como a nível europeu. Os estudos revelaram ainda grandes diferenças na prevalência do IMI entre S. aureus GTB, GTC e os outros genótipos de ^2,5: Considerando GTB, até 87% das vacas em um rebanho foram infectados por esse genótipo. No caso de GTC e de outros genótipos, no entanto, o IMI foi encontrado apenas em 1 a 2 vacas de uma manada.

IMI causada por S. aureus, normalmente resulta em inflamação das glândulas mamárias correspondentes e um aumento de células inflamatórias no leite. Como consequência, a co células somáticasunts no leite (SCC), o principal indicador da qualidade do leite na maioria dos países, é aumentada levando a um preço de leite diminuída ou até mesmo parar de entrega.

Além do RS-PCR de Fournier et ai. ^2, outros métodos de tipagem foram descritas para subtipar estirpes de S. bovina aureus ^8-11. Dois dos mais comuns incluem spa digitação ¹² e multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. O primeiro é baseado em sequenciação de ADN da região variável de espaçador do gene que codifica para a proteína Termas de estafilococos A, enquanto que o segundo exige uma sequenciação de 7 genes housekeeping. Isto significa que um e sete ¹² PCRs ^13, respectivamente, têm de ser realizada, seguido por purificação amplicão, reacção de sequenciação e análise utilizando equipamento específico. Em comparação com RS-PCR, estes métodos requerem um considerável esforço adicional no laboratório resultando num rendimento de amostras de baixo e custos elevados. othroughput é particularmente baixa para PFGE. Considerando a resolução destes métodos para as estirpes da espécie bovina de S. aureus, RS-PCR é pelo menos tão boa como spa digitando ⁴ e melhor do que MLST ⁴ ou ¹⁵ PFGE.

Todos estes métodos, incluindo digitação binário ¹³ demonstraram a sua eficácia na obtenção de mais conhecimento sobre a patogênese da bovina IMI causada por S. aureus, mas por causa das restrições mencionadas são menos apropriada para grandes investigações clínicas. Além disso, a genotipagem pela RS-PCR como descrito por Fournier et al. ² permite a previsão fiável do epidemiológica e o potencial patogênico de S. aureus envolvido no IMI bovina, dois valores-chave na medicina veterinária clínica.

Protocolo

1. Staphylococcus aureus

1. Espalhe 10 ul de S. aureus cultura de reserva ou uma colónia crescida em meio selectivo em placas de agar de Columbia contendo 5% de sangue de carneiro (BA).
2. Incubar aerobicamente a 37 ° C durante 18 h a 24 h.

2. Extração de DNA

1. Preparar tampão TEL contendo Tris-HCl 10 mM e 10 mM de Na ₂ EDTA, pH 8,5. Preparar alíquotas e autoclave a 121 ° C durante 15 min.
2. Recolha 1 colónia da BA usando uma ansa estéril de plástico ou um palito de madeira estéril e ressuspender em 100 mL TEL. Use tubos de 1,5 ml com tampas de rosca.
3. Incubar a 95 ° C durante 10 min. Em seguida, coloque as amostras imediatamente em gelo molhado.
4. Dilui-se as amostras 1: 100 em _H2O adequado para PCR (= ADN molde para PCR). As amostras não diluídas e diluídas podem ser mantidos à temperatura de -20 ° C durante 1 mês.

3. RS-PCR

1. para cada pipeta de amostra para um tubo de PCR de 1,5 ul de _H2O, 12,5 uL de Taq Master Mix, 2 ul de iniciador G1 10? M, 2 ul de L1 iniciador 10 uM, e 7 ul de molde de ADN que corresponde a cerca de 30 ng de puro DNA ^2.
2. Executar o seguinte programa de ciclos num ciclizador PCR padrão: 15 min 95 ° C, seguido por 27 ciclos que compreendem 94 ° C durante 1 min, seguido de uma rampa de 2 minutos e hibridação a 55 ° C durante 7 min. Após mais 2 min rampa, estender a 72 ° C durante 2 min. Terminar PCR por uma extensão final a 72 ° C durante 10 minutos, seguido por arrefecimento a 4 ° C.
   NOTA: Os produtos de PCR podem ser armazenadas a -20 ° C durante 5 dias.
3. Para cada passagem de RS-PCR incluem um controlo positivo, ou seja, uma amostra com um genótipo conhecido (normalmente GTB), e um controlo negativo _(H2O).

4. Eletroforese

1. Use um kit de eletroforese miniaturizado comercial para DNA (kit MED) em conjuntocom um Bioanalyzer conectado a um PC eo software instalado. Estudar os manuais correspondentes do fabricante com cuidado.
2. Configurar a estação de priming de chips e ajustar o clipe de seringa de acordo com o manual do fabricante.
3. Preparar a mistura de gel de corante-de acordo com o manual do fabricante.
4. Carregando o mix gel-dye (de acordo com o manual do fabricante).
   1. Equilibrar a mistura de gel de corante-à TA durante 30 min antes da utilização.
   2. Coloque novo chip de ADN na estação de chip de priming. Pipeta 9 jul de gel-dye na G. bem marcado
   3. Certifique-se de que o êmbolo está posicionado em 1 ml e depois fechar a estação de chip de priming. Pressione o êmbolo até que seja preso pelo clipe seringa. Espere exatamente durante 30 segundos, em seguida, solte o clipe seringa.
   4. Espere por 5 seg. Puxe lentamente o êmbolo para 1 ml posição.
   5. Abrir chip de estação de priming e pipeta 9 jul de gel-dye em ambos os poços marcados 'G'.
5. Carregando o Marker
   1. Pipetar 5 ul de marcador em todos os 12 poços de amostra e na escada bem. Não deixe qualquer um destes 13 poços vazios.
6. Carregando a escada e as amostras.
   1. Pipeta de 1 ml de escada de DNA para o bem-marcados com o sinal escada.
   2. Pipetar 1 mL da amostra (poços utilizados) ou 1 ul de água desionizada (poços) não utilizados.
   3. Colocar o chip horizontalmente no adaptador e vortex durante 1 min a 2400 rpm.
   4. Executar o chip no Bioanalyzer dentro de 5 min.
7. Execução da análise
   1. Comece o Bioanalyzer eo computador conectado. Abra o software.
   2. Abra a tampa do Bioanalyzer e colocar o chip no suporte do chip (o chip se encaixa apenas um caminho). Feche a tampa com cuidado.
   3. No contexto Instrumento do software selecione "Eletroforese"> "dsDNA"> "DNA 7500". Aceitar o prefixo do arquivo atual do software ou modificá-lo.
   4. Clique no botão Iniciar presente no software. Digite os nomes de amostra no software. Quando o chip de execução é concluída (após cerca de 30 min) o Fim do Run mensagem aparece no software Bioanalyzer.
   5. Remover o chip e limpar os eléctrodos do Bioanalyzer de acordo com as instruções do fabricante.

5. inferir o genótipo do perfil Eletroforese

1. Carregue o software Mahal (software está disponível gratuitamente a partir dos autores).
2. dados de referência importação para o software Mahal: "Arquivo"> ​​"Importar Dados de Referência"
3. Abra o eletroforese executado no contexto de dados do software Bioanalyzer. Selecione um perfil de electroforese de uma amostra.
4. Verifique se os picos relevantes.
   1. Use o software Mahal para verificar se os picos relevantes: "Ferramentas"> "Média de Fluorescência". Insira na caixa "fluorescência"os valores de fluorescência indicado como unidades de fluorescência (UF), tal como eles podem ser lidos a partir do software Bioanalyzer. Insira as (3) picos 4 com a maior fluorescência em ordem crescente e separados por vírgulas. Exemplo: 126.130.132.137.
      NOTA: Se nem todos estes picos FU são indicados pelo software Bioanalyzer, eles precisam ser estimada por lê-los para fora da trama.
5. Pressione o botão "Calcular". Um pico é relevante se a fluorescência observado exceder o valor dado na caixa "Minimal altura de pico".
6. Inferir o genótipo.
   1. Inserir na caixa de texto Mahal "Picos de entrada (pb)" os tamanhos em bp de todos os picos relevantes em ordem crescente e separados por vírgulas. Exemplo: 440.462.519.579.637.
      NOTA: Se nem todos esses tamanhos de pico são indicados pelo software Bioanalyzer, eles precisam ser estimada por lê-los para fora da trama.
7. Pressione o botão "Calcular".
8. Na listacaixa de, procure o mínimo quadrado distância de Mahalanobis "D2M". Se o valor P correspondente direito a ela é ≥0.05 então a probabilidade é ≥5% que a hipótese nula H ₀ é rejeitada (H _0: o observado e os contornos de referência são idênticos) o que significa que o perfil observado é aceito para ser idêntico ao o perfil de referência do genótipo indicada.
9. Se D2M é mínima, mas o campo do valor de P correspondente está vazia, rejeitar H ₀ com uma probabilidade de <5%.
   Nota: Isto significa que os perfis são desiguais embora D2M é mínima. Tal resultado pode resultar de condições não-médias electroforese.
   1. Para corrigir estes desvios, insira na caixa de texto "Observado Peak (pb)" o valor 395 e pressione o botão "Calcular". Verifique novamente por D2M mínimo e um ≥0.05 valor P correspondente. Se não funcionar, tente os valores 405, 415 e 425.
      Nota: Às vezes pequenos passos são aindaindicado. Se ainda não tiver êxito, o perfil observado não está presente nos dados de referência, que pode ser um novo genótipo ou variante.
10. vários perfis
    1. Repita os passos de 5,6-5,9 para cada perfil de electroforese em separado.

Resultados

Definição de um genótipo e suas variantes

Um perfil electroforético que difira em mais do que uma banda de todos os genótipos identificados é considerado como um novo genótipo. Novos genótipos são nomeados e ampliado de acordo com a Fournier et al. ⁵ levando aos genótipos GTA a GTZ, seguido pelos genótipos GTAA para GTAZ e GTBA para GTBZ e GTCA para GTCC no presente. Variação em apenas uma faixa é considera...

Discussão

O passo mais importante de todo o processo é quando há um excesso de ADN de RS-PCR (> 30 ng de ADN / ensaio puro) ^2. Em geral, a resolução de um perfil é ideal se todos os seus picos de começar e terminar na linha de base. Se dois picos são muito próximos, a resolução é incompleto. Sob estas condições, o software Bioanalyzer inadequado pode levar ao pico de identificação de modo a que é requerida uma identificação manual.

Todos os picos visivelmente separadas e relevantes expre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tris (hidroximetil) -aminometano	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g / mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g / mol; A substância é equivalente a Na2EDTA· 2H2O
Ácido clorídrico 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Ágar Columbia+5% de sangue de ovelha	bioMé rieux	43049
Kit de DNA7500 Agilent	Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 software especialista	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Primer
G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'